qPCR的原理
原理
(1) PCR: Polymerase chain reaction. 是体外模拟生物的DNA 复制。需 要DNA 聚合酶，DNA
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，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP,
dTTP),以及适当的缓冲体系。
PCR 产物的增长形式为,N (如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N 是 循环数)。实际中，扩增效率不为100,。
Real time PCR 是定量PCR 的一种，当然是在PCR 的基础上发展出来的。(普 通)PCR 包含很多因素，属性，如:试剂，温度，循环数，程序，PCR 产物(扩 增子，amplicon)的量，扩增曲线(扩增子累积曲线)，掺错率，扩增子长度。 一般来说，人们关心的是扩增子的量。而real time PCR 主要利用的是扩增曲线 (amplification curve), 循环数;扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以 考虑。
普通PCR 是在扩增完以后，(无论多少个循环)，进行电泳，染色。对于判 断目的DNA 有没有，是出色的。但对于检测目的DNA 有多少分子(初始的时 候)，则勉为其难。因为PCR 的理想和实际仍相差一段距离。理论界普遍认为， PCR 的起始若干循环内，由于原料，酶的充足，抑制子(抑制PCR 的因素，如
即每个循环后扩增子 dNTPs 分解产生焦磷酸)的量少，PCR 可以是理想的——
增加一倍。然而到了一定时候，原料和酶相对于模板大大减少，抑制子浓度也相 对较高，PCR 的效率就会降低，直至为0。所以实际的扩增曲线是“S”型的， 而不是“J”型。
图2:扩增曲线。
理想:J 型，2N 方程。
实际:S 型。分为:不可检测期，指数期，平台期。
这个扩增曲线，据说最初是用以下办法得到的:配好若干(如40)相同的 PCR 体系，分别进行1，2，3……40 个循环，再用测OD 等定量方法来知道有多
少扩增子产生，作图。
由于对极少量DNA(1~数千,)的直接定量办法还没有，该扩增曲线的最初 若干循环，扩增子的量标为0，表示难以同背景干扰分开。
Real time PCR 同样不能直接测出初始DNA 的分子数，不过，它采用的数据 是在PCR 中期，比末期定量要准确。(更接近理想情况。)
(2)Real time PCR 的化学基础
real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质， 使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线
(如，图2，3)。
图3:real time PCR 的扩增曲线。 名词解释:
•Rn:一个反应管经n 次热循环后，测得的荧光强度。(Normalized with ROX-参比染料。) •Rn+:反应管含有模板DNA。
•Rn-:反应管不含有模板DNA。
•无模板对照:No template control，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数 值。
•Threshold: 荧光(Rn)超过本底——达到可检测水平时的临界数值。
•Ct: threshold cycle，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循 环数。
•基线:baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直 到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。 )
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