病毒及其病毒与宿主细胞的电子断层扫描技术研究进展

病毒及其病毒与宿主细胞的电子断层扫描技术研究进展 张勤奋，李晶 1， 电子断层扫描技术简介 1(1电子断层扫描技术图像获得 断层扫描技术(Tomography)是重一个物体的投影图像重构获得物体内部结构的技术。简单地说，电子断层扫描技术就是将一个物体沿着一个与电子束垂直的轴旋转，每旋转一个角度，获得一这个物体在相对应方向上的二维投影像，将这些像组装起来，获得样品整体三维结构的技术(图1)。为了尽可能对样品进行整体成像，在沿一个轴倾转后，将样品旋转90度后，沿另一个与第一轴垂直的轴再进行旋转成像，也就是所谓的双倾成像。这项技术的工作原理与医院中使用的CT扫描有点类似。与蛋白质电子晶体学(electron crystallography)和单颗粒技术相比，这种技术无需样品颗粒具有等同性，也不强调样品具有一定的对称性。因此，虽然目前这种技术所获得的结构的分辨率不能与上两种技术相比，利用这种技术至今只能获得50,60埃左右分辨率的结构，但其在研究非定形、不对称和不具等同性的生物样品的三维结构和功能中有着不可替代的重要作用。 电子断层扫描技术可以与多种技术结合起来使用。首先，它可利用常规的半薄切片技术，将样品利用常规固定或冷冻固定方法固定，并进行半薄切片，使具有一定大小的样品保存在一定的介质中，然后进行电子断层扫描研究。这种方法的缺点是因为首先要进行样品固定并包埋等，所有半薄、超薄切片方法中存在的缺陷都会因此而保存下来。另一种使用是将快速冷冻技术结合起来，也就是常说的冷冻电镜电子断层扫描技术(Cryo,ET)。在冷冻电镜电子断层扫描技术中，常会碰到两个问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。一个是电子辐射损伤与图像衬度间的矛盾问题;另一个是样品的厚度问题。前已介绍，由于生物样品固有的特性，要想获得快速冷冻的生物样品原有的形态结构，就必须要使用低剂量的电子来获得样品图像。但同时，生物样品在电镜中成像的反差本来就比较弱，如果降低电子束照射剂量，将使图像的衬度更低。而对于电子断层扫描技术来说，为了保证信息的完备，需要样品在较大的倾转角度范围内以较小的步长拍照，尽管每一幅照片的剂量非常低，但总体不可避免地要使用较大的电子辐照剂量。另外一个问题是电子束穿过样品的厚度与X,射线等相比比较小，这限制了电子断层扫描技术对大的生物样品，如完整的真核细胞等的研究。目前利用冷冻电镜断层扫描技术进行研究的样品的厚度一般在500,1000nm间。 世界上第一张断层扫描三维图像是通过手动控制获得的，但现在有很多软件可以自动控制样品台的倾斜，并自动获得相应的图像。一般来说，进行电子断层扫描技术需要以下设备:1，具有能倾斜一定角度的样品杆(最好能控温，以便进行冷冻电子断层扫描技术研究);2，电镜具有倾台，现在很多电镜都具有配套的软件能自动控制样品台的移动和倾斜;3，有能记录低剂量图像的CCD相机，这在冷冻电子断层扫描技术中是不可缺少的;此外，为了获得高质量的图像，并能进行厚样品的研究的话，需要电镜具有高电压系统，而且最好具有场发射电子源以及能量过滤系统等。 1(2 电子断层扫描技术图像重构 电子断层扫描技术的图像重构主要包括:每个角度获得的二维投影的中心和取向确定、多个角度的二维投影的整合组装以及最后的重构等。二维投影中心和取向的确定，目前有不同的方法和软件。主要有两大类，一种是在样品制备过程中，掺入一定大小的胶体金作为标记物， 然后根据胶体金的位置对不同的投影进行中心和取向的进行校正、排列。这种方法比较有效的软件之一是IMOD。另一种无需掺入胶体金作为标记物，其中比较有名的软件有Protomo。 (李晶写)最早的电子断层重构方法的研究是在傅立叶空间方法去进行的重构，继而发展出的实空间背投影技术(real-space back-projection technique)逐步成为应用最为广泛的技术。它是Rademacher提出的，简称为WBP方法。顾名思义，背投影方法即是将每个二维投影图像背向其记录时的倾斜角方向投影到三维空间中，很多背投影图像在三维空间中叠加形成样品的三维结构。即使在每幅图像中频率取样时统一的，单倾斜的几何特征决定了在重构样品的低频会出现过采样，高频部分也有类似的情况。通过简单的权重滤波器能够实现取样平均的目的。 另外一种三维重构方法是在70年代早期发表的迭代重构方法，其应用也在逐步扩展。它基于一个前提:重构样品背着起始投影角的重投影应该与原图像一致。这类方法括:ART(algebraic reconstruction technique)和SIRT(simultaneous iterative reconstruction technique)。以下对上述方法分别进行讨论。WBP方法以下述方式进行，它假设投影图像表示了投射光线所遇到的所有物质密度的总和。这个方法简单地分配样品的量以表示计算的背投影光线。在这个方法中，样品的量背投影到重构体中。当这个过程对一些列从不同倾斜角度记录下来的投影图像重复运用时，从不同图像上来的背投影光线彼此交叉增强，得出样品三维空间量的结构。因此，样品我们从二维投影图像上重构出了样品三维的量的结构。背投影的过程包括固有的低通滤波致使所重构的结构模糊增强。事实上，为了补偿背投影的传递函数，需要对投影图像事前进行高通滤波处理(权重)，因而，这便是其名称权重背投影的由来。具体算法描述见参考文献。这个方法的缺点在于，1.其结果受有限的角度数据所造成的缺陷影响较大，2。WBP没有考虑HVEM(high-voltage electron microscopes)的传递函数和噪声条件。作为补偿后处理技术(如低通滤波器)需要应用来消除这个方面的影响。 另外的三维重构技术，序列扩展重构方法蕴含了一些内在的调整特性，来面对有限的角度数据和极大的噪声条件。但是均因为较大的计算量而难以实用。 \begin{figure}[h] \centering \includegraphics[totalheight=5cm]{chap12WBPandSIRT} \caption{在简单条件下比较:左边是需要重构的模型;中间是用WBP方法所做的重构;右边 是SIRT方法所做的重构\label{chap12WBPandSIRT}} \end{figure} 图\ref{chap12WBPandSIRT}说明了WBP和SIRT在简单，无噪声情况下的重构。左边是一个人造的生物大分子的复合物;通过倾斜轴在[-60,+60]的角度范围每2?倾斜变化，得到61个投影图像。用WBP和SIRT方法对这些投影图像进行重构，中间的为用WBP的重构结果，右边的为SIRT迭代100次的重构结果。由图可见，WBP重构中，因倾斜数据不足造成在旋转轴沿Z方向的数据缺失。对SIRT没有明显的缺失，但是，SIRT的处理时间是WBP的两倍。(李晶写结束) 2， 电子断层扫描技术在病毒学研究上的应用 2(1 电子断层扫描技术对分离的病毒结构与功能研究上的应用 在最近的二十多年中，冷冻电镜已经为病毒结构与功能研究提供了比较详尽的资料，尤其那些具有对称性、颗粒间具有等同性的病毒结构。与冷冻电镜单颗粒技术相比，电子断层扫描技术的研究对象目前主要集中在不定形多态的、在生命过程中多变的并具有重要生物功能的病毒及其复合物。如:病毒DNA包装机器等。分离提纯的疱疹病毒是近几年来用冷冻电子断层扫描技术进行研究的比较多的一个例子。 疱疹病毒是一种结构很复杂的双链DNA病毒，直径大约在220nm左右，病毒粒子包含80多种结构蛋白，其内有一直径为125nm的核衣壳。利用二十面体重构技术，其核衣壳的高分辨结构已经被报道多次。尽管核衣壳内外有对病毒感染过程中起关键作用的不具有对称性的结构，在使用ET技术前，很少有报道这些成分的结构。近几年，几个研究小组分别用冷冻电子断层扫描技术对分离的疱疹病毒进行研究，获得了其具有非常重要意义的tegument和portal的结构。Grunewald等人利用冷冻电子断层扫描技术研究发现疱疹病毒的tegument是一个高度不对称的帽子状结构，其厚度大约为35nm，在衣壳和囊膜中间，并总是偏向囊膜的一边，而衣壳总在囊膜的另一边(图2)。进一步研究发现tegument由一些特殊密度的短丝构成了网状结构。疱疹病毒由大约11种不同类型的糖蛋白，在疱疹病毒的ET结构中可以看到这些糖蛋白位于囊膜外侧呈突起状结构，它们的的长度、厚度以及空间位置都不尽相同，还可看出有些糖蛋白跨膜分布并与tegument相连。而tegument的另一侧则与衣壳的顶端相连。每个病毒粒子大约有多达650个糖蛋白突起，这些突起并非随意分布，而是成簇分布。这些结果表明tegument可能是由高尔基体和衣壳间的蛋白集聚在一起，形成核衣壳,tegument复合物。Hong Zhou小组随后利用相似的ET技术，对肿瘤疱疹病毒(KSHV)核衣壳进行了研究，并用背投方法进行重构(图3)。结果发现病毒的12个顶点中的其中一个有一直径约为14nm，长约为15nm的柱状结构连接在衣壳内部，这一结构的中间有一直径约5nm，深7nm的通道。对这一结构进行X,射线晶体学拟合等 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，发行这一结构即为病毒核酸包装过程中起非常重要作用的portal的结构(图4)。这一结果是Hong Zhou研究小组此前利用二十面体重构获得高分辨的病毒衣壳时所没发现的。 电子断层扫描技术在研究结构特别复杂，而又没有对称性的病毒结构上有着别的技术无法比拟的优势。这种优势不仅仅在研究疱疹病毒中体现出来，还在别的病毒研究体系中显得非常突出。如Poxviridae中的Vaccinia Virus(VV)。这种病毒是最大最复杂的病毒的一种，其基因组编码超过250种的蛋白，而且几乎过半数的蛋白属于病毒的结构蛋白。更严重的是这种病毒的生命周期、生理过程等目前都没什么信息。Cyrklaff等人就是利用冷冻电镜电子断层扫描技术对其最普遍的具有感染性的所谓细胞间成熟粒子(IMV)进行了研究。结构首次显示了外膜大概有约360×270×250nm,有多层囊膜构成的病毒粒子结构(图5)。在结构的最内层，形成了哑铃状的核心，其上有8nm的突起以小的二维六角形晶格排列。连续的核心囊膜偶然会被大约7nm宽的随机分布的开口打断。这些开口被认为与病毒转录RNA的进出有关。浓缩的DNA围在哑铃状核心内，只占大约5,的病毒核心腔的体积。其它部分显示电子密度比较低，其内部被认为含有可溶性的酶。内外两膜中间有致密的网状结构。这一结构就是通常所说的lateral bodies。 可见虽然电子断层扫描技术所获得的分离的病毒粒子的结构没有单颗粒技术获得的结构分辨率高，但它能解析一些没有对称性，但在病毒生物功能种起重要作用的结构，两种技术对病毒的结构与功能研究起着同样重要的作用。 2(2，电子断层扫描技术研究病毒与细胞相互作用 电子断层扫描技术不但可以对分离的病毒粒子及其复合物进行研究，还可对在细胞中的病毒粒子以及病毒粒子对宿主细胞的影响等进行研究。 如Benjamin G. Kopek等人(2007)利用电子断层扫描技术对FHV(flock house virus)感染的细胞进行了研究，揭示了该病毒核酸复制过程中诱导宿主细胞产生一个与其核酸复制有关的结构。FHV是一种正链RNA病毒。正链RNA病毒中有很多与人类疾病有密切关系的病毒，如丙肝病毒。因此其生命过程中的每一个步骤都引起很多人的关注。大多数正链RNA病毒在复制过程中，可以引起宿主细胞内膜结构发生重排。新产生的与膜有关的RNA复制复合物与病毒RNA复制机制有重要的关系，也是控制这些病毒策略重点考虑的对象。该研究小组利用电子断层扫描技术结合传统的免疫电镜等技术，首先利用传统的电镜样品制备技术，对感染FHV的细胞进行固定脱水和包埋等处理，然后进行厚切片(250nm)，并对厚切片进行双轴倾斜(,60度到正60度)，并在400KV电压、4万倍条件下进行图像收集，常规ET图像处理。结果发现FHV感染细胞后，可诱导宿主细胞线粒体外膜内陷，在线粒体内外膜间形成了一个直径约50nm的小囊泡。免疫电镜的证据表明与FHV RNA复制相关因子Protein A以及FHV特异性5’,磷酸,5,溴嘧啶都定位在这小囊泡中。说明FHV诱导宿主细胞线粒体膜改变形成的这一囊泡复合物与FHV的RNA复制有关。对这一囊泡的进一步研究发现小囊泡与细胞质间有一直径约10nm大小的瓶颈状通道(图6)。这一通道的大小对于核糖体以及新合成的RNA等物质的进出来说绰绰有余。 尽管采用了传统的电镜样品制备技术，获得的结构的分辨率并不很高，但其结果已揭示了其它技术所没法直接看到的病毒对宿主细胞造成的改变。这些信息为病毒学的研究增加了丰富的 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 。 2(3 电子断层扫描技术与其它技术结合对病毒及其细胞复合物结构研究进展 前已简述了ET技术的缺陷，其中之一就是目前利用该技术获得的结果与电镜其它技术，如单颗粒技术等相比，其分辨率不够高。但越来越多的技术互相结合使用，这种缺陷正在得到不停地改善。 如上面提到的Hong Zhou研究小组就是将ET的结果与二十面体重构技术以及X,射线晶体学拟合技术等结合起来，获得令人兴奋的结果。 Mihnea Bostina(2007)等人利用ET技术结合单颗粒重构技术获得了小儿麻痹病毒(Poliovirus)与其受体复合物的30埃分辨率的结果。虽然，这个分辨率没有达到最好，但这结果与通常的ET结果相比，已经在分辨率上提高了一大步。小儿麻痹病毒属于小RNA病毒(Picornavirus)，没有囊膜。与有囊膜的病毒相比，这些酶囊膜的病毒如何将核酸注入宿主细胞的过程一直是受人关注的热点。作者将poliovirus与带有受体蛋白的脂质体混合在一起，快速冷冻，并进行倾斜，获得了一系列不同角度的二维投影图像，首先利用常规的ET重构技术获得病毒,受体,脂质体复合物的三维结构，再结合单颗粒重构技术，对大约1500拷贝的已经ET技术处理的复合物进行数据处理，获得了30埃分辨率的病毒,受体复合物的结构(图7)。为poliovirus如何结合受体，改变结构，将核酸注入宿主细胞提供了不可多得的信息。 可见，电子断层扫描技术、单颗粒技术甚至蛋白质电子晶体学技术、X,射线晶体学技术等都可以结合起来研究病毒、病毒,细胞成分复合物等的结构，这些技术各自有各自的优势，结合起来可以为病毒学的许多方面提供越来越丰富的信息。 参考文献: 1， Vladan L?cíc, Friedrich F?rster, and Wolfgang Baumeister，STRUCTURAL STUDIES BY ELECTRON TOMOGRAPHY: From Cells to Molecules，Annu. Rev. Biochem. 2005. 74:833–65 2， Grünewald K, Desai P, Winkler DC, Heymann JB, Belnap DM, Baumeister W, Steven AC: Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science 2003, 302:1396-1398. 3， Binbin Deng, Christine M. O’Connor, Dean H. Kedes, and Z. Hong Zhou，Direct Visualization of the Putative Portal in the Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Capsid by Cryoelectron Tomography，JOURNAL OF VIROLOGY, 2007,18(7) p. 3640–3644 4， Cyrklaff M, Risco C, Fernandez JJ, Jimenez MV, Esteban M, Baumeister W, Carrascosa JL: Cryo-electron tomography of vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102:2772-2777. 5， Kopek BG, Perkins G, Miller DJ, Ellisman MH, Ahlquist P， Three-dimensional analysis of a viral RNA replication complex reveals a virus-induced mini-organelle. PLoS Biol，2007， 5(9): e220. doi:10.1371/journal.pbio.0050220。 6， Mihnea Bostina, Doryen Bubeck, Cindi Schwartz, Daniela Nicastro, David J. Filman a, James M. Hogle，Single particle cryoelectron tomography characterization of the structure and structural variability of poliovirus–receptor–membrane complex at 30Å resolution，Journal of Structural Biology 160 (2007) 200–210。