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基于rDNA ITS分析的假高梁鉴定方法.doc

基于rDNA ITS分析的假高梁鉴定方法

Rory程明
2018-04-04 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《基于rDNA ITS分析的假高梁鉴定方法doc》,可适用于综合领域

基于rDNAITS分析的假高梁鉴定方法福建农业(),,FujlanJournalofAgriculturalSciences文章编号:()一o基于rDNAITS分析的假高梁鉴定方法郭琼霞,黄可辉,虞谛,吴珍泉(福建出入境检验检疫局,福建福州福建农林大学,福建福州)摘要:通过对供试的假高粱和同属近似种拟高粱,明福号的rDNAITS区进行PCR扩增和RFLP分析,结果表明明福号,拟高梁和假高粱三者均有bp左右条带,而且假高粱在bp和bp附近均有两条谱带,而明福号,拟高粱在bp和bp附近只有一条清楚谱带与测序比对结果一致关键词:假高粱ITS区RFLP中图分类号:SO文献标识码:AApplicationofribosoralDNAinternaltranscribedspacertoidentificationofSorghumhalepenseGUQiongxiaI,HUANGKehui'YUYtin,WUZhenquan(FufianEntryExitInspectionandQuarantineBureau,Fuzhou,Fujian,ChinaFujianAgricultureandForestryUniversityFuzhou,Fujian,China)Abstract:ThePCRamplifiedITSfragmentswereanalyzedbyrestrictionendonueleasedigestion(RFIP)ResultsshowedthattheRFIPpatternsofShalepense(L)PerswhichyieldedtwobandsaroundbpandtwobandsaroundbpButsignificantlydifferentfromtheRFIPpatternsofSspandSpropinguum(Kunth)HitchewhichyieldedonebandaroundbpandonebandaroundbpTheresultswereconsistentwiththefactwhichShalepensehadtwoselectiveidentifysitesofPmaCwhileSspandSpropinguumeachhadoneThereforeitcoulddifferentiateSpropinguumSspandShalepense(L)PersbyPmaCIKeywords:Sorghumhalepense(I)persinternaltranscribedspacerrestrictionfragmentlengthpolymorphism假高粱Sorghumhalepense(L)Pets系高粱属(Sorghum)草本植物,为世界十大恶性杂草之一,也是我国禁止输入的危险性杂草当前,我国已加入WTO,植物及其产品的进出VI批次在不断增加,假高梁的检出机率也在不断增大因此,在植物及其产品进出口时,如何对其进行快速检测已成为我国检验检疫部门的一项重要课题虽然目前在假高粱的形态学n,细胞学等方面有了较深入的研究,但由于高粱属植物是异花授粉植物,假高粱与其近似种形态特征非常相似因此,本研究利用分子生物学技术对假高粱进行DNA分子鉴别,通过对高粱属假高粱及其近似种明福号(Ssp),拟高粱Spropinguum(Kunth)Hitche的核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增,对其扩增产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),寻找出可鉴别假高粱DNA的限制性内切酶,旨在建立一种快速鉴定假高粱DNA的分子标记收稿日期:初稿I修改稿作者简介:郭琼霞(一)女研究员,从事植物检疫工作基金项目:国家质量检验检疫监督总局科技项目(IK)方法材料与方法材料及试剂供试材料:假高粱(从美国格尔夫波特口岸进口大豆中截获),拟高粱(福建野生杂草)及明福号(福建农林大学驯化培育的牧草)使用试剂用于ITSPCR扩增的试剂均购自BIOASIA公司DNAMarkerI,Wide购自上海华舜生物工程有限公司ibpDNALadder购自Fermentas公司方法模板DNA的提取假高粱与其近似种拟高粱,明福号DNA的提取方法均采用文献的方法ITSPCR扩增采用Sun等设计的用于扩增rDNAITS片段的引物,由BIOASIA公司合成,其序列为:P:LACGAATTCATGGTCC第期郭琼霞等:基于rDNAITS分析的假高粱鉴定方法GGTGAAGTGTTCG一P:LTAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC,扩增反应体系总体积为ol,组成为ulddHO,l×PCRbuffer,uldNTP(mmo),ulTaq酶(Uul),lP(~mo),lP(~mo),ulDNA(约Ongl一)扩增反应程序为:预变性rain,C,rain,C,rain,C,rain,循环次,最后在C下延伸min扩增反应在Biometra公司生产的梯度PCR扩增仪上进行扩增产物电泳:取ulPCR产物在琼脂糖凝胶进行电泳(以bp分子量标准为参考,电压Vcm),经溴化乙锭染色后于凝胶成像处理系统(GIS一)上观察拍照限制性内切酶的确定对假高粱,拟高粱,明福号的PCR扩增产物进行回收,纯化,克隆与测序(均由BIOASIA公司完成)用DNAMANVersion软件对上述三者的rDNAITS区进行序列比对,其中部分序列比对结果见图根据序列之间碱基差异和已商品化的限制性内切酶的识别位点的特异性,酶切反应后的酶切片段的大小,数量,以及这些限制性内切酶在琼脂糖凝胶电泳上分离的程度,筛选出限制性内切酶PmaCI(识别位点为CACGTG,购自MBI公司)PlnaCI的酶切位点GTTGGGGCTGCCGGCGATTCGTGTCGGGCACAGTTGGGGCTGCCGGCGATTCGTGTCGGGCACAGTTGGGGCTGCCGGCGATTCGTGTCGCGCACATGGGCGACACTGGGCGACACTGGGCGACACTTAGTTGTTCTCGGTGCAGCGCCCCGACACGTTGCCGGCGCATCGGCCCTTTAGTTGTTCTCGGTGCAGCGCCCCGACACGTTGCCGGCGCATCGGCCCTTTAGTTGTTCTCGGTGCAGCGCCCCGA~ACGTG~CCGGCGCATCGGCCCTPmaCI的酶切位点l:明福号::拟高梁::假高粱图明福号,拟高粱和假高粱的rDNAITS区部分序列比对FigComparisonofrDNAITSgenesegmentsfromS,sp,SpropinguumandS,halepenseITS区PCR产物的限制性酶切分析酶切反应体系总体积ol,包含lddH,lo×PCRbuffer(含有TritonXlOO),ol限制性内切酶(OUul),lOulPCR扩增产物反应在下进行h酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后于凝胶成像处理系统(GIS一)上观察拍照结果与分析拟高粱的rDNAITS区进行PCR扩增,其产物电泳结果显示(图),三者均出现一条约为bp特异性的扩增带ObpbpDNA提取本研究对假高粱及其近似种DNA的提取,获得M:lObpDNALadd的DNA的ODODo在,范围内,质I明福号{:拟高粱{:假高粱CK:清水量浓度在o,ngl一范围内,说明符合PCR图假高粱及其近似种的DNAITSPCR扩增图谱扩增要求FigElectrophoresisofPCRproductswithrelatedrDNAITS区的PCR扩增speciesofSorghum利用特异性引物P,P对假高粱,明福号,福建农业第卷假高粱rDNAITS区的RFLP分析利用限制性内切酶PmaCI酶切明福号,拟高粱和假高粱的rDNAITS区,结果显示(图),除了均有bp左右条带外假高粱在bp和bp附近分别有两条谱带而明福号,拟高粱在bp和bp附近则只有一条清楚谱带这与假高粱在rDNAITS区有两个PmaCI酶切位点,而明福号,拟高粱在此区只有一个PmaCI酶切位点的结果一致(图),且各酶切谱带的大小与测序的结果一致说明根据PmaCI酶切电泳结果可以将假高粱与明福号,拟高粱区分出来ooooMtDNAMarkerIWide:明福号t拟高,藁I假高粱图PmaCI酶切图谱FigRestrictionfragmentpatternsofPmaCt讨论由于rDNA中的ITS区的高度重复性和一致进化性,rDNAITS区已成为一种探求科内,属内,种间的系统亲缘关系及其物种鉴别的重要分子标记Ngan等成功地利~RFLP技术对人参属种药用植物和种常见的人参伪品的rDNAITS进行了有效的鉴别Zhao等f运用rDNAITS序列鉴定了山姜属红豆蔻及其同属相似种丁小余等根据rDNAITS区对柬花石斛及其相似种植物和药材进行DNA分子鉴别包颖等a根据rDNAITS序列的RFLP分析快速,可靠地将稻属CD染色体组物种区别开来本研究通过对供试的假高粱和同属近似种拟高粱,明福号的rDNAITS区进行PCR扩增和RFLP分析,结果表明,此方法可以将假高粱与明福号,拟高梁区别开来,为我们提供了一种简便,快速鉴定高粱属假高粱及其近似种的可行方法,也为口岸杂草检疫鉴定提供快速,准确的检测方法和理论的科学依据参考文献:郭琼霞,黄可辉假高粱与其近似种幼苗形态鉴定研究初报口植物检疫,()t郭琼霞,郑伸坤假高粱与其近似种组织细胞结构解剖研究口植物检疫,,(){郭琼霞,黄可辉,虞赞等Sorghum属个近似种的DNA微量提取方法比较J植物检疫():SUNYSKINNERDZLIANGGH,etaPhylogeneticanalysisofSorghumandrelatedtansusinginternaltranscribedspacersofnuclearribosomalDNAJTheorApplGenetlNGANFSHAwPCBUTPH,etIMolecularAuthenticatlonofPanaxspeciesJPhytochemistry,,lZHAOzLZHOUKY,DONGHetsCharactersofnrDNAITSRegionSequnecceaofFruitsofAlplniagalangaandTheirAdulterantsJPlantamedlca,,l丁小余徐珞珊王峥涛,等柬花石斛及其相似种的DNA分子鉴别J中国中药杂志,,()tO】包颖葛颂根据核DNA的ITS序列的RFLP分析鉴定稻属CD染色体组物种J植物,()t(责任编辑:林树文)

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