药学论文-复方鳖甲软肝方防治特发性肺间质纤维化的MMPs表达

药学论文-复方鳖甲软肝方防治特发性肺间质纤维化的MMPs 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 作者：段斐，耿德海，张梅，戎瑞雪，王蓓，唐志远 目的研究复方鳖甲软肝方对特发性肺间质纤维化防治的MMPs表达，探讨其机理和疗效。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 选SD雄性大鼠180只。随机分为假手术组、模型 组、阳性药物对照组及复方鳖甲软肝方高、中、低剂量组，共6组，每组30只。各组分别于7，14，28 d随机抽取10只大鼠，麻醉后取肺组织，MMP-2采用原位杂交及RT-PCR的方法测定。MMP-1和MMP-9采用免疫组化的方法。结果复方 鳖甲软肝方组在早期抑制MMP-9在细胞内表达上调，在中晚期抑制MMP-1在细胞内表达上调， 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 两者均有抑制纤维合成的作用。MMP-2的原位杂交和RT-PCR结果一致，在模型组过度表达，在药物组表达被抑制，表明药物对IPF的形成有抑制作用，以中、小剂量组为好。结论复方鳖甲软肝方在早期抑制MMP-9在细胞内表达上调，在中晚期抑制MMP-1在细胞内表达上调，达到抗纤维化作用；复方 鳖甲软肝方通过抑制MMP-2表达发挥抗纤维化的作用。 复方鳖甲软肝方； 肺间质纤维化； 基质金属蛋白酶家族 Abstract:ObjectiveTo study the effect of compound prescription witch turtle shell (CPTS) on the expression of MMPS in rats with IPF (Idiopathic pulmonary interstitial fibrosis) caused by Bleomycin A5.Methods180 male SD rats were randomly divided into six groups:sham operation group, model group, positive medicine groups, high-dosage group, medium-dosage group and low-medium group. After they were given the medicine, ten rats in each group each time were killed respectively on the 7th day, 14th day and 28th day. MMP-2 was detected by in situ hybridization and RT-PCR, MMP-9 by immunohistochemical method. ResultsCPTS could inhibit expression of MMP-9 in early phase and MMP-1 in middle and late phases. Result of hybridization in situ of MMP-2 was similar to that of RT-PCR. The effects of medium dose groups and low dose were better. ConclusionCPTS can inhibit the expression of MMP-9 in early phase and MMP-1 in middle and late phases. CPTS has a protective effect on IPF by inhibiting the expression of MMP-9. Key words:Compound Prescription witch turtle shell; IPF; MMPs 细胞外基质（extra cellular matrix , ECM）蛋白与其它类型的蛋白一样，有合成过程也有降解过程。ECM蛋白翻译以后的修饰加工过程，以及蛋白质的降 解过程，都是由酶来催化的，这些蛋白酶类属于锌内肽酶，因而称之为基质金属 蛋白酶（matrix metal proteinases,MMPs ）。MMPs 来源于多种类型的细胞， 其在ECM（extra cellular matrix ）破坏和降解过程中具有十分重要的作用。本文主要对基质金属蛋白酶在特发性肺间质纤维化表达进行实验研究。 1.1 药物 1.1.1 防治药物复方鳖甲软肝方（内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生 产的复方中药干粉，600 g/瓶，批号：20020501）。高剂量1.4 g?kg-1?d-1、中剂量0.7 g?kg-1?d-1、低剂量药物为0.35 g?kg-1?d-1。相当于临床日用量（0.1 g?kg-1）的14倍，7倍，3.5倍。 1.1.2 阳性对照药醋酸强的松0.56 mg(100 g-1?d-1）广东华南制药厂生 产，批号011201。 1.1.3 造模药物注射用盐酸博莱霉素（bleomycin，BLM-A5），日本化药株式会社制造，批号X12100。 1.2 动物SD大鼠180只，雄性，体重200～220 g，购于北京维通利华实 验动物技术有限公司，动物级别：SPF/VAF，许可证编号：SCXK2002-0003。饲养于同级动物房，自由饮水。购入后适应性饲养1周，进行实验分组。随机分为6组:假手术组、模型组、阳性药物对照组及复方鳖甲软肝方（以下表格中简称鳖 甲方组）高、中、低剂量组。每组30只。各组均于7，14，28 d随机抽取10只大鼠采血，同时取肺制成光、电镜标本。实验动物分组及给药剂量见表1。表1 实验动物分组及给药剂量（略） 阳性药物组及复方鳖甲软肝方高、中、低剂量组药物均配制成1.5 ml溶液灌注;n=30 1.3 试剂 Trizol Reagent购自Invitrogen公司,M-MLV Reverse Transcriptase ，RT-PCR试剂盒，Trizol液购自Promega公司,Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司,琼脂糖购自中国科学院生物物理所生化厂，DNA Marker，DEPC，溴酚蓝，溴化乙锭，购自北京鼎国生物技术公司。SP-9002，ZLI-9017DAB，SC-7480 Mouse anti-MMP-1， SC-6840 Goat anti-MMP-9购自北京中杉试剂公司分装Sigma产品。 1.4 PCR引物PCR引物(由北京奥科生物技术有限公司合成),MMP-2 上游：5' TCGTCCATCCATTGAAGC 3'；下游：5' CCCTCGTTATTTGGTGTT 3'；扩增长度426 bp。β-actin 上游：5'GAACCCTAAGGCCAACCGT 3'；下游： 5'TGCCGATAGTGATGACCTGAC 3'， 扩增长度325 bp。 1.5 仪器 BIO-RAD Model 250/2.5电泳仪，美国BIO-RAD公司产品。CHB-100恒温金属浴，杭州大和热磁电子公司产品。PCR扩增仪，PTC-100型，美国BIO-RAD公司产品。Sigma-2K15台式高速离心机，美国Sigma公司产品。紫外分光光度仪， 199-1100 nm，美国BIO-RAD公司产品。Imagemaster VDS凝胶成像分析仪，美 国BIO-RAD公司产品。A1104电子天平，上海分析天平厂产品。低温冰箱， MDFU5410(-70?C)，成都，泰盟科技有限公司产品。冰冻切片机，LEICA CM1850型，德国Leica公司产品。 2.1 动物分组与模型制备用1.5%戊巴比妥钠（0.1 ml?kg-1）腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧固定于手术台上，颈部剪去毛、常规碘酒与酒精消毒，切开颈 正中皮肤，逐层分离，暴露气管，用一次性1 ml注射器向气管内注入0.3 ml博莱霉素生理盐水溶液（5 ml?kg-1），然后立即将动物直立并旋转，使药液在 肺内均匀分布。假手术组大鼠肺部注入等体积的生理盐水。 2.2 取材方法各种器械用DEPC水处理后高压灭菌备用。大鼠麻醉后活体取 材，开胸后迅速取出一侧肺置于液氮中以备用于MMP-2的原位杂交和RT-PCR检测。免疫组化及其余步骤同“2.1”项。 2.3 基质金属蛋白酶基因片段的制备 2.3.1 引物设计根据已报道的基质金属蛋白酶基因编码序列NM 022564，利用Primer Premier5.0软件设计引物。 2.3.2 大鼠肺组织总RNA的提取取液氮速冻的肺组织50 mg，移入盛有1 ml Trizol匀浆器中，室温下匀浆,使组织完全裂解,室温下静置5 min?加入0.2 ml氯仿，盖紧离心管，剧烈振荡离心管15s?4?，12 000 r/min，离心10 min?取上层水相置于一新的离心管，加入异丙醇0.5 ml?1 ml-1Trizol，轻轻混匀，室温静置10 min?4?，12 000 r/min，离心10 min；离心后RNA沉淀至管底，形成白色胶状沉淀?弃上清，加入75%乙醇1 ml?1 ml-1Trizol?混匀混合液，4?，7 500 r/min，离心5 min?弃上清，室温干燥RNA 5 min?取适量RNA 用DEPC处理过的水溶解，紫外分光光度计下测260,280 nm的吸光度?计算OD260/OD280的比值及RNA的浓度。260/280比值在1.8～2.0之间?计算 OD260/OD280的比值及RNA的浓度。260/280比值在1.8～2.0之间，可用于下一步实验，RNA浓度=OD260×稀释倍数×40/1000?其余的RNA置于70%乙醇中，存于-70?冰箱中保存。 2.4 RT-PCR 2.4.1 反转录反应 ?取1 μl总 RNA于一支Ep管中，加1 μl（100 μmol/L）的3'反向引物，定容到15 μl，72?处理5 min，置于冰浴中;?在Ep管中按下表配置30 μl反应体系。见表2。表2 大鼠肺组织MMP-2 cDNA反应体系的制备（略） 将上述样品加入0.2 ml Ep管中，混匀，42?保温1 h。 2.4.2 PCR反应?在Ep管中按下表配置30 μl反应体系。见表3； ?PCR扩增仪中扩增:94?预变性2 min?94?变性15 s?42?复性30 s?72?延伸90 s?扩增30个循环?72?延伸加时5 min；?琼脂糖凝胶电泳观察:取10 μl样品，加入2 μl上述样品缓冲液，混匀；琼脂糖0.75，加入50 ml 1×TPE缓冲液于微波炉中，取中火，加入2 μl EB混匀，灌胶；分别加入样品、内参对照 物各12 μl,在1×TPE缓冲液中60 V电泳1 h，紫外灯下观察结果。表3 大鼠肺组织MMP-2 PCR反应体系成分（略） 2.5 基质金属蛋白酶基因的获得 2.5.1 引物设计在GeneBank中查到了已报道的编码大鼠肺组织基质金属 蛋白酶的mRNA序列，NM 022564 1 644 bp，蛋白编码序列113-1486（CDS）=1 373 bp，共457个氨基酸。拟扩增全长编码序列，利用Primer Premier5.0软件设计引物。 引物为：Primer I: 5' TCGTCCATCCATTGAAGC 3'，18mer;Primer ?: 5' CCCTCGTTATTTGGTGTT 3'，18mer。 2.5.2 大鼠肺组织总RNA的提取本实验提取大鼠肺组织总RNA，使用RT-PCR技术，得到编码目的蛋白的核苷酸序列。用大鼠新鲜肺组织50 mg ,液氮速冻，并在液氮条件下匀浆。实验中使用TrIzol试剂提取大鼠胎盘组织总RNA，提取过程简便，经甲醛变性电泳检验,呈现28 S和18 S两条带，无“拖尾”，总RNA无降解(见图1)，可用于RT-PCR扩增。 2.5.3 RT-PCR扩增大鼠基质金属蛋白酶基因片段以提取的总RNA为模板，用3'反向引物反转录第一条链。然后以反转录产物为模板，用引物primer I、?进行PCR扩增，产物长度为1479bp,2%琼脂糖凝胶电泳检验，扩增产物单一， 分子大小准确，结果见图2。 2.6 免疫组化（MMP-1 、MMP-9） 2.6.1 取材步骤及切片处理同“2.2”项。 2.6.2 免疫组化操作步骤按照常规操作。结果判定：在用DAB显色的免疫细胞化学切片上，阳性反应按颜色深浅分为：棕黄色为强阳性；黄色为阳性；浅 黄色为弱阳性；与间质颜色一致者为阴性。 2.7 原位杂交按照常规操作。 3.1 RT-PCR实验结果以β-actin为内参对照，对RT-PCR结果进行分析，凝胶电泳经FuJiFilm图像处理，输入Imagemaster VDS凝胶成像分析系统做密 度扫描，进行表达强度分析，以同时扩增的β-actin表达强度为基准，按以下 公式计算样品MMP-2表达强度：表达强度 = 样品MMP-2 A值/β-actin A值。 3.2 大鼠肺组织MMP-2总RNA电泳结果利用Trizol法提取的肺组织RNA，琼脂糖电泳能清晰见到28S和18S两条核糖体RNA带。电泳图上RNA的OD260/OD280比值在1.8～2〃0之间，说明总体纯度较高，可以满足RT-PCR扩增。见图1。 3.3 大鼠肺组织MMP-2 PCR扩增产物电泳结果肺组织MMP-2的PCR产物均出现（预期长度426 bp），β-actin内参对照也特异性扩增（预期长度325 bp）。说明模型组MMP-2的含量明显高于假手术组，复方鳖甲软肝方高、中、低剂量 MMP-2含量下降。阳性药物组介于药物组和模型组之间。见图2。 3.4 MMP-9和MMP-1免疫组化实验结果 MMP-9假手术组除7d肺泡腔内炎症细胞有阳性的表达外，14，28 d均无表达。模型组肺泡间隔间质细胞，巨嗜细 胞，脱落到肺泡腔的炎性细胞均强阳性表达。阳性药物组3个阶段均以?型细胞 和肺泡腔内的炎症细胞阳性表达为主，有部分间质细胞呈阳性。复方鳖甲软肝方 高、中、低剂量组3个阶段均仅在肺泡腔炎性细胞和?型细胞呈阳性或弱阳性表 达，其余各种细胞均无表达。 MMP-1假手术组7，14，28 d在肺泡炎症细胞弱阳性表达，模型组肺泡间质 细胞强阳性表达，肺泡腔炎症细胞呈弱阳性表达。复方鳖甲软肝方高、中、低剂 量组各组肺泡间质细胞7，28 d均阳性表达。 3.5 MMP-2原位杂交实验结果28 d取材结果显示，MMP-2在假手术组呈阴性不表达；在模型组细支气管上皮细胞和部分肺泡隔巨噬细胞强阳性表达。?型 细胞阳性表达。复方鳖甲软肝方高、中、低剂量组仅在部分肺泡隔巨嗜细胞呈阳 性或弱阳性表达。阳性药物组表达似复方鳖甲软肝方高剂量组。 在特发性肺纤维化形成的发病机制中，MMPs家族和特发性肺纤维化的形成 有关［1］。明胶酶是MMPs家族的成员之一，包括明胶酶A（MMP-2）和明胶酶B（MMP-9）两种类型。两者结构相似，底物特性相似，但基因表达调控却有许多 不同［1］。MMP-2基因转录的增强，容易引起肺基膜结构的损伤，引起特发性 肺纤维化的启动机制［1～2］。肺组织内MMP-2的过度表达，可能是特发性肺纤 维化启动的重要原因［3］。在RT-PCR实验电泳图中，可以清晰地看到复方鳖甲 软肝方高、中、低剂量组对MMP-2的表达有抑制作用。激素对MMP-2的表达也有抑制作用，只是效果不如复方鳖甲软肝方各剂量组。明胶酶主要来源于巨噬细胞 和炎症细胞，28 d时，肺泡炎症已经基本消退，但其表达仍然呈现阳性，说明 在该阶段MMP-2其来源可能与文献报道的成纤维细胞通过使MMP-2基因转录增强，来产生更多的MMP-2，导致肺基膜结构的损伤，参与特发性肺纤维化启动的过程 有关，尚需更多的实验来进一步证实成纤维细胞在其中所起的作用。 文献报道，MMP-2主要分布于再生的肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞［4］。其活性形式在肺泡上皮细胞的和肺泡结构的重建中起很重要的作用。肺泡上皮不 单是致纤维化因素的损伤对象，其损伤后活跃增生的肺泡?型上皮细胞可以通过 释放MT1-MMP，催化MMP-2，从而引起和（或）加重肺基膜的损伤。这些结果在 实验中通过原位杂交和RT-PCR都得到证实。 免疫组化MMP-1和MMP-9的检测证实，在组织早期损伤阶段MMPs表现分泌增加，活性增强，溶解、破坏基膜及ECM的作用［1，5］。MMP-2、MMP-3、MMP-9增强活化后，进一步破坏基膜及ECM，而且参与TGFβ的释放，进而异常的基质 重塑［6］。MMP-9在7 d时主要在肺泡腔巨噬细胞和中性粒细胞中表达，在14 d时随着肺泡腔巨噬细胞和中性粒细胞的减少，活性也随之下调。28 d时由于肺泡腔炎症细胞的减少，仅在部分细支气管上皮及部分间质细胞呈现阳性表达。同 文献报道结果比较一致。 MMPs活性的调节是一个多水平、多环节的复杂过程［7］，因此始终是研究的热点和关注的焦点，其中MMP-2被认为是特发性肺纤维化病理过程起重要作用 的因素之一［8］。通过MMP-2的RT-PCR的电泳图和原位杂交实验进一步说明复 方鳖甲软肝方高、中、低剂量组在防治IPF中所起到的抗纤维化作用［9］，说明中药在抗纤维化方面还有很多 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 需要我们进一步探讨。深入研究MMPs对IPF调控机制和中药对其的影响，将有助于揭示特发性肺纤维化发生发展的病理过程， 并为临床防治特发性肺纤维化提供新的思路。 ［1］吴浩，许杰，卢韶华，等.肺纤维化大鼠种基质金属蛋白酶-2的表达［J］.中华病理学杂志，2001，6：452. ［2］Betsuyaku T, Fukuda Y, Parks WC, et al. Gelatinase B is required for alveolar bronchiolization after intratracheal bleomycin［J］.Am J Path 2000，157(2):525. ［3］向菲，辛建保，汪世翰，等.己酮可可碱对肺纤维化大鼠MMP-2和TIMP-1表达的影响［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2004，13（4）：440. ［4］Ries C，Petrides PE. Cytokine regulation of matrix metalloproteinase activity and its regulatory dysfunction in disease ［J］.Biological chem. Is try Hoppe Seyler，2001，376 (6):345. ［5］骞爱荣，商 澎，陈志南.改良明胶酶谱测定明胶酶活性［J］.解放军医学杂志，2003，28（3）：282. ［6］Jenny T .M. Donald PT. Paula NB. et al. All transretinc acid modulates the balance of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metal-loproteinase-1 in Patients with empbysema［J］. Chest. 2003,124:1724. ［7］Groft LL，Muzik H，Rewcastle NB，et al. Differential expression and localization of TI MP-1 and TI MP-4 in human gliomas［J］.Br J Cancer，2001，85(1):55. ［8］Zeng Z，Sun Y，Shu W，et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-3 is a basement membrane-associated protein that is significantly decreased in human colorectal cancer［J］.Dis Colon Rectum, 2001，44(9):1290. ［9］Chen Y, Blom IE, Sa S, et al. CTGT expression in messaging cells: involvement of SMADS, MAP kidase, and PKC［J］.Kidney Int. 2002,62(4):1149.