斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序（可编辑）

斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序（可编辑） 斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序 中 图 分 类 号:R89 ;R36 :R39硕 士 学 位 论 文 斯氏狸殖吸 虫线粒体 cytb 基因的 扩 增 、 测序 , 和 cytb 基因 在斯氏 狸殖吸虫 不同虫期 的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 基 础 医 学 院 院(系 ) 、所 研 究 生 姓 名 王 曼 免疫学学科、专 业 王 光 西 教授 导师姓 名 二 Ο 一二 年四 月目录1 论文正文 斯氏狸殖 吸虫线粒 体 cytb 基因 的扩 增、测序 , 和 cytb 基因 在斯氏 狸殖 吸虫 不同 虫期的表达 1.1 中文摘要 1.2 英文摘要 1.3 前言 2实验一 斯氏狸殖吸虫线粒体 cytb 基因 片段 的扩增、 测序, 并将其纳入 NCBI 基因库中。 探讨 斯氏狸殖吸 虫线粒体 cytb 基因在吸虫分类方面的作用。 材料与方法 结果 3实验二 斯氏狸殖吸虫5 个虫期cDNA 的获得 。 Realtime PCR 法分析斯氏狸殖吸虫 5 个虫期线粒 体 cytb 基 因的表达情况 并分析与 其致病的关系 。 材料与方法 结果 4讨论 5结论 6参考文献 7英文缩略词对照表 8致谢 9吸虫线粒体基因研究进展(综述) 参考文献 斯氏狸殖吸 虫线粒体 cytb 基因的 扩 增 、 测序 , 和 cytb 基因 在斯氏 狸殖吸虫 不同虫期 的表达 摘要 目的:扩增出斯氏狸殖吸虫线粒 体 cytb 基 因片段并测序,研究 斯氏狸殖吸虫 5 个虫期线粒体 cytb 基因的表达情况并分析对吸 虫研究的作 用 。方法: (1 )分别 提取斯氏 狸 殖吸虫囊蚴 、30 天 童虫、60 天童虫、成虫、虫卵 的 mRNA , 并反转录为 cDNA 保 存于-20 ?。 (2)用 日本 血吸虫线粒体cytb 基因设计出斯氏狸殖 吸虫的线粒体cytb 基因 的 兼并 引物, 聚合 酶链式反应 (PCR ) 法 扩增出斯氏狸殖吸虫 cytb 基因片段?电泳 分离?提纯?连接? 转化?挑菌?摇菌?送出测序。 用所得的测 序结果设计斯氏狸殖 吸虫线粒体cytb 基因片 段的特异引物 。 (3)用DNAsis 等软件分 析 7 种吸 虫的线粒体 cytb 基因,并用树的 方式表达它们的亲缘 关系。 (4)以 5 个虫期 cDNA 为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,特异 引物为实验组引物, 卫氏狸殖 吸虫的 18SrDNA 基因引物作为内 参引物做 实时荧 光定 量PCR (realtime PCR ) 。根据所获得的结 果判断斯氏狸殖吸虫 5 个虫期线粒体 cytb 基因的表达情况并分 析与不同虫期虫体致 病情况的 关系。结 果: (1 )获得 542bp 的斯氏狸殖 吸虫线粒体 cytb 基因片段, 并将该基 因片段纳入 NCBI 基因库中 。 根据该基 因片段设计出一对斯氏狸殖吸虫线粒体 cytb 基因片段的特异引 物 CytbF: 5 ′ GGTTGCTTGATCATAACATTGG 3 ′ CytbR: 5 ′ GACACTCTGGGTCGACCTTG5 ′2 通过在 Genebank 数据库中 Blast 发现 , 斯 氏狸殖吸 虫的此段cytb 序列 与日本血 吸虫 (中国 流行 区虫种) 、 异 盘并殖 吸虫、 哈氏并殖 吸虫 、 卫 氏并殖 吸虫以 及斜睾 吸虫等 有相似 性 , 一共搜 索 到种 7 具有同 源性的虫 种 ,对 7 种吸虫 线粒体 cytb 序列 利 用 MEGA4 计算遗传 距 离, 采用最大简约法 (MP ) 和邻位相连法 (NJ ) 构建系统进化树, Bootstrap 法检验, 并Clusterx 软 件对7 种 吸虫 线粒体cytb 序 列进行多序列对比,用 DNAsis 软件对实验 所得日本血吸虫和斯 氏狸殖吸虫 cytb 片段序列进 行序列分析 , 结果显示,用 NJ 和 MP 方法构 建的遗传系统进 化树拓扑 结构相 似,同时用 MEGA4 软 件对遗传距离进行分析计算上, 所得遗传距 离远近分布与所得遗 传系统进 化树 结果一 致 。Realtime PCR 结 果显示 除 了虫 卵期不 见线粒体 cytb 基因的 表达,其他虫期均有 表达。 结论 :1. 线粒 体cytb 基因可作为吸虫 遗传进化分类的依 据。2. 线粒体cytb 基 因 在 斯 氏 狸 殖 吸 虫 不 同 虫 期 的 表 达 情 况 与 不 同 时 期 该 虫 对 宿 主 的侵袭危害是成正相关的, 也为以后的预防 , 诊断, 治疗提供理 论依据。 关键词: 斯氏狸殖吸虫; 线粒体 ;cytb 基因 片段;T/A 克隆 ; PCR ;RT-PCR ;DNAsis;Realtime PCR sequence mitochondria gene cytb of Pagumogonimus skrjabini and cytb expression in different stage Abstract :Objective : 前言 肺吸虫病是由并殖吸虫Paragonimus 引 起 的 一 种 人 畜 共 患 的地方性寄生虫病 , 已报道 并殖吸虫 虫种近 50 种, 包括同物 异 名、亚种及变种,其中 32 种是在我国报道 ,并 证实可寄生人体 的并殖吸虫就有 9 种。在 东南亚、 非洲与拉 丁美洲均有流行, 在 我国就有 25 个省、市、自治区流行 该病 。斯氏 并殖 吸虫 (Paragonimus skrjabini ) 是我国独有虫种, 主要分布于四川、 云 南、贵州、福建等 14 个省、市、自治区。 斯氏并殖 吸虫 的终末 宿主为犬、 猫、 果子狸等, 能在它们体内发 育成成虫, 成虫产卵, 卵通过呼吸道排出, 在水内孵 化成毛蚴 , 毛 蚴钻入第一中间宿主 淡水螺内发育成为尾蚴。尾蚴离开螺 体后能 在水中生存 1-2 天, 如遇第二中间宿主淡水 溪蟹或 ?蛄, 侵入其 体内发育成为囊蚴 , 囊蚴是肺吸虫的感染型。 正常终末宿 主吃下 感染的溪 蟹或? 蛄, 囊蚴随之进入消化道, 经消化 液作用脱囊成 为童虫。 童虫的活动 能力很强, 加上所分泌的酶的作用, 可穿过 肠壁进入腹腔, 其中 多数童虫沿腹膜移行, 经肝、 脾、 胃的表面 向上移行, 直接贯穿 膈而达胸腔, 侵入肺内并发育为成虫, 并在 此结囊产卵。 少数童 虫停留于腹腔内继续发育,并穿入肝 脏浅层 或大网膜成为成虫 , 偶尔也穿行于肾、 纵隔, 脑 、 脊髓等处 。 人 类是本虫的非正常宿 主,从人体检获的虫体绝大部分为童 虫,少 见发育成熟并产卵。 在人体内的童虫到处游窜, 难 以定居, 造成 局部或全身的病变 ? ?幼虫移行症。 主要表现是游走性皮下结节 , 多见于胸背部、 腹 部、 头颈、 四肢、 腹股沟、 阴囊等处。 除了皮下移行也可侵入肺、 肝、 脑等, 容易导致临床误诊为肿瘤, 不仅耽误了正确治疗还大 大增加了患者的经济负担。 图 1 图 2 图 3 目前在斯氏并殖 吸虫的诊断、 治疗和预防等 方面存在都着许 多问题。 如在诊断方面, 目前主要采用的是 免疫诊断方法, 但斯 氏肺吸虫与其他吸虫, 如血吸 虫、 华支睾吸 虫等存在遗传上的 亲 缘性, 因此检验结果往往出现较高的交叉反 应率; 治疗上, 目前 临床仍以化疗手段为主控制斯氏并殖 吸虫的 虫体发育, 但是吸虫 对 传 统 药 物 的 耐 药 性 现 象 又 越 来 越 突 出 , 寻 找 新 的 药 物 作 用 靶 点、 开发新药迫在眉睫; 在疫苗预防方面, 目前还没有获得突出 的进展。 因此, 依靠传统方法去解决这些问 题比较困难, 分子寄 生虫学的出现正好填补了这方面的空 白, 尤其对虫体线粒体基因 的研究, 将为斯氏并殖 吸虫 的诊断、 治疗、 疫苗等研究提供新的 技术和方法。 线粒体基因组 具有结构简单、 母系遗传、 缺少重组 、 进 化 速 率 快 等 特 点 , 目 前 已 成 为 研 究 吸 虫 代 谢 途 径 的 理 想 靶 目 标。 图 4 吸虫线粒体基因的典型结构图 如图 4 ,斯氏并殖吸虫的 线粒体 DNA (mitochondrial DNA, mtDNA ) 本次试验首次扩增出斯氏并殖吸虫的 线粒体 细胞色素氧化酶 b 的 cytb 基因序列, 采用 RT-PCR ,T/A 克隆 及 RTQ-PCR 技 术, 研究 cytb 在斯氏 狸殖 吸虫不 同虫 期的表 达,阐 述其 生物学 功能。 为 了 解 该吸虫的物质代谢途径, 探索药 物和疫苗作 用的靶基因研究奠定 基础。 实验一 斯 氏狸殖吸虫线粒 体 cytb 基因片段的扩增 、测序, 并将其纳 入 NCBI 基因库中。 探讨斯氏狸殖吸虫线粒 体 cytb 基因在吸 虫分类方面的作用 。 1 实验材料 1 .1 实验材料 云南威信县扎西镇桂花乡元盛店村采 集溪蟹 , 解剖镜下分离囊 蚴。腹腔注射感染 SD 大鼠(30 ?2 个囊蚴 /只,购自泸州医学 院实验动物房)20 只, 感染 30 天后即可麻 醉处死大鼠, 在肝脏 及腹腔寻找 斯氏狸殖吸虫 童虫。 图 5 流行区采集 锯齿华 溪蟹和 分离囊 蚴 Fig5 Sinopotamon denticulatum collected from endemic areas and examining metacercaria 1 .2 斯氏狸殖吸虫线粒体cytb 基因 片段兼 并 引物的设计 由 北京赛百盛公司合成 。根据由 NCBI 数据 库中查得日本血 吸虫线粒体 cytb 基因 编码区保守序列, 用 Primer5 软件 设计 了 一 组 斯氏狸殖吸虫线粒体 cytb 基 因 的 兼 并 引 物 :CytbF:5 ′ GTATTATGGGAGGTATCGTTT 5 ′CytbR:5 ′ATCTTTGAGTCTACTCTTCGT 3 ′ 2 实验试剂 (1 )NaCl 上海 生工生 物技 术有限 公司 (2 )NaOH 上海生 工生物 技术 有限公 司 (3 )DMSO 美国 Sigma 公司 (4 )EDTA 美国 AMRESCO 公司 (5 )HCl 成都 市科龙 化学 试剂厂 (6 )CaCl2 立陶 宛 MBI 公司 (7 )PCR 引物由 北京赛 百盛 公司合 成 (8 )IPTG 美国 Merck 公司 (9 ) β- 巯基乙 醇 美国 Sigma 公司 (10 )Ex Taq 酶 大连 TaKaRa 公司 (11 )DNA Marker DL-2000 大连 TaKaRa 公司 (12 )T4 DNA 连接酶 大连 TaKaRa 公司 (13 )E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit 美国 Omega 公司 (14 )E.Z.N.A. Gel Extract Kit 美国 Omega 公司 (15 )E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit 美国 Omega 公司 (16 ) 细菌培 养用胰 蛋白 胨 英国 Oxoid 公司 (17 ) 丙三醇 成都 市科龙 化学试 剂厂 (18 ) 琼脂糖 西班 牙 Biowest 公司 (19 ) 冰乙酸 成都 市科龙 化学试 剂厂 (20 ) 甘氨酸 美国 AMRESCO 公司 (21 )SDS 美国 AMRESCO 公司 (22 )Tris-base 美国 AMRESCO 公司 (23 ) 甲醇 成 都市 科龙化 学试剂 厂 (24 ) 甘氨酸 美国 AMRESCO 公司 (25 ) 无水乙 醇 成都 市科 龙化学 试剂厂 (26 ) 溴酚蓝 上海生 工生 物技术 有限公 司(27 )PBS buffer :10mmol/L Tris ,150mmol/L NaCl ,HCl 调 pH 至 7.2 (28 )PBS-Tween/Triton buffer :20mmol/L Tris ,500mmol/L NaCl , 0.05%(29 )Tween 20 ,0.2% Triton X-100 ,HCl 调 pH 至 7.5 (30 ) 蛋白酶 K 、饱和 酚、琼 脂糖 由宝生 物公 司提供 (31 ) 胰化蛋 白胨、 酵母提 取液 由碧云 天生 物技术 公 司提供 (32 ) 大肠埃 希菌(Escherichia coli )JM109 菌株和 pMD19-T Vector 购自大 连宝生 物公司 。 (33 ) 吉姆萨 染液: 第三军 医大 学寄生 虫研 究实验 室 配制。 (34 )10% SDS : 电泳 级 SDS 10.0g ,dd H2O ,68 ? 助 溶,浓盐 酸调 pH 7.2 , 定容 至 100ml 10% 过硫 酸铵 (APS ) : 过硫酸 铵 0.1g , dd H2O 1ml , 现配现 用 3 实验仪器 1 低温 高速离 心机 美国 Beckman 公司 Avanti-J-25 型 2 小型 离心机 美国 Sigma 公司 1-1S 型 3 电子 天平 北京赛 多利 斯仪器 系统有 限公 司 BS224S 型 4 核酸 蛋白检 测仪 上海 沪西分 析仪器 厂 HD-2 5 隔水 式恒温 培养 箱 上 海福玛 实验设 备有 限 公司 6 生化 培养箱 美国 Sheldon GI7-2 型 7 洁净 工作台 苏州 安泰 空气技 术有限 公司 SW-CJ-IF 型 8ND-10000 超微量 紫外 分光光 度计 美国 Beckman 公司,DU-640 型 (9 ) 制冰 机(美 国 GRANT, FM70 ) (10 )PCR 仪 美国 Bio-Rad 公司 170-9703 型 (11 ) 琼脂糖 凝胶 电泳装 置 美国 Bio-Rad 公司 4 实验方 法 4.1 斯 氏狸殖吸虫基因组DNA 的 提取 取童虫6 只, 称重96mg , 用双 蒸水 反复 吹打冲洗2 次, 再 用超纯水反复冲洗 2-3 次,置于EP 管中 , 将虫体剪碎,加入 500 μl TE, 全部转移到 10ml 匀 浆器中,在 冰上研磨,待成为 淡黄色悬浊液是收集在 EP 管中 ,并置于沸 水中 3min 。加入 100 μl 10% SDS 裂解缓冲液 和 5 μl 20 mg ?ml 的蛋白酶 K,37 ?水浴 过夜。 加入1ml 饱和酚 ,4 ?,6000g , 离心10min , 取上层水相。加入等体积的酚: 氯仿:异戊 醇(25 :24 :1), 4 ? ,6000g , 离心10min , 取上层水相 。 加 入2.5 倍体 积 的冰 预冷无水乙醇,可见白色云雾状 漂浮物,-20 ?过夜。取出冻 存的漂浮样DNA ,4 ?,12000g, 离心20min ,去上清。沉淀用 预冷 70 %乙醇洗涤 2 次,65 ? 水浴挥干, 加入 50 μl 无菌水 溶解沉淀的 DNA ,置于-20 ?备用 。紫外 分 光光度计 测得 DNA 260 ?2801.92 260 ?2301.1 ng ? μl978 。取 8 μlDNA 溶解液跑电泳, 结果如图 6 , 可 见 提取出大 片段的斯氏狸殖吸 虫基因组DNA 。 4.2 聚合酶 链式反应 (PCR ) 获得肺吸虫线粒 体 细胞色素bcytb 的编码DNA 序列 及产物电泳分析 25 μl 的反应体 系 :TaKaRa Ex Taq5U ? μl0.5 μl 10 ×Ex Taq BufferMg2 +Free2.5 μl MgCL225Mm 2 μl dNTP Mixture 各 2.5Mm2 μl 灭菌dd H2O 15 μl 引物CytbF1 μl 引物CytbR1 μl 模板 1 μl PCR 扩 增条件为:94 ?预变性5 分钟,1 个 循环; 然后94 ? 变性1 分钟,48 ?退火 30 秒,72 ?延伸1 分钟,共35 个循环; 最后72 ?延伸10 分钟。1 %琼脂糖凝胶电泳 鉴 定。 结果 如图6 : ( 图 6 第 1-8 跑道是 cytb 扩 增产物 ;第 9 跑道为 DNA marker ;第 10 跑道 为斯氏狸 殖吸虫 基因组 DNA ) (Fig.6 1-8. Transcription profile cytb 9.DNA marker DL2000 10.DNA of Paragonimus skrjabini ) 4 .3 PCR 产 物 的 提纯 、TA 克隆 与测 序 (1 )采用 Silver Beads DNA 胶回 收试 剂盒 (上 海生 物工 程技术服务有限公司) 对PCR 产物进行纯化 , 按照试剂盒说明操 作,选择约500 bp 的目 的片段进行切胶回 收纯化 (2 )将 所得纯化的目的 片段与 pMD19-T 载 体( 宝生物工程 大连 有限 公司 ) 进行TA 连接, 连接方法为 : 浓度为 10 ng/ μl 的目的片段 5 μl 、浓 度为 50 ng/ μl 的 pMD19-T 载体 1 μl 、 10 ×缓冲液 1 μl 、T4 DNA 连接酶200 U 、 双蒸水补充至总体积 为 10 μl ,置温度 16 ?孵育 8 小时,构建重组克隆载体 pMD19-T/CYTB (3 ) 将重组克隆载体pMD19-T/CYTB 转化入CaCl2 法制备的 DH5 α大肠杆菌感受 态细胞 ,转化 方法为 : 将浓度为 10 ng/ μl 的重组克隆载体 5 μl 加入到细胞 密度为2 ×109 的感受态细胞 100 μl 中,冰浴 30 分钟,42 ?水浴热休 克 90 秒,立即冰浴 2 分钟,再加入液体 LB 培养基, 于温度 37?,150 r/min 振摇 1 小时,制得转化细胞; (4 )取转化 细胞涂 布于蓝 白斑筛选 培养基 平板上, 于温度 37 ?倒置过 夜, 从平板上随机 挑取数个白斑 , 接种到含氨苄青霉 素的液体 LB 培养基中 ,于温度 37 ?、150 r/min 振摇过夜, 碱 裂解法小量提取质粒,用 EcoR ?、Hind ?双酶切和 PCR 法鉴 定阳性克隆质粒,酶切方法为:浓度为 300 ng/ μl 的阳性克 隆 质粒10 μl 、浓度为20 U/ μl 的EcoR ?和Hind ?内切酶各1 μl 、10 ×缓冲液 3 μl 、双蒸水 补充至总 体积为30 μl ,置温 度 37 ?孵 育 4 小时, 酶切 产物进行琼脂糖 凝胶电泳,结果显示 两条 DNA 带,其中一条 约 500 bp ,与目的 片段大小一致;以经 双 酶 切 鉴 定 为 阳 性 克 隆 的 质 粒 为 模 板 , 采 用 兼 并 引 物 CytbF 、 CytbR 为上下游引物进行PCR 扩 增, 琼脂糖 凝胶电泳检测 PCR 产 物,获得一条约500 bp 的条带,与前面获 得目的条带一致。 (5 )斯氏狸殖 吸虫线粒 体 细胞色素b 基因 的序列测定 取前面所 得阳性 克隆质 粒,委 托上海生 物工 程技术服 务有 限公司测定插入片段的序列。 4 .4 同源 序列查找 利用 NCBI Blast 对实 验所得的 斯氏狸殖吸 虫 线粒体cytb 序列进行Blast 4 .5 cytb 序列分析与进化树分析 对 Blast 找到的 几 种 有亲 缘关系的 吸虫 线粒体 cytb 序列利用 MEGA4 计算遗传距离,采用 最大简约法 (MP ) 和邻位相 连法 (NJ ) 构建 系 统进化树,Bootstrap 法检验, 并Clusterx 软件对 这几种 吸虫 线粒 体cytb 序列进行多 序列对比,用 DNAsis 软件对实验所得日本 血吸虫和斯氏狸殖吸 虫cytb 片段序列进行序 列分析 实验结果 1 PCR 扩 增 结果 琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如附图 7 所 示, 其中1 泳道为PCR 分子 量标准(M),2 泳道 为 PCR 产物,从图可知 ,在约 500 bp 的位 置出现一条特异性DNA 条带,与理论 预测值 相符; 图 7. 斯氏狸殖吸虫cytb PCR 扩增 结果 Fig 2. PCR amplification of cytb gene of Paragonimus skrjabini 2 测序结果 斯氏狸 殖吸 虫 cytb ,共 542bp 。 上海申 工公司 的测序 结果 : GGTTGCTTGATCATAACATTGGGTCGGGTCATGTCAAATGG CTGATTGGTTAAAATATTCCAGATCTCTGTAATTCATTTTTGA TGGGTAGTGTAGTGTACGGAACTGGGAACAAAATTTGAAT GTGGAGACTGAGCATACGGACATCTTAAGCCATCTTGGGAC GCAGAAACGTACTTTGACGTAGAAAATCGGTGAGTTCCAA ACTAGCTTGTAGGCGGGAACGATGGCTGGTTGTCGGCGGT GTTGATGCTGTTGAATACCGTGGCTCTGGATGATCCATGAG GTAACTTGTCCATCTAAACTGTGTGTCATCAACAGAGAGTT TATAAGTCAACTCACATTTGAGTTTTAAAACACAACCGGAC GCGTTCAGTTCGGTCTGGGAGGTTCGACACACTGGTGTGTT AACAGTTTCTCTCCAGGTGACCTTCGAGAAAATGGTGACG TAAGAAATGGTGTTCAGTTGAAGTCGGATCGGAAACTTGTT GATAAACATCGTGAGTTATTATCGTCGATCTACAAGGTCGAC CCAGAGTGTC 3 根据该基 因片段设计出一对斯氏狸 殖吸虫 线粒体 cytb 基因片 段的特异引物 CytbF: 5 ′GGTTGCTTGATCATAACATTGG 3 ′CytbR: 5 ′GACACTCTGGGTCGACCTTG5 ′ 4 . 序 列遗 传系 统进 化树 构建通过在 Genebank 数 据 库中 Blast 发现, 斯氏狸 殖吸虫 的 此段cytb 序列 与日本血吸 虫(中 国流行区 虫 种) 、异盘 并殖吸 虫、 哈 氏并殖吸虫 、 卫 氏 并 殖 吸 虫 以 及 斜 睾 吸 虫 等 有 相 似 性 , 与 相 关 吸 虫 虫种 的 线粒体 细胞色素b 序列同源性比较分 析, 分 析结果显示, 该序列 与相关吸虫虫种, 如曼氏血吸 虫、 肝片形 吸 虫的线粒体 细胞色素 b 存在较高同源 性(分别为 78.2 ,68.4)。 一共搜索 到 9 种 与 斯氏狸 殖吸虫线 粒体 cytb 具 有同源 性的虫 种 ,它 们的 NCBI.ID 如下表(表 1)。 表 1. Genebank 数据库检索的 吸虫虫 种的 NCBI ID : Table1. NCBI ID of fluke from Genbank database 利用 MEGA4 软件 对这 10 条序列 进行核 酸分析 ,结果 如表 2、3 表 2 : 表3 : 对其中 7 个 虫种cytb 序列利用生物 信息学 软件 MEGA4 进行遗传 系统进 化 建树分 析,分 别采 用 邻位 相连 法(NJ ) 和最 大简约 法(MP )构建 系统 进化树 , Bootstrap 法检验 所得遗 传系统 进化树 如图 8 , 由图可 知 通过线粒体 cytb 基因的 生物信息 学分析 斯氏狸 殖吸虫 与日本 学习虫 的亲缘 性最 近。(1 )NJ 法构建遗传进化 系统树(2 ) MP 法 构建遗 传进化 系统树 Ps : 本实验 获得的 斯氏狸 殖吸虫cytb 序列 Fig 8. Phylogenetic tree of cytb genes of Paragonimus constructed with MP and NJ method (1 ). The method of NJ;(2 ). The method of MP; 实验二 斯氏狸殖吸 虫5 个虫期cDNA 的获得。Realtime PCR 法 分析斯氏 狸殖吸虫 5 个虫期线粒体 cytb 基因的表达 情况并分析 与其致病 的关系。 1 实验材料云南威信 县扎西镇桂花乡元盛店村 采集溪 蟹, 解剖镜下分离 囊蚴。 图 9-1 流行区采 集锯齿 华溪蟹 和分离 囊蚴 Fig9-1 Sinopotamon denticulatum collected from endemic areas and examining metacercaria 腹腔注射感染 SD 大鼠(30 ?2 个囊蚴/只 ,购自泸州医学院实 验动物房)20 只和家犬(100 ?5 个 囊蚴/ 只)6 只。感染后第 30 天采血处死10 只 SD 大鼠, 检获童虫; 感 染后第60 天采血处 死10 只SD 大鼠, 检获幼虫 ; 感染后第 90 天 麻醉处死6 只家犬, 检获成虫。通过对囊蚴、虫体的形态 观察鉴 定虫种图 9-2 斯氏狸殖 吸虫 成 虫(A 为 活体成 虫;B. 为酸 性伊 红染色的 成虫) Fig9-2 Adult worm of Pagumogonmus skrjabini (A. Living adult worm of P.skrjabini B. Stain adult worm of P.skrjabini with eosin ) 2 主要试剂 (1 )1 ‰无菌DEPC 水( 第三军医大学寄生 虫实验室配置) (2 ) 无水 乙醇 成都市 科龙化 学试 剂厂 (3 )Trizol 购自美 国 Invitrogen 公 司。 (4 )RT-PCR 试剂盒 ,PCR 试剂 盒 购自 TaKaRa 公司。 (5 )三氯 甲烷( 成都 市科龙 化学 试剂厂 ) (6 )异丙 醇 ( 成 都市科 龙化 学试剂 厂 ) (7 )75 %乙醇( 第三军医大学寄生虫实验室配置) (8 ) 反转录试剂盒 (宝生物工程(大连) 有限公 司) (9 ) Ex Taq 酶 大连 TaKaRa 公司 (10 ) DNA Marker DL-2000 大 连 TaKaRa 公司 E.//.cle-Pure Kit 美 国 Omega 公司 (11 ) E.Z.N.A. Gel Extract Kit 美国 Omega 公司 (12 ) E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit 美国 Omega 公司 (13 ) 琼脂糖 西班 牙 Biowest 公司 (14 ) 溴酚蓝 上海生 工生 物技术 有限公 司 (15 ) PBS buffer:10mmol/L Tris ,150mmol/L NaCl ,HCl 调 pH 至 7.5 (16 ) PBS-Tween/Triton buffer :20mmol/L Tris ,500mmol/L NaCl , 0.05% Tween 20 ,0.2% Triton X-100 ,HCl 调 pH 至 7.5 (17 ) 2 ×SDS-PAGE Loading Buffer :100mM Tris HCl 调 pH 至 6.8 ,5% β- 巯基乙 醇,4% SDS ,0.125% 溴酚 蓝,20% 甘油 3 主 要 仪器 1 PCR 仪 美国 Bio-Rad 公司 170-9703 型 2 琼脂糖 凝胶电 泳装置 美国 Bio-Rad 公司 3 凝胶成 像扫描 仪 美国 Bio-Rad 公司 Universal Hood ?型 4 凝胶成 像结果 分析软 件 Quantity One 美国 Bio-Rad 公司 5 紫外分 析仪 江 苏海 门市其 林贝尔 仪器 制造公 司 GL-9406 型 6 洁净工 作台 苏 州安 泰空气 技术有 限公 司 SW-CJ-IF 型 7 低温高 速离心 机 美国 Beckman 公司 Avanti-J-25 型 8 小型离 心机 美国 Sigma 公司 1-1S 型 9 恒温金 属浴 美国 Thermo 公司 CHB-202 10 电子天 平 北京 赛多 利斯仪 器系统 有限 公司 BS224S 型 11 紫外分 光光度 计 美国 Beckman 公 司,DU-640 型 12 核酸蛋 白检测 仪 上 海沪西 分析仪 器厂 HD-2 13 微型漩 涡混合仪 上 海沪西 分析仪 器厂 有限公 司 WH-2 型 4 实验方法 4 .1 斯 氏狸 殖吸 虫 囊 蚴、30 天童 虫、60 天 幼虫 、90 天 成虫 及虫 卵 5 个虫期总 RNA 的 提 取 , 并 反转 录 为 cDNA 4 .1.1 器械 准备 枪头 、EP 管 、 匀浆 器等 ,1 ‰DEPC 水浸 泡过夜 , 然 后高压 烤干 备用。 玻 璃制品 泡酸 过夜, 冲洗干 净烤干 备用。 将异丙 醇、75 %乙醇 、 无水乙 醇 等提 前放入 冰箱 冷藏室 。 4 .1 .2 总 RNA 的 提取 每次 得到新 鲜虫 体时提 取。5 个 虫期 总 RNA 提取 方法 一样。 取 50 ??100mg 虫 体在 匀 浆器 中,用 无 菌 DEPC 水吹 洗 两遍, 然后加 入 1ml TRIzol , 吹 打两次 , 研磨 , 直 至看 不见明 显的固 体 (整 个过程 均在冰 上完成 ) 。室温 静置 5 min 后,将 匀浆过 后的溶 液移入 1.5mlEP 管 中,并 加入 0.2 ml 氯 仿,盖 紧样 品 管盖, 用力摇 晃 EP 管 15sec 并将其室 温下静 置 2-3min , 然后 4 ?12,000 ×g 离心 15min ,小 心提取 上层无 色水相 (RNA 溶 于此) 至另一 1.5mlEP 管中 , 加入 等 体积、 预冷的 异丙 醇, 轻 柔混 匀, 室温静 置 5-10min , 然后 4 ?12,000 ×g 离心 10min ,弃上 清,下 部白色 沉淀 为总 RNA 。 加预 冷 75 %乙 醇1 ml 洗涤 RNA ( 不要吹 打 ) ,4 ?7500 ×g 离心 5min , 弃 上清 , 晾 干(不 要晾的 太干, 否 则 RNA 将 不再 溶解 ) , 加入 20μl 无 菌水溶 解 沉淀。NaroDrop 1000 紫外分光 光度仪 测 RNA 浓度。 4 .1.3 cDNA 的合成 按照宝 生物工 程 (大 连) 有限公 司 高效 率逆 转录 试剂盒 ReverTra Ace -α-cDNA 合成 cDNA 。 反应条 件:5 ×primescript Buffer 2μl Primescript RT Enzyme Mix1 0.5μl Oligo dT primer 0.5μl Total RNA 500ng (10μl 反应体系 最大值 ) Random 6 mers0.5μl DEPC 水 Xμl (加 至 10μl ) 总体积 10μl 反应程 序: 15min ? 37 ? ? 85 ? 5s NaroDrop 1000 紫外分光 光度仪 检测 cDNA 质量 。 4 .1 .4 各个 虫期 cDNA 的 PCR 扩增 前面根据 斯氏狸殖吸虫线粒体 cytb 基因片 段设计了一对 特异引 物 CytbF: 5 ′ GGTTGCTTGATCATAACATTGG 3 ′ CytbR: 5 ′ GACACTCTGGGTCGACCTTG5 ′ 25 μl 的反应体系:TaKaRa Ex Taq5U ? μl0.5 μl 10 ×Ex Taq BufferMg2 +Free2.5 μl MgCL225Mm 2 μl dNTP Mixture 各 2.5Mm2 μl 灭菌dd H2O 15 μl 引 物CytbF1 μl 引物CytbR1 μl 模板 1 μl PCR 扩 增条件为:94 ?预变性5 分钟,1 个 循环; 然后94 ?变性 1 分钟,48 ?退火30 秒,72 ?延伸1 分钟, 共35 个循环; 最后 72 ?延伸10 分钟。1 %琼脂糖凝胶电 泳鉴定 。 4 . 2 Realtime PCR 法分析斯氏狸殖吸虫 5 个虫期线粒体 cytb 基因 的表达情况 根据 Realtime PCR 引 物设计 要求 ,由上 海赛百 盛公司 设计并 合成引 物。 特异引 物 5'- GGTTGCTTGATCATAACATTGG -3' 5'- GACACTCTGGGTCGACCTTG -3' 内参引 物 5'-TGGTTGATCCTGCCAGATGTCATATGCTTG -3' 5'-GTCCTTGGATGTGGTAGCCATTTCTCAGGC -3' 内参引 物:根 据吸 虫 18S rDNA V4 区 设计。 取 5 个虫 期 cDNA 进行 SYBR Green I 荧光 定量 PCR ,按照 TOYOBO 反应试 剂盒 进行:2 ×SYBR 10μl ,上 、下游 引物 各 0.8μl , 模板 2μl , 无 菌 水 6.4μl , 总体 积 20μl 。 反 应程 序为:95 ? 1min;95 ? 15sec 、60 ? 15 sec 、70 ? 42 sec ,40 个循 环 。 反应结 束后 , 数据 分 析软件将样本的扩增曲线与标准曲线对比 , 并 结 合 内 参 自 动 计 算 出 各样本 的 mRNA 的 表达量。 结果 1 5 个虫期 RNA 、cDNA 浓 度值 NaroDrop 1000 紫外分光 光度仪 检测 RNA 质量 : 虫期 ng /μl 260 /280 260 /230 囊蚴 150 .9 1 .87 0 .36 30 天童虫 164 .3 1 .80 0 .45 60 天幼虫 401 .8 1 .84 0 .76 90 天成虫 305 .4 1 .81 0 .82 虫卵 690 .2 1 .84 0 .90 NaroDrop 1000 紫外分光 光度仪 检测 cDNA 质量 : 虫期 ng /μl 260 /280 260 /230 囊蚴 1413 .2 1 .84 1 .72 30 天童虫 2264 .8 1 .81 1 .51 60 天幼虫 2063 .2 1 .87 1 .23 90 天成虫 3407 .6 1 .86 1 .07 虫卵 1367 .3 1 .85 1 .21 2 5 个虫期 cDNA 的 PCR 扩 增 结果 分别取 8μl 经 1% 琼脂 糖凝 胶 电泳 可见 PCR 产物扩 增 成功 结果如图 10 : 图 示线 立体 cytb 除了 虫卵期 无表达 ,其他 虫期均 有表达 。 图 10 PCR 产物扩增 结果 cytb 不同时期的 表达 (1 : DNA marker DL2000 2-4: 囊蚴期 5-7 : 30 天 童虫 期 8-10 : 60 天 幼虫 期 11-13: 成虫期 14-17: 虫卵期 ) Fig.10 Transcription cytb in the developmental stages1. DNA marker DL2000 2-4 metacercaria 5-7 larva-30d 8-10larva-60d 11-13adult 14-17:egg 2 Realtime PCR 结果讨论 线粒 体 基因 组 结构 简 单 和很 少 重组 等 特点 , 使 它成 为 研究 种 系遗 传的理 想工具 。 加 之线 粒体是 参与 了绝大 部分真 核生物 呼吸作 用的关 键细胞 器, 线粒 体基 因组的 蛋白表 达 对 这些生 物的 成 长、 繁衍 又非 常 重要, 对 它的研 究也 就不限 于 种系 遗传 方面, 这 几年对 吸虫线 粒体的 研究, 趋向于 研究吸 虫 线 粒体基 因在 吸虫疫 苗 、诊断 、治疗 的作用 。 之前对线粒体基因的研究绝大多集中在 细 胞 色 素C 氧化酶1 、2 、3 (COX1 、2 、3 ) 和NADH 脱氢酶基因亚基 ? (nad1 ) 上 , 对 线粒 体 细胞色 素氧 化酶bcytb 的研 究非 常少 ,但是cytb 在呼吸 链中 也有 重要 作用, 是 吸虫线 粒体 基因的 重要组 成比 分, 所以 本实验 就选择 了它作 为研究 目标, 通过 对斯氏 狸殖 吸虫线 粒体cytb 基 因的研 究 进一 步了解 斯 氏狸 殖 吸 虫 的遗 传 进 化 情况 , 并 通 过对 该 虫 五 个虫 期cDNA 的Real time PCR 实验 研究 线粒体cytb 基因 的表达 情况, 结合五 个虫期 对 宿主 不同的 侵害作 用, 分析斯 氏狸 殖吸虫 线粒体cytb 基因在 虫体侵 袭宿主 方面的 作用 , 为 以后斯 氏狸殖 吸虫 的疫苗 、 诊 断、 治疗方 面的 进一步 研究做 一个铺 垫。 因为 吸 虫的 线 粒体 基 因 都有 相 似性 , 日本 血 吸 虫的 线 粒体 基 因目 前已经 全部测 序出来 , 对它 线粒体 基因 的研究 也是目 前最多 的 , 所 以 本次试验在扩增斯氏狸殖吸虫线 粒体cytb 基因 时 选用了日本血吸虫 的线粒 体cytb 基因 设计出 一对 兼并引 物。 对于提 取斯氏 狸殖吸 虫线粒 体cytb 基因 过程中,比较重 要的 一些方 面有: ? 斯氏狸 殖吸虫 基因组 DNA 的 提取 ?实验 条件的 成熟, 特别是PCR 过程 中的退 火温度 的摸索 ?实 验 设备 条 件的 达 标 。 对 于第 一 个条 件 ,前 面图6 的第10 跑 道是 斯 氏 狸 殖 吸 虫 基 因 组DNA 的 电 泳 图 , 由 图 可 见 有7000bp 以上的大片段 DNA ,说明斯氏狸殖吸虫基因组DNA 的 提 取 很 成 功 。 第 二 个 条 件 , 经过 几 十次 的 预实 验 ,最 终 判断 退 火温 度 设定 为48 ?为最佳, 整个 实验条件为:94 ?预变 性5 分钟,1 个 循环; 然后94 ?变 性1 分钟 , 48 ?退火30 秒,72 ?延伸1 分钟,共35 个循 环;最后72 ?延伸10 分钟。 实验设备也不存在问题 , 整个实验均 是在第三军医大学完 成,PCR 仪 美国Bio-Rad 公司 170-9703 型 。 后 面 的 提 纯 、TA 克 隆 也是严 格按要 求进行 , 最后的 测序交 由 上 海申工 公司 , 成功 测得542bp 的基因 片段, 为后面 的实 验打好 基础 。 通过在 Genebank 数据 库中 Blast 发现,斯 氏狸殖吸虫的此 段这542bp 的cytb 基因片段 序列与9 个吸虫 的线粒体cytb 基因 序列有相似 性,虽 然相似性 都没有 超过 80 %,但并不 说明该片 段就不是线粒体cytb 基 因, 只能说明斯氏狸 殖吸虫的 cytb 基因 特异性比较大, 毕竟斯氏狸殖 吸虫 是我国的 独有虫种。 之后 对其 中 7 个虫种 cytb 序列利用生物信息学软 件 MEGA4 进行遗传系统 进化建树分析,分别采用邻位相连法 (NJ ) 和最 大简约法(MP ) 构建系统进化树,Bootstrap 法检验所得 遗 传系统进化树如图 8 , 由图可知通过线粒体 cytb 基因的生物信息 学分析斯氏狸殖吸虫 与日本学习虫的亲缘性最近。 这个结果与之 前大多数学者通过对 线粒体其他基因片段的研究结果非常 相似, 说明线粒体 cytb 可 以作为吸虫 遗传进化分类的依据。 Realtime PCR 技 术也叫 荧光定 量 PCR 技术, 是 在 常规 PCR 基础 上 添加荧 光染料 或荧光 探针, 利用 荧光信 号的 积累 实时监 测整个 PCR 进 程。 在 PCR 过 程中,DNA 扩增 成双 链时, 荧 光 染料能 够特异 地掺如 DNA 双链 并 发 出荧光 信号 ,没有 掺入 双链的 荧 光分子 不能发 出荧 光 信号, 保证 了 荧光信 号的增 强 与 PCR 产物的 增 加 是同步 的。Realtime PCR 就是通 过 分析 基因的 表达 调控、 监控 mRNA 表达模 式, 检测组 织中少 量存在 的基因 、 跟踪 细胞 群体中 克隆、 定 量分析 基因在 不同组 [1] 织中的 转录水 平等 。 本实 验通过 Realtime PCR 技术对线 粒体 cytb 在斯氏 狸殖吸 虫虫体 的发 育阶段 的表 达进行 研 究, 精确 的分析 了该 基 因在不 同虫期 的表达 情况, 并推 断该基 因在虫 体 不同虫 期对宿 主侵袭 的作用 及在今 后的应 用。 结论 1. 成功 扩 增出 斯 氏狸殖 吸虫 线粒体 cytb 的 542bp 基因片段 。 线粒体 cytb 基 因可以 作为 吸虫遗 传进化 分类 的 依据。 2. 斯氏狸 殖吸虫 线粒 体 cytb 基因在 其囊蚴 、30 幼 虫期、60 天 童虫期 和成虫 期均有 表达 , 在虫 卵期无 表达 。 即 从囊蚴 侵入 宿主要 发展成 成虫的 整个 时期均 在发 挥作用 。 参考文 献 1. 王利芳,张锡林,牛 靖萱,等。斯氏狸 殖吸 虫童虫、成虫排泄分 泌产物 的分析 研究。 热带 医学杂 志。2010 年 10 (6):633?636 。 2. 王利芳,张锡林。吸 虫排泄分泌产物成 分及 其功能研究。国际医 学寄生 虫病杂 志。2010 年 37 (5 ): 300-304 。 3. 牛靖 萱,张锡林 , 王利 芳,等。 免疫 组化技 术对斯 氏狸殖 吸虫成 虫免疫 诊断相 关抗原 的初 步研究 。 第 三军医 大学 学报, 2010 年 32 (7 ) : 654?657 。 4 .Wang LF, Zhang XL, Chen WB, et al. Preparation of colloidal gold immunochromatographic strip for detection of Paragonimiasis.Parasitology Research. In press 5 . 陈翠娥, 张悟澄. 我国 并殖吸 虫病 的防治 研 究进展[J]. 国际医 学寄 生虫病 杂志, 2009005: 323-3316 . Keiser J, Utzinger J. Emerging foodborne trematodiasis[J]. Emerg Infect Dis, 2005,1110:1507-147 . 李友 松. 我国 主要 并殖 吸 虫虫 种形 态特 征//沈一平. 实用 肺吸 虫学 [M]. 2 版. 背景: 人 民卫 生出版 社,2008.