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葡萄‘优无核’试管苗的多倍体诱导

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葡萄‘优无核’试管苗的多倍体诱导葡萄‘优无核’试管苗的多倍体诱导 葡萄‘优无核’试管苗的多倍体诱导 2010年4月 第2期58~62 甘肃农业大学 JOURNALOFGANSUAGRICUITURALUNIVERSITY 第45卷 双月刊 葡萄'优无核,试管苗的多倍体诱导 集贤,常永义,李文瑾,曹丽艳,曹刚 (甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070) 摘要:以'优无核'葡萄组培苗为材料,研究了不同质量浓度秋水仙素不同时间处理 培养基培养法, 下,浸泡法, 腋芽吸收法对葡萄试管苗不同芽位染色体加倍的影响.结果表明:浸泡法以M代染...

葡萄‘优无核’试管苗的多倍体诱导
葡萄‘优无核’试管苗的多倍体诱导 葡萄‘优无核’试管苗的多倍体诱导 2010年4月 第2期58~62 甘肃农业大学 JOURNALOFGANSUAGRICUITURALUNIVERSITY 第45卷 双月刊 葡萄'优无核,试管苗的多倍体诱导 集贤,常永义,李文瑾,曹丽艳,曹刚 (甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070) 摘要:以'优无核'葡萄组培苗为材料,研究了不同质量浓度秋水仙素不同时间处理 培养基培养法, 下,浸泡法, 腋芽吸收法对葡萄试管苗不同芽位染色体加倍的影响.结果表明:浸泡法以M代染色体加倍率最高,其中,48h 处理染色体加倍株率高达34.98;培养基培养法处理6d诱变效果最好,加倍率最高为23.63;腋芽吸收法处 理4d加倍率最高为22.98.秋水仙素溶液质量浓度越大,加倍率越高,死亡率也越高,其中,以质量浓度为0.1 的秋水仙素处理效果最佳;试管苗处理的芽以3芽,4芽,5芽的加倍效果最好. 关键词:葡萄;试管苗;秋水仙素;多倍体诱导;加倍率 中图分类号:S663.1文献标识码:A文章编号:1003—4315(2010)02—0058—05 Polyploidinductionofplantletongrapes (cv.SuperiorSeedless)invitro 儿Xian,CHANGYong-yi,LIWen-jin,CAOLi—yan,CAOGang (CollegeofAgronomy,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China) Abstract:Plantletsofgrapes(cv.SuperiorSeedless)wereusedasmaterials.Theeffectsofcolc hicines treatmentatdifferenttimesandconcentrationswerestudiedonpolyploidinductionwiththemethodof soaking,mediumcultureandaxillarybudabsorption.Theresultsindicatedthatsoakingmethodhadthe highestdoublingratesofMlgeneration,doublingstrainratesreachedat34.98whentreatedfor48h. Mediumculturemethodhadmoderatemutageniceffect,doublingratereachedat23.63whentreatedfor 6h.Axillarybudabsorptionmethodshowedlowesteffect,doublingratewas22.98whentreatedfor4 h.Doublingratesandtreatmentmortalityenhancedalongwithincreasedofcolchicineconcentration,the concentrationat0.1wastheoptimum.Thethird,fcIrthandfifthbudsofplantletshowedabetter doublingpotentia1. Keywords:grape;plantlets;colchicines;polyploidinduction;doublingrate 与二倍体相比,葡萄多倍体器官一般具有"巨大 型",抗病性强,果粒大,适应性广等特点,因而,在 育种中具有广阔的应用前景.罗耀武等.通过在 田间诱变,成功获得了四倍体玫瑰香品系;张淑爱 等.和卢炳芝等利用组织培养的方法,用秋水仙 素处理试管苗茎段和胚状体,获得了四倍体株系和 多倍胚状体. 利用试管苗诱导多倍体,具有诱变率高,分离纯 化快等优点,是多倍体育种的新途径.本研究用秋水 仙素溶液,采用3种方法,对早熟,无核,品质优良但 生长势较弱的二倍体葡萄品种'优无核'(superior seedless)试管苗进行多倍体诱导,并通过对染色体 作者简介:集贤(1983一),女,硕士研究生,研究方向为果树育种及生物技术. 通信作者:常永义,男,教授,硕士生导师,研究方向为果树育种及生物技术,园艺植物 组织培养和果树设施栽培.E-mail:ehangyy@gsau.edu.cn 基金项目:农业部公益性行业(农业)科研专项(nyhyzy07—027). 收稿日期:2009—03—03;修回日期:2009—05—26 第2期集贤等:葡萄'优无核'试管苗的多倍体诱导 加倍率高的株系进行不断继代分离,以期获得试管 苗诱变的同质多倍体. 1材料与方法 1.1材料 本研究材料为甘肃农业大学园艺系组培室继代 生长到有6片叶的'优无核'(SuperiorSeedless)葡 萄试管苗. 1.2方法 1.2.1秋水仙素的配制分别称取0.0225g, 0.045g和0.09g秋水仙素溶于45mI无菌水中, 配成质量浓度分别为0.05,0.10o和0.2的秋 水仙素溶液,并进行过滤灭菌. 1.2.2材料处理 1.2.2.1培养条件温度:(28?2)?,连续24h 光照,光照强度为3000lx;芽位的确定:从基部向 上开始标号. 1.2.2.2浸泡培养法在超净工作台的无菌条件 下,将90株长势一致,生长健壮的'优无核'继代试 管苗剪成单芽茎段,取顶芽,5芽,4芽分别放入盛有 已灭菌的质量浓度分别为0.05,0.1和0.2 的秋水仙素溶液的5OmL三角瓶中,每个浓度设12 h,24h,48h3个处理,每处理1O个单芽茎段,重复 3次.处理材料转接到含有B5培养基的50mL三角 瓶内,每瓶接l株,以无菌水浸泡的单芽茎段为 对照. 1.2.2.3培养基培养法同浸泡培养法,每个浓度 设4d,6d,8d3个处理,每处理10个单芽茎段,重 复3次.处理材料转接到正常的B5培养基的三角 瓶(150mL)内,每瓶接3株;对照直接接人正常培 养基. 1.2.2.4腋芽吸收法在超净工作台的无菌条件 下,对90株生长到6—7片叶的健壮'优无核'继代 试管苗用镊子将已浸泡过质量浓度分别为0.05, 0.1,0.2的棉球小心放到2芽,3芽上,重复3 次.在经过2d,4d,6d后,剪成单芽茎段用无菌水 冲洗3次,转接到正常的B5培养基上;以浸泡无菌 水的棉球放到芽上为对照. 1.2.3诱变材料的染色体鉴定 1.2.3.1取材时问诱变材料(M代)培养2周 ,2cm时,上午9:30左右在无 后,其根长大约为1 菌条件下,剪取发育良好的1cm新根根尖].根尖 用蒸馏水冲洗干净后,放入盛有蒸馏水的小瓶内,立 即进行预处理. 1.2.3.2染色体观察参照傅焕延等方法进行 染色体观察. 1.2.4筛选方法将染色体加倍率高的单株进行 单芽多代分离纯化,从而获得同质多倍体. 2结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2.1不同处理方法对葡萄试管苗M.代死亡率的 影响 从表1可以看出,3种处理方法中,培养基培养 法的葡萄试管苗M.代死亡率最高(56.70),浸 泡法的葡萄试管苗M.代死亡率次之(16.70), 腋芽吸收法葡萄试管苗Mo代死亡率最低(10). 由于培养基培养法秋水仙素是添加在培养基中,长 时问直接作用于葡萄生根部位,对细胞毒害效应大, 因而,死亡率较高.各处理均随着秋水仙素质量浓度 的增加,死亡率也随之增加.说明高浓度的秋水仙素 处理易导致试管苗死亡,而低浓度的秋水仙素则加 倍效果较差. 表1不同处理方法对葡萄试管苗死亡率的影响 Tab.1Effectofdifferentmethods'mortality onculturedgrapeplantlets 0.O53O 腋芽吸收法0.1030 0.2O3O CK010 2.2秋水仙素对葡萄试管苗M.代染色体加倍的 影响 葡萄'优无核'试管苗经不 从图1一A可以看出, ,一一一, 6O?肃农业大学 同质量浓度的秋山仙素用浸泡培养法处理后,3个 秋水仙素质量浓度处理试管苗M代的染色体加倍 率差异显着(P<0.05).其中,质量浓度为0.2的 秋水仙素处理的4芽的染色体加倍率最高,为37. 579/6,而质量浓度为0.05处理的顶芽的染色体 加倍率最低,只有15.56. 从图卜B可以看出,顶芽,5芽,4芽经同质量 浓度的秋水仙素用培养基培养法处理后,质量浓度 为0.2的秋水仙素的诱变效果最好,染色体加倍 率分别达到22.3,30.46,29.73,其中,质 量浓度为0.2的秋水仙素处理与0.1处理的顶 芽染色体加倍率差异不显着,但与0.05处理差异 达到了显着水平(.P<0.05).质量浓度为0.29/6秋 水仙素处理与0.1处理和0.05处理的5芽染 色体加倍率均差异显着(尸<0.05),但0.05处理 和0.1处理之间的加倍率差异不显着.质量浓度 为0.2秋水仙素处理与0.1处理和0.05处 理的4芽染色体加倍率差异显着(P<0.05),且 0.05处理的染色体加倍率最低,为22.24. 从图1一C可以看出,3芽经不同质量浓度秋水 仙素用腋芽吸收法处理后,质量浓度为0.2秋水 仙素处理与0.1处理和0.059/6处理的3芽染色 体加倍率相比,均差异显着(P<0.05).暖量浓度为 0.2秋水仙素处理的3芽染色体加倍率最高,达 到25.119/6,0.19/6处理达到21.76,0.05处理 为20.33.质量浓度为0.2秋水仙素处理 最低, 与0.1处理和0.05处理的2芽染色体加倍率 分别达到了21.O1,17.21,16.31,均差异 显着(P<0.05),但0.1处理与0.05处理之间 差异不显着. 2.3处理时间对葡萄试管苗M,代染色体加倍的 影响 从图2一A可以看出,浸泡培养法处理各芽经48 h,24h处理后,染色体加倍率差异不显着,但与l2 h处理相比,均差异显着(P<0.05).其中,48h,24 h处理4芽的染色体加倍率最高,分别为34.98 和32.38,而12h处理的4芽染色体加倍率仪为 25.02,说明浸泡处理24h,48h的加倍率效果 较好. 从图2一B可以看出,培养基培养法处理顶芽, 30 25 20 】5 lO 5 0 A口顶芽 0200.100.05 秋水仙索质量浓度,t% 汪:\.ifZt;~养法;&培养,培养法;腋芽?发收法. 图1秋水仙素对葡萄试管苗M.代染色体加倍的影响 Fig.1Effectofdifferent【)I1【'entralionIreatmentson cuhtlredgrapeplantlctschromosomedoubling 6d处理和8d处理之『口J染色体加倍率差异不显着 (P>0.05),』J"倍率分别达到18.239/6,17.77,与 4d处理染色体加倍率(15.57)相比,差异显着 (P<O.05).6d处理的5芽染色体加倍效果最好, 与4d,8d处理相比,差异显着(尸<().05),但4d处 理和8d处理的染色体加倍率差异小显着,三者加 倍率分别为22.309/6,2().80,21.17.6d处理 4芽染色体加倍率效果最好,达到23.63,与8d 币?4d处理相比,均差异着(P<0.05).所以,6d 处理染色体加倍率最高,fn8d处理的染色体加倍 率较6d处理低,这可能秋水仙素对植物作用时 间长有毒害作用有关. 从2一叮以看出,腋芽吸收法处理2芽.6d 处理与2d处染色体加倍率差异显着(P%0.05). 如mO;.姗如…50 第2期集贤等:葡萄'优无核'试管苗的多倍体诱导 与4d处理的加倍率差异不显着,三者加倍率分别为 19.77,16.64,18.12.2d,4d,6d处理3芽 的染色体加倍率均差异不显着,加倍率分别为21.63 ,22.98和22.58.说明腋芽吸收法处理时间 的加倍效果不明显,但处理4d的加倍率最高.这可 能是由于在试管苗上放置棉球,时间一长,秋水仙素 溶液也随着稀释. 因此,加倍率随处理时间的延长而增加,但随着 处理时间的延长,秋水仙素溶液对试管苗的毒害作 用也加强. A口顶芽 40 35 30 霎蚕10 5 0 25 20 坫 窭加 5 O 25 20 1O , O 2412 处理时间,d 口顶芽 684 处理时间,d C口3芽 abb 642 处理时间/d 注:A浸泡培养法;R培养基培养法;C.腋芽吸附法. 图2处理时间不同对葡萄试管苗 染色代加倍的影响 Fig.2Effectofdifferenttimetreatmentsoncultured grapeplantletschromosomedoubling 2.4不同节位芽对葡萄试管苗M代染色体加倍 的影响 从图3A可以看出,浸泡法处理12h,顶芽,5 芽和4芽处理的染色体加倍率差异不显着,4芽的 平均加倍率最高(25.020A),5芽次之(23.40), 顶芽的最低(18.42);24h处理4芽,5芽与顶芽 的染色体加倍率差异显着(P<0.05),加倍率分别 为32.38,33.53和24.21,4芽处理与5芽 处理之间差异不显着;48h处理,4芽,5芽与顶芽 的染色体加倍率相比,差异显着(P<0.05),加倍率 分别达到了34.99,36.67和25.41,4芽与 5芽处理之间差异不显着.因此,不同节位芽的染色 体加倍效果以4芽,5芽为最佳. 从图3B可以看出,培养基培养法处理4d,4芽 和5芽染色体加倍率之间差异不显着,但均与顶芽 的染色体加倍率差异显着(P<O.05),加倍率分别 达到了23.O0,22.22,17.46.处理6d,4芽 的加倍率最高为27.51,顶芽加倍率最低,为 A 摹 褂 逛 量 莲 2 3 5 0 兰20 . 5 25 20 量15 褂 10 具 5 0 4芽5芽顶芽 芽位 4芽5芽顶芽 芽位 3芽2芽 芽位 注:八浸泡培养法;13.培养基培养法;C.腋芽吸收法. 图3不同节位芽对葡萄试管苗M1代染色体加倍的影响 Fig.3Effectofdifferentbud-sectionposition treatmentsonculturedgrapeplantlets chromosomedoubling 鬈 捌 ,,,,,,,一 一卿??一 一墨 甘肃农业大学 21.01,4芽和5芽的染色体加倍率差异不显着, 但均与顶芽差异显着(P<0.o5).处理8d,4芽和5 芽加倍率之间差异不显着,但均与顶芽差异显着(P <0.05),加倍率分别为26.34,26.96, 21.799/6.因此,4芽和5芽处理的加倍效果好. 从图3C可以看出,腋芽吸收法各天数处理3 芽的加倍率均高于2芽,其中,3芽4d处理的染色 体加倍率比2芽处理高3.4. 2.5继代分离对入选嵌合体植株的加倍率的影响 从图4可以看出,M代选取的单株加倍率都 在30以上,M代到M代的加倍率在不断的提 高,每一代的平均加倍率都>1O;在3种方法中, 除了Mz代浸泡法处理的染色体加倍率(56.5) 和培养基培养法加倍率(53.4)相差不大外,浸泡 法的加倍率在M.代,M代分别达到73.70和 9O.10%,培养基培养法次之,M.代,M代加倍率 分别为68.8,83.69/6,棉球法最低,M.代,M代 3讨论 斛 最 图4继代分离对葡萄试管苗细胞 加倍率的影响 Fig.4Effectofsubculturedseparationonculturedgrape plantletscells'doublingrates 加倍率分别为56.8和78.3. 通过3种诱变方法,并利用染色体计数法,确定 获得诱变苗(染色体加倍)植株[a-4],对诱变成功的植 株进行形态观察,可以看出诱变植株与普通植株相 比,根系加粗,须根增多,叶片增大,增厚,叶色增绿 (图5). 根植株 图5诱变苗与普通苗的比较 Fig.5Comparisonofinducedseedlingsandcommonseedlings 综合诱变后三代的加倍率观察,加倍后人选的 植株分离宜采用单芽茎段分离法,每代的加倍率能 提高10以上.通过继代分离,浸泡培养法每代的 加倍率最高,一代分离纯化速度快,可能与嵌合面积 有关.顶端分生组织染色体加倍,不论是自然突变还 是人工诱导突变形成的多倍体,往往呈嵌合体,这在 研究中也得到了证实I8].由于不同倍性的细胞互相 竞争,致使扦插后代倍性不稳定.通过连续三代对诱 变株倍性稳定性分析,嵌合体在继代中倍性结构的 变化不是绝对的,部分诱变株系的倍性在继代中比 较稳定L7].诱变形成的嵌合体在对诱变植株的染色 体观察鉴定中,除了正常的38条染色体和76条染 色体外,还有极少数不正常染色体数的细胞,Gao 等嘲和KarenE诱导植物多倍体研究均发现这种现 象,甚至有的出现80多条染色体,这种现象在诱变 株系的早代更为明显. 参考文献 [1]张蜀宁,孙敏红.多倍体育种在园艺作物中的应用[J]. 江苏农业科学,2004,(1):68—72 (下转第78页) ?舳加?如??加m0 78甘肃农业大学2010焦 降低. 2)全膜双垄沟播玉米籽粒干物质积累过程随 时问的变化符合"慢一快一慢"趋势,变化曲线呈"s" 型. 3)全膜双垄沟播玉米籽粒灌浆进程可用L0一 gistic模型描述,其相关系数均在0.99以上. 各处 4)全膜双垄沟播玉米在低密度条件下, 理间达到最大灌浆速率的时间,最大灌浆速率相差 不大;密度增加到一定程度后,因单位面积上个体数 量增加,群体中个体问竞争增强,随密度增加各处理 达到最大灌浆速率的时间明显增长,最大灌浆速率 明显减小. 5)种植密度对全膜双垄沟播玉米单粒质量的 影响主要是渐增持续期,最大灌浆速率,平均灌浆速 率,缓增期灌浆速率和快增期灌浆速率所致,而灌浆 持续期对其影响较小. 参考文献 [13OteguiME,BonhommeR.Grainyieldcomponentsin maizeI.Eargrowthandkernelset[J].FieldCrops Res,1998,56:247—256 I-2]PaponovA,SamboP,ErleyGS,eta1.Grainyieldand kernelweightoftWOmaizegenotypesdifferinginni— trogenuseefficiencyatvariouslevelsofnitrogenand carbohydrateavailabilityduringfloweringandgrain filling[J].PlantandSoil,2005,272:111-123 [3]NelsonWL.Warsaw'ShighyieldcornEJ].Cropand SoilMagazine,1986:6-7 [43金益,张永林,j振华,等.玉米灌浆后期的百粒重变化 的品种间差异分析[J].东北农业大学,1998,29 (1):712 [53李绍长,盛茜,陆嘉惠,等.玉米籽粒灌浆生长分析[J]. 石河子大学(自然科学版),1999,3(增刊):b5 [6]王婷,柴守玺.不同播种密度对西北绿洲冬小麦灌浆特 性的影响_J].甘肃农业大学,2008,43(5):33—40 [7]裴雪霞,王姣爱.播期和种植密度对小麦籽粒灌浆特性 的影响[J].小麦研究,2006,27(4):1-6 [8]刘克礼,张美莉,高聚林.春玉米籽粒干物质积累的数 量分析[J].华北农,1994,9(4):17—22 [9]曹彩云,李科江,崔彦宏,等.长期定位施肥对夏玉米籽 粒灌浆影响的模拟研究[J].植物营养与肥料, 2008,14(1):48—53 [10]崔俊明,张进忠,王立义,等.不同紧凑株型玉米灌浆 特性比较_J].玉米科学,1999,7(4):53—56 (责任编辑胡文忠) (上接第55页) [2]任清,罗耀武,柳术杰,等.人工诱变四倍体玫瑰香葡萄 的遗传稳定性研究_J].园艺,2000,(o4):285—286 [3]张淑爱,齐与枢,魏宝发,等.用秋水仙素诱导葡萄试管 苗获得多倍体口].中国果树,1989,(3):28—30,45 [4]卢炳,李佩芬,于向荣,等.诱变葡萄体细胞胚获得同质 四倍体植株的研究[J].果树科学,1997,14(3):145148 [5]王敏琴,鲍雪珍.葡萄多倍体诱导的初步研究[J].山东 农业科学,2000,(1):19—21 [6]傅焕廷,王彦亭,于元杰,等.遗传学实验[M].济南:山 东科学技术出版社,1987 [7]杨晓明,王翠玲.葡萄多倍体诱导及其特征特性研究 [J].甘肃农业大学,2005,40(6):721—744 [8]常永义,王霞霞.葡萄不同器官的染色体观测与部分品 种染色体的倍性[J].甘肃农业大学,2001,36(专 辑):92—97 [9]GaoSL,ChenBJ,ZhuDN.Invitroproductionandi— dentificationofautotetraDloidsofscutellariabaicalensis [J].PlantCell,TissueandOrganCulture,2002,70(3): 289—293 [1O]KarenKP.Colchicineandoryzalinmediatedchromo— somedoublingindifferentgenotypesofMiscanthus sinensis[J].PlantCell,TissueandOrganCulture, 2003,(73):137—146. (责任编辑许涛)
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