超氧阴离子自由基致NIH3T3细胞DMA损伤与c—myc基因表达

超氧阴离子自由基致NIH3T3细胞DMA损伤与c—myc基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 超氧阴离子自由基致NIH3T3细胞DMA损 伤与c—myc基因表达 第22卷第3期 2000年6月 中国医学科学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAESINICAE VoI_22.No.3 June,2000 『. 起氧阴离子自由基致NIH3T3细胞DNA损伤与c—myc基因表达? 余斌李芸盛齐廖钢陵吴元=}/ (中国医学;—l中国协和医科大学基础医学研究所生物理室.北京100005)78(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所生物物理室.北京,/ 摘要目的研究超氧阴离子自由基(02'一)对NIH3T3细胞DNA的损伤及其脂质过氧化作用和对c-myc 基因表选的影响.方法用黄嘌呤一黄嗓呤氧化酶(xXO)系统产生0z一}测定DNA一澳乙锭结合物荧光强度变化 确定DNA损伤程度;以硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量;以细胞原位杂交法检测c—myc 基因表选.结果高荆量0:'一能直接引起DNA断裂损伤.0'一作用于完整细胞.MDA含量及DNA断裂损伤显 着增加.过氧化氢酵能明显抑制此效应.中,高剂量0'一能引起明显的c—myc基因表选.结论0.'一引起细胞 DNA损伤与过氧化氢的形成有关,其损伤的途径可能是通过膜腊质过氧化;O'一诱导NIH3T3细胞c—myc基因 表达与荆量密切相关. 关?词超氧阴离子自由基活性氧DNA损伤脂质过氧化基因表达 中圉号Q253Q两 DNADamageandc-mycGeneExpressionofNIH3T3Cell InducedbySuperoxideAnion YuBinLiYunShengQiLiaoGanglingWuYuande (DepartmentafBiophysics.InstituteolBasicMedicalSciences.CAMSandPUMCtBeijing100005,China) ObjectiveTostudytheDNAdamage,membranelipidperoxidation,andc-mycgeneexpres— sionofNIH3T3eellinducedbysuperoxideanion(O2' 一).MethodsThesuperoxideanion(O2'一) wasproducedbyreactivesystemofxanthine—xanthineoxidase(X—XO)andtheDNA— EBcomplex, malondialdehyde(MDA)contentandexpressionofc-mycgeneweremeasuredbymeansoffluo— rescence,thiobarbitoricacid(TBA)assayandDNA-RNAsituhybridizationwithdigoxigeninla— beledprobesrespectively.ResultsTheO2'一ofhighconcentration(X:20g,XO:2X10 一.U)re— actedwithisolatedDNAfromNIH3T3celldirectlywhichcausedDNAdamageobviously.When theO2一 ofhighconcentrationreactedwithwholeNIH3T3cell,theamouotofMDAincreased andfluorescenceintensityofDNA— EBcomplexdecreasedwhichmeanlipidperoxidationofmem- braheandgenedamageofthecellrespectively.WhentheproducingO2一 ofhighconcentrationre— activesystemexistingFeSO4,thephenomenamentionedaboveshowedobviously.Enoughamount ofcatalaseshowedtheinhibiteffects.butitcouldnotcompletelyinhibittheDNAdamageof wholecel1.Thec-mycgeneexpressionwasobservedintheeelltreatedwith02'一 ofmiddle(X:4 /tg,XO:4×10一'U)andhighconcentration,butitwasnotobservedinthecelltreatedwithO2' 一of lowconcentration(X:0.4g,XO:4×10U).ConclusionsDNAdamageofthewholecellin— ducedbyextracellularO2'一 wasabletoactthroughthepathwayofmembranelipidperoxidation inwhichhydrogenperoxideisimportantandtheotherpathwayssuchassignaltransductionof thecellmightalsobeexisted.Theexpressionofc-mycgeneofNIH3T3cellinducedbyO2'一 was relatedcloselyt0theconcentrationofO2一. ?国家自然科学基金(39670196)资助 SupposedbytheNationalNaturalSciencesFoundationolChinn(39670196)I#Correspondi ng authorTel:010—65296441.Fax:010—05240529 中国医学科学院22卷 Keywoldssuperoxideanion;reactiveoxygenspecies;DNAdamage;lipidperoxidatJon;gen eexpression ActaAcadMedSint2000,82(3):259,262 氧化应激损伤DNA导致细胞突变与肿瘤的发 生,发展密切相关.已有研究 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ,许多种类的活性 氧引发脂质过氧化后的产物可与提取的DNA反应 并导致损伤].但是对体内活性氧的重要来源超 氧阴离子(Oz一)与DNA损伤的关系,O.作用于 完整细胞,引发膜脂质过氧化,损伤细胞内基因组 DNA,影响细胞功能的研究尚鲜见报道.本研究采 用黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶(x—XO)反应系统产生的 O一,以溴乙锭(EB)作为荧光探针,检测DNA断 裂损伤程度,并在完整NIH3T3细胞水平,研究 Oz致膜脂质过氧化,诱导基因组DNA损伤及其 对细胞c—myc基因表达的影响. 材料和方法 材料与仪器NIH3T3细胞由本所细胞生物室 惠赠.x,EB,过氧化氢酶(cAT),硫代巴比妥酸 (TBA)为Sigma公司产品;XO,地高辛标记检测试 剂盒为BoehringerMannbelm公司产品;四乙氧基 丙烷为Fluka公司产品;其余试剂均为国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯 级.荧光分光光度计为日本HitachiMPF一4型;紫外 分光光度计为Shimadzuv一1206型;高速分散器为 上海XHF一1型;双光束薄层扫描仪为EI本Shi— madzuCS一910型. .细胞培养NIH3T3细胞在37?,含5CO 的孵箱中培养,培养基为DMEM(含10灭活小牛 血清,100U/ml青霉素和100/xg/ml链霉素,pH 7.2,7.4). O:一的产生用D—HankS液配制浓度为 0.2的x液,以NaOH促溶;xO用D-Hanks液 制备成1U/ml母液备用;以化学发光法确定一定量 O.的发光值,检测每次实验O产生的均一性. DNA提取和测定采用酚一氯仿抽提法口].测 定波长为260,280nm处光密度值,然后计算DNA 纯度和浓度. 测定o2损伤NIH3T3细胞中提取的DNA O一直接作用于提取的细胞DNA,实验分成6组, 每组取20ugDNA,溶入总体积为200vl的0.2 mol/LPBS(pH7.0)中,分别加入:(1)正常对照,未 加任何作用物;(2)低剂量O(由加入0.4ugx, 4×10UXO产生);(3)高剂量O一(由加入20 gx,2×10UXO产生);(4)高剂量O2一+20U 超氧化物歧化酶(SOD)+0.1mmol/LFeSO;(5) 0.1mmol/LFesO';(6)高剂量O2'一+20u sOD+0.1mmol/LFeSO4+50vl大鼠肝微粒体, 该组DNA改为最后加入.各组在37?温育120 min后加入10PgEB,再温育15min,以0.1×SSC (pH6.8)溶液稀释至2.0ml,以520tim为激发波 长,测定600Elm时的DNA—EB结合物的相对荧光 强度. 0:'一作用于完整的NIH3T3细胞后MDA含量 及DNA损伤的测定实验分成7组,在含有1o个 细胞的lm1培养基中,各组分别加入:(1)正常对 照,未加任何作用物:(2)低剂量O一;(3)高剂量 O.一;(4)高剂量O2一+20USOD+0.1mmol/L FeSO}(5)0.1mmol/LFeSO4;(6)高剂量O2+ +0.1mmol/L 0.1mg/mlCAT;(7)高剂量O2一 FeSO4+0.1mg/mlCAT.各组在37?温育5h 后,以高速分散器(2000r/rain,10S,3次)分散细 胞,以TBA法测定MDA含量?].DNA损伤测定实 验分组及处理过程同上.各组在37?温育5h后, 提取细胞基因组DNA,直接在含有2oPgDNA的 200vl0.2mol/LPBS(pH7..)中加入1OugEB,温 育15rain.荧光测定方法同前述. 0:一作用于完整的NIH3T3细胞检测c—myc 基因表达在含有10个细胞的1m1培养基中分别 加入高,中(由加入4Pgx,4×10UxO产生),低 剂量O一,37?温育不同时问后以地高辛配基标 记的c—myc基因探针进行原位杂交_6],并对杂交显 色斑点结果进行薄层扫描分析. 统计学处理数据以平均值土 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差(i土)表 示,组问差异的显着性采用t检验分析. 结果 0:一对NIH3T3细胞中提取的DNA的损伤作 用加入高剂量O及同时加入SOD,FeSO和 SOD,FeSO,微粒体3组,DNA—EB结合物荧光强 度较未经O作用的对照组显着降低,低剂量 O.及采用FeSO作用组DNA—EB结合物荧光强 度虽比对照组降低但差异无显着性(表1). 0:'一作用于完整NIH3T3细胞后测定MDA含 量及DNA损伤低剂量O.及单独FeSO作用 组MDA含量及DNA—EB结合物荧光强度与对照 3期超氧阴离子自由基致NIH3T3细胞DNA损伤与c—myc基因表达261 组相比无显着差异.高剂量O.作用后MDA含量 显着增加,DNA—EB结合物荧光强度皿显着降低, 高剂量O'一+sOD+FesO作用组,上述变化更为 剧烈.在高剂量O.一+CAT作用组,MDA含量与 对照组相比差异无显着性,但DNA—EB结合物荧光 强度仍有显着降低(表2). c—mye基因的表达低剂量O2',作用15和60 min,c—myc基因基本无表达;中剂量O.'一作用60 rain,有明显表达;而高剂量O'一作用15mln后即 有明显表达,60rain后表达甚微(图1,2). 衰I各种反应物作用后DNA—EB结合 物相对荧光强度值变化 Table1RelativefluorescenceintensityvalueofEBcorn— binedwithisolatedNIH3T3cellDNAreacted withvarioussubstances在土,n=4) Rehtive fluorescente CDlltrel 0.4X+4×l0一UXO 20gX+2×10aUXO 20ttgX-b2×10,UXO+SOD+FeSO' FeSO? 20gX+2×10UXO+SOD +FeS0.+mic~me *P(咀05t**尸<0-01comparedwiththecontrolgroupt SOD:superoxJdedmu蛆se,2OU/ml;FeSO…01mmol/LEM/- cr.0H;55{x:xanthine}XO}xanthineoxidase 圉1地高辛配基标记的c—myc基因探针与低浓度o.一 作用的NIH3T3细胞原位杂交RNA斑点扫描吸收 分析 Fig1Ahmr~nceofscreeningthedotblotofsituRNA hybridizationwithdigoxigenin—lahledc—myconce— geneprobesintheNIH3T3cellpretreatedwkh o2一oflowconcentration 1.control2.ceiltreatedwithO2一0f10wconcentration aftersixtyminutesI3.celltreatedwithO2'一0flowcon— eentrationafterfifteenmirilltes 圉2地高辛配基标记的c—myc基因探针与不同浓度o.'一 作用的NIH3T3细胞原位杂交RNA斑点扫描吸收分析 Fig2Abs0rbanceofsc~emngthedotblotofsltuRNA hybridizationwithdigoxigenin-labledc-mycOnCO~ geneprobesintheNIH3T3cellpretreatedwith o2'ofvariousconcentrations 1.control{4.celltreatedwith02一otmidd/ec0ent憎t_啪 aftersixtyminutesI5ceiltreatedwith02一middlecon- centratlonalterfifteenminutesI6.celltreatedwithOz一0f highcOncemr丑t均naftersixtyminutesI7.celltreatedwith Oz'0fhcortcentratlonafternfteenminutes 8三g三《 854224 士士士士士士 235833 197790}} B卫g量《 中国医学科学院22卷 表2各种反应物作用后细胞MDA含量及DNAEB结合物相对荧光强度值 Table2MDAcontentaadrelative4~3ogescenceimensityvalueotEBcombinedwithDNA ,一4) whichwereisolatedfromwholeNIH3T3cellpretreatedbyvarioussubstances(j士P<o.05,*P<o-01comparedwiththecontrolgroupFSOD:20U/mHFeSO4:0.1mnml/ LFCAT:catalase(O.1mg/mi) 讨论 一 些实验表明O:'和HO.不能与DNA发生 反应口].但本实验结果显示高剂量O.'一直接作用于 DNA时,DNA—EB结合物荧光强度显着低于对照 组,这可能是细胞染色体上存在铜离子促使O.' 歧化生成的HO经过Fenton反应生成羟自由基 (?OH)后引起的DNA断裂所致在有一定量的 SOD和亚铁离子条件下,?OH产生的更多,引起 DNA断裂损伤更为显着.高荆量的O.'一经过SOD 歧化及由Fenton反应作用肝微粒体诱发脂质过氧 化的产物也能造成DNA明显的断裂损伤 高荆量O'作用于完整的NIH3T3细胞后 MDA含量显着增加,DNA—EB结合物荧光强度明 显下降,提示细胞膜受到脂质过氧化损伤,及细胞内 DNA链发生损伤断裂.Fe加重这种作用及足量的 CAT可以明显抑制这种损伤效应, 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 O'歧化 生成的H.Oz经Fenton反应产生的?OH与细胞膜 及胞内DNA的损伤密切相关.在CAT抑制效应 中,出现MDA含量维持在正常水平,而DNA—EB结 合物荧光强度显着降低,表明DNA仍有一定的断裂 损伤.提示O'对细胞内DNA的损伤除与反应生 成?OH造成细胞膜的氧化损伤密切相关外,可能还 存在着其它的作用途径,如影响细胞信号转导系 统I. 小剂量Oz'作用于NIH3T3细胞,未能观察到 cmyc基因表达,但在本室以往的研究中发现,小剂 量O'作用于NIH3T3细胞一定时间后,细胞可出 现恶性转化._,提示一次小剂量O'一作用于细胞不 足以引起c—myc基因过度表达,而反复多次的作用 则可能会引起c—myc基因的过度表达,调控细胞转 化.一次中剂量或高剂量O'作用于NIH3T3细 胞,均能在不同时间观察到cmyc基因的高表达.本 室另有研究发现,该剂量O.'一可促使NIH3T3细胞 凋亡In]有学者认为c—myc基因起双向作用,既调控 细胞增殖叉调控细胞凋亡呲3,故本研究中,高剂量 O'一引起c—myc基因高表达可能与调控细胞凋亡有 关. 参考文献 1WangYJ,HoYS,LoMI,eta1.Oxidativemodificationof DNAbasesinratliverandlungduringthemicalcarc1no— genesisandaging.ChemBiolInteractt1995.94:135— 145 2刘晓麒,曹恩华.脂质过氧化引起DNA损伤研究进展. 生物化学与生物物理进展,1994+12(3)}218—222 3曹恩华,刘晓麒,朱日荣.脂质过氧化对DNA的损伤研 究.生物物理,1994,10(1):68—74 4李尹雄.核酸的分离与纯化.见:卢圣拣主编.现代分子 生物学实验技术.北京:高等教育出版杜,1993.95 5SlaterTF.Overviewofmethodsusedfordetectinglipid peroxidation.MethodsErmymolt1984.105:283—288 6鲍家驹,沈德瑜,王瑞瑜,等.一种简便且灵敏的棱酸杂 交瓿方法——地高辛配基标记探针细胞原位杂交法应 用于原癌基因表达研究.中国医学科学院,1991,19 (6):439—442 7Arual~la0I,HalliwellB,GajewskiZ.eta1.Damageto thebasesinDNAinducedbyhydrogenperoxideandfer— tieionchalates.JBio[Chem,1989,264{20509—20512 8PrutzWA,ButlerJ,LadEJ.Interactionoftapper(I) withnucleicacids.IntjRadBiol,1990,68(2){215-234 9SuzukiYJ,FormanHJ.SevanionA.0xidantsa5stimu latorsofsignaltransduction.FreePadBiolMedt1997, 22:269-285 10房克忠,俞志宏,邱琦,等.超氧阴离子自由基对 NlH3T3细胞的转化作用.基础医学与临床,1996,16 (2):4952 11郭玲,薛安娜,王淑琴,等.氧自由基诱导细胞凋亡及硒 与维生素E的防护作用.营养,1999,21(2):163—167 1ZEvanGI,WyllieAH,GilbertCS,a1.Inductionotapop— tosisinfibroblastsbyc—mycprotein.Cell,1992,69:119 128 (1998—0630收稿)