冰冻切片he染色步骤(2008-12-25180015)一、操作
方法
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及步骤①
冰冻切片HE染色步骤
(2008-12-25 18:00:15)
一、操作方法及步骤:
?取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 ?取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
?将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ?调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5,10um间。
二、冰冻切片时的注意事项:
?防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
?多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
?放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
?组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。
?当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 ?用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温
度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴
在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
三、冰冻切片的快速染色方法:
? 切片固定30秒,1分钟。
? 水洗。
? 染苏木素3,5分钟。
? 分化。
? 于碱水中返蓝20秒。
? 伊红染色10,20秒。
? 脱水，透明，中性树胶封固。
冰冻组织1,2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过
程，结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳
冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不
作阐述。
常规方法:
(1)冰冻切片固定 10,30 s
(2)稍水洗 1,2 s
(3)苏木精液染色(60?) 30,60 s
(4)流水洗去苏木精液 5,10 s
(5)1%盐酸乙醇 1,3 s
(6)稍水洗 1,2 s
(7)促蓝液返蓝 5,10 s
(8)流水冲洗 15,30 s
(9)0.5%曙红液染色 30,60 s
(10)蒸馏水稍洗 1,2 s
(11)80%乙醇 1,2 s
(12)95%乙醇 1,2 s
(13)无水乙醇 1,2 s
(14)石炭酸二甲苯 2,3 s
(15)二甲苯(?) 2,3 s
(16)二甲苯(?) 2,3 s
(17)中性树胶封固。
注:第(14)步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇，染色结果为:细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。
封片 切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓，封片时容易导致气泡;过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。
在整个染色过程中不让切片干涸:切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓“龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”。
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