鹰嘴豆_半乳糖苷酶的提取及其氨基酸组成研究

鹰嘴豆_半乳糖苷酶的提取及其氨基酸组成研究 鹰嘴豆 2半乳糖苷酶的提取 Β ? 及其氨基酸组成研究 ?? 李绪渊朱宗祯涂伟霞马建泰孟延发 () 兰州大学化学系 兰州 730000 ()【摘 要】 从鹰嘴豆种子中分离到 3 种 2半乳糖苷酶 酶l|I 、酶 和酶, 。 将酶l|I 和 ?Β 酶? 纯化后, 其比活力分别提高了 19 倍和 48 倍, 测得它们的表观分子量分别为24 000和 58 000。酶l|I 含 18 种氨基酸, 171 个氨基酸残基; 酶 含 16 种氨基酸, 305 个 ? () () 氨基酸残基; 后者的组氨酸和脯氨酸 含量为 0。H is P ro 【关键词】 鹰嘴豆 Β2半乳糖苷酶 分离提纯 氨基酸组成 【分类号】 551Q ( ) 2半乳糖苷水解酶, . 3. 2. 1. 23广泛存在于豆类及其他动植物物体 2半乳糖苷酶 2ΒΒD EC 〔1, 2〕内。由于它具有糖苷键结构特异性, 可作为乳糖降解和双糖合成催化剂, 并有水解生物体内 〔3, 4〕储存的多糖和半乳糖残基、引起血型转化等生理功能, 近年来引起人们广泛关注, 成为生物 化学和酶催化化学的重要研究课题; 然而, 有关植物鹰嘴豆 2半乳糖苷酶及其组成的研究, 迄 Β () 今未见报道。我们从鹰嘴豆种子中分离得到了 3 种 2半乳糖苷酶 酶l|I 、酶? 和酶, , 就其中Β 酶l|I 和酶 进行了纯化, 并测定了它们的表观分子量, 对其氨基酸组成进行了系统分析, 为深? 入研究该酶的结构和性能给出了必要的基础信息。 1 实验部分 1. 1 物料与试剂 () 鹰嘴豆购自甘肃省土特产公司; 邻硝基苯酚222半乳糖苷 , 对硝基苯酚222半 ΒD ON P G ΒD () 乳糖苷 , 考马斯亮蓝 2250 为 公司产品; 2纤维素232, 2纤维素252 为 PN P GR S igm a D EA E CM 公司产品; 2200 为 产品; 其他试剂均为国产 W h a tm an Sep h adex G P h a rm ac ia F in e C h em ica ls 分析纯。 1. 2 酶活力测定 () 根据文献〔5〕, 以 2半乳糖苷酶催化水解底物生成邻硝基苯酚 为指示反应,ΒON P G ON P - 3- 3( 含 0. 1 ?5. 柠檬酸缓冲液, 5 ?和酶 5 0 反应液总体积 0.m l m o ldm pHmm o ldm ON P G - 3 ) 液, 50?准确反应 20 , 加入 1. 5 0. 5 ?终止反应, 于 405 处测定 m in m l m o ldm N a2CO 3 nm () () 吸光值, 以改变 0. 01 个吸光度值定义为一个酶活力单位 , 以每毫克蛋白酶所具有的酶活 u 力单位数表示酶的比活力, 纯化倍数即酶的比活力提高倍数。 ( ) () ?国家自然科学基金29573107和甘肃自然科学基金29资助项目 A ?通讯联系人 收稿日期: 1996- 05- 15 1. 3 蛋白质分析 〔6〕蛋白质含量测定采用 法, 用 751 型紫外分光光度计测定 280 处的吸光值, 以 low ry nm () 牛血清白蛋白作 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。B SA 1. 4 酶的分离纯化 鹰嘴豆种子经浸泡, 在 25?暗室培养 7 后, 取根部以上黄化苗, 加 2 倍体积的的6. 4 d pH - 3 - 3 ( ) 0. 01 ?磷酸缓冲液 含 1 ?2和 3% 甘油, 低温下高速捣碎, 置 m o ldm mm o ldm ED TA N a ( ) 冰箱抽提 2 , 过滤抽提液于 4?冷冻离心 77 000 . . 30 , 上清液用 30%, 70% 饱和 h rpm m in - 3 度的硫酸铵分级沉淀, 所得沉淀用 0. 01 ?的磷酸缓冲液溶解, 流水透析脱6. 4 m o ldm pH - 3 ?01 6. 盐, 适当浓缩后上入到已用 0.磷酸缓冲液平衡好的 2纤维素232 4 m o ldm pHD EA E - - 1 () () 柱 2. 4 ×25 , 1型, 用同样缓冲液洗脱 流速为 0. 4 ?, 分管收集并检测每 cm cm C m lm in - 3 管的酶活力得酶l|I 活力峰, 换用 0, 0. 6 ?的同样缓冲液进行直线梯度洗脱, 分 m o ldm N aC l 管收集并检测每管的酶活力得酶 和酶, 活力峰, 如图 1 所示。 ? 图 1 2纤维素232 柱层析洗脱曲线 2半乳糖苷酶活性ΒD EA E ) ) 处的吸收; 280 2半乳糖苷酶活性anm bΒ - 3由232 柱层析所得酶l|I 和酶 再经 0. 01 ?柠檬酸缓冲液透析, 适当 ?5. 0 D E m o ldm pH - 3( 浓缩后上入到已用 0. 01 ?柠檬酸缓冲液平衡的 2纤维素252 柱2. 4 ×5. 0 m o ldm pH CM cm + - 3) 24 , 型, 用 0, 1. 0 ?平衡缓冲液进行直线梯度洗脱, 分管收集并检测 cm N am o ldm N aC l 每管的酶活力, 得到纯化的酶l|I 和酶 , 如图 2 和图 3 所示。 ? 图 2 Β2半乳糖苷酶l|I 活性 CM 2纤 图 3 Β2半乳糖苷酶 活性 CM 2纤 ? 维素252 柱层析洗脱曲线 维素252 柱层析洗脱曲线 ) ) ) ) a280 nm 处的吸收; bΒ2半乳糖苷酶l|I 活性 a280 nm 处的吸收; bΒ2半乳糖苷酶? 活性 1. 5 分子量测定 〔7〕- 3() 采用凝胶过滤法, - 200 柱 1. 5 ×96 用 0. 01 ?磷6. 0 Sep h adex G cm cm m o ldm pH - 3- 1 () 酸缓冲液 含 0. 01 ?平衡, 流速 12 ?, 将不同分子量的标准蛋白上柱测 m o ldm N aC lm lh 6 ) (定各自的洗脱体积, 将表观分子量为 2×10上柱测定其洗脱体积, 以 ƒV e B lu e dex t ran V 0 V e 对作标准线; 同样, 将纯化的酶l|I 和酶 上柱测定其, 依其值及标准曲线 ƒ?V 0 L o gM r V e V e V 0 求其表观分子量。 1. 6 酶纯度检测 酶的纯度采用北京六一仪器厂 , 5 电泳仪检测, 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 依文献- D Y Y 〔8〕, 用垂重板电泳, 分离胶浓度 7% , 8. 8, 浓缩胶浓度 4% , 6. 8; - 聚丙烯酰胺凝胶 pH pH SD S〔9〕电泳, 按文献方法进行, 分离胶浓度 11% , 8. 8, 浓缩胶浓度 4% , 6. 8; 电极缓冲液浓度pH pH - 3 为 0. 025?, 8. 3; 电泳结果用岛津 910 双波长扫描仪扫描, 胶片用考马斯亮- m o ldm pH C S 蓝 染色。- 250 R 1. 7 氨基酸组成分析 - 3将纯化的酶l|I 和酶 用水渗析后, 冷冻干燥, 用 6 ?在 110?下水解 72 , 用 ?m o ldm H C l h 日立 853- 50 型氨基酸分析仪分析氨基酸组成, 按分子量换算各氨基酸在酶分子中的个数。2 结果与讨论 2. 1 酶的分离纯化 如前述实验步骤, 从鹰嘴豆种子分离提取 2半乳糖苷酶, 所得各步骤的分离纯化结果见表Β - 1 () 1, 由表内数据看出, 与原始抽提液相比, 经硫酸铵分级沉淀, 酶的比活力由 28 ?u m gp ro t - 1 () 提高为 40 ?, 纯化倍数为 1. 4, 酶活回收率为 67% ; 经2纤维素232 柱层析,u m gp ro tD EA E - 1 ()() () 得到三种 2半乳糖苷酶——酶l|I l|I 、酶 和酶, , , 比活力分别为 96 ??? ΒE E E u m g - 1 - 1 () () () , 45 . 和 44 ?, 酶活回收率分别为 19% , 32% 和 18% , 纯化倍 p ro tum gP ro tu m gp ro t 数分别为 3. 4, 1. 6 和 1. 6; 酶l|I 和酶 再经 2纤维素252 柱层析, 得到纯化倍数为 19 和 48 ?CM - 1 - 1 () () 的酶l|I 和酶 , 它们的比活力高达 518 ?和 1 353 ?, 酶活回收率为?u m gp ro tu m gp ro t 〔10〕 16% 和 18% , 纯化倍数与提取 2半乳糖苷酶的文献值相仿, 而方法步骤较之简练。B isw a sΒ 表 1 鹰嘴豆 2半乳糖苷酶分离提纯步骤及结果Β 酶液体积总活力总蛋白比活力纯化倍数活力回收率 分离提纯步骤- 1 ()?- 33u m gp ro t 10u m g % dm 原始抽提液700 9 160 329 28 1 100 硫酸铵分级沉淀 34 6 120 153 40 1. 4 67 232 层析 l|ID EA E E 61 1 750 18. 3 96 3. 4 19 ?E 130 2 938 65 45 1. 6 32 40 1 624 37 44 1. 6 18 ,E 83 1 450 2. 8 518 18. 5 16 252 层析 l|ICM E E 89 1 624 1. 2 1 353 48. 3 18 ? 纯化的酶l|I 和酶 经聚丙烯酰胺凝胶电泳, 考马斯亮蓝 染色, 均显示单一条蛋白 ?- 250 R 着 色带, 如图4所示; 另以聚丙烯酰胺凝胶电泳, 考马斯亮蓝染色, 亦显示单一- - 2 5 0SD S R 条蛋白色带, 这就表明, 纯化的酶l|I 和酶? 是两 种均一的 2半乳糖苷酶, 并且是由单一条多肽 Β 链构成; 亦表明本文所用的分离纯化方法能够 得到足够纯的 2半乳糖苷酶。Β 2. 2 酶的分子量 凝胶过滤法测定纯200 采用 - Sep h adex G () 化的 2半乳糖苷酶l|I l|I 和 2半乳糖苷酶 ?ΒE Β () 的分子量, 所用已知分子量的标准蛋白 ? E 及由实验所得工作曲线如图 5 所示, 依工作曲 线, 实验测得酶l|I 和酶 的表观分子量分别为? 纯化的 2半乳糖苷酶l|I 和 图 4Β 4 4 2. 4×10 和 5. 8×10 , 后者与虹豆中该酶的分的聚丙烯酰胺凝胶电泳扫描图 ? 〔11〕 子量相同。 鹰嘴豆 2半乳糖苷酶氨基酸组成 表 2Β ( ) 氨基酸浓度% 氨基酸残基数 氨基酸E l|I E E l|I E ?? ()天门冬氨酸 9. 4 8. 2 16 25 A sp ( ) 酥氨酸7. 6 4. 6 13 14 T h r () 丝氨酸13. 45 6. 9 23 21 Se r () 8. 2 8. 5 14 26 谷氨酸G lu () 甘氨酸10. 5 9. 5 18 29 G ly ()丙氨酸7. 6 8. 5 13 26 A la 2半乳糖苷酶分子量测定工作曲线 图 5Β() 4. 7 9. 2 8 28 缬氨酸蛋V a l 44)) ( ( ) ) 1细胞色素 ×10 1. 252胰凝乳蛋白酶原2. 5×10C () 氨酸异亮2. 9 4. 9 5 15 M e t44) ( ) ) ( ) 3鸡蛋清蛋白4. 5×104牛血清白蛋白6. 8×10( )氨酸5. 3 5. 6 9 17 Ileu 44) ( ) ) ( ) 5醛缩酶15. 8×106过氧化氢酶22×10() 3. 5 5. 6 6 17 亮氨酸酪L eu l|I 纯化的酶l|I? 纯化的酶?E E ( ) 氨酸苯丙1. 2 3. 0 2 9 T y r ()3. 5 8. 5 6 26 氨酸P h e () 4. 7 3. 6 8 11 赖氨酸L y s 2. 3 氨基酸组成 () 1. 8 0 3 —组氨酸H is () 测定纯化的鹰嘴豆 2半乳糖苷酶l|I l|I ΒE 2. 9 3. 6 5 11 ()精氨酸A rg ( ) () 4. 1 6. 2 7 11 和 2半乳糖苷酶? ? 的氨基酸组成, 所得 胱氨酸ΒE C y s ( ) 4. 1 6. 2 7 9 色氨酸T ry结果见表 2, 由表 2 数据看出, 2半乳糖苷酶l|I Β 8 —()4. 7 0 脯氨酸P ro 含 18 种氨基酸, 171 个氨基酸残基; 而 2半乳Β 171 305 氨基酸残基总数 糖苷酶? 含 16 种氨基酸, 305 个氨基酸残基。 它们的氨基酸残基数之比 171ƒ305= 0. 56 与它 们的分子量之比 24 00058 000= 0. 41 相近而又有所不同, 这是由于它们所含不同氨基酸残基 ƒ () 的式量及个数不尽相同所致, 酶l|I 中含量最多者为系氨酸 , 23 个残基, 含量 13. 5% , 其次Se r () () 是甘氨酸 , 18 个残基, 含量 10. 5% , 天门冬氨酸 , 16 个残基, 含量 9. 4% , 谷氨酸G ly A sp ( ) () () , 14 个残基, 含量 8. 2% ; 其组氨酸 和酪氨酸 含量最少, 分别只有 3 个氨基酸 G lu H isT y r ( ) 残基和 2 个氨基酸残基, 酶 中含量最多者甘氨酸 , 29 个残基, 含量 9. 5% , 缬氨酸 ?G ly () ( )()() , 28 个残基, 含量 9. 2% , 其次是谷氨酸、丙氨酸 、天门冬氨酸 和苯丙氨 V a lG lu A la A sp () () () 酸; 其组氨酸 和脯氨酸 含量为零。本文鹰嘴豆 2半乳糖苷酶l|I 的氨基酸组成P h eH isP ro Β 〔12〕〔13〕胡萝卜素中 2半乳糖苷酶相近, 而与微生物来源的 2半乳糖苷酶不同, 这可能与不同酶 ΒΒ 来源的种属不同有关, 尤其是动植物两大酶源的种属不同之故。 参 考 文 献 1 B ak e r A , T u rne r N J , W ebbe r ley M C. T e t rah ed ro n: A stmm e t ry, 1994, 5: 2517 , , 1995, 55: 8712 R e jik um a r SD ev i S J A pp l Po ly Sc i , , . . , 1979, 254: 54583 M ue lle r T J L i Y T M o r r iso n M JB io lC h em , , , . . 1979, 254: 54584 F uk uda M M F uk uda M H akom e r i S I J B io lC h em 5 , , . . , 1970, 116: 207M ich e l R H Ka rno v sk y M J Ka rno v sk y M IB io ch emJ 6 , , , . . , 1951, 193: 265L ow ry O H Ro seb ro agh N J F a r r A L e t a lJB io C h em , . . , 1964, 121: 4047 D av is B J A nn N YA cadSc i 8 , , . , 1962, 195: 281R e isfe ld R A L ew is V J W illiam s D EN a tu re . , 1970, 227: 6809 L aemm li U KN a tu re . , 1987, 2: 35910 B isw a s T KP h y to ch em ist ry . , 1985, 12: 283111 B isw a s T KP h y to ch em ist ry 12 , . , 1988, 3: 1301Ko nno H Ka to h KP h y to ch em ist ry , l|I , . : 1977, 74: 507Fow le r A V Zab in P ro c N a t l A cad Sc iU SA 13 STUD IES O N EXTRACT IO N A ND AM INO AC ID COM PO S IT IO N O F - ΒGAL ACTO S ID A SE FROM C ICER A R IET INUM L i X u yu an Zh u Zo n gzh en T u W e ix ia M a J ian ta i M en Y an fa (), , 730000 D ep t of C h im is t ry L anz h ou U n iv e rs ity L anz h ou C h ina ()A BSTRACT T h ree K in d s o f Β2ga tac to sida se l|I 、 an d , w e re sep a ra ted f rom g ram ch ick en ? ( ) 30%, 70% —b ean b y amm o n ium su lp h a te f rac t io n a t io n sa tu ra t io n an d b y io n ex ch an ge ——32. l|I 2? ch rom a to g rap h y o n D EA E C e llu lo seΒGa lac to sida se an d w e re p u r if ied b y su b se2 ——52. qu en t ch rom a to g rap h ic sep a ra t io n o n CM ce llu lo seT h e ir sp ec if ic ac t iv it ie s w e re im 2 () 19 48 . p ro ved b y t im e s an d t im e s re sp ec t ive lyT h e app a ren t m o lecu la r w e igh t s M ro f th e tw o 24000 58000 . 2en zym e s w e re an d re sp ec t ive lyT h e am ino ac id com po sit io n o f Βga lac to sida se l|I co n sist s o f 18 K in d s o f am ino ac id s an d 171 am ino ac id re sidu e s,W h ile th a t o f Β2ga lac to si2 da se co n sist s o f 16 K in d s o f am ino ac id s an d 305 am ino ac id re sidu e s an d th e co n ten t o f ? .H ist id in e an d P ro lin e in th e la t te r is ze ro ( ) , 2, , KEY W O RD S c ice r a r ie t in um g ram ch ick en b ean Βga lac to sida seex t rac t io n am ino ac id com po sit io n 【作者简介】 李绪渊 男 甘肃静宁县人, 1938 年生; 1964 年毕业于兰州大学化学系物理化学专业, 现任兰州大学化 学系副教授、硕士生导师。 男 甘肃省兰州市人, 1951 年生; 1976 年毕业于厦门大学化学系催化化学专业, 现任兰州大学 朱宗祯化学系工程师。 男 甘肃省天水市人, 1962 年生; 1982 年毕业于兰州大学化学系, 1995 年获博士学位, 现任兰 马建泰州大学化学系副教授, 硕士生导师。 男 甘肃武威人, 毕业于四川大学生物系生化专业, 现任兰州大学生物系副教授, 硕士生导师。 孟延发