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电穿孔系统.doc

电穿孔系统

Zora燕卫
2019-02-27 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《电穿孔系统doc》,可适用于医药卫生领域

电穿孔系统BJ电转感受态细胞只能用于电击转化,不能用于热激转化。BJ为重组腺病毒质粒构建专用菌株,能够表达供pAdEasy骨架质粒和pAdEasy穿梭质粒进行同源重组的所有组分。pUC质粒检测感受态细胞的转化。电极间距为cm的电转杯(GenePulserMicroPulserelectroporationcuvettes)插入碎冰中,压实冰面,冰中静置分钟,使电转杯充分降温。(电转杯重复使用方法:每次用完后,用大量的自来水冲洗干净去掉菌液和DNA,用蒸馏水洗遍,将其泡在乙醇中分钟,取出杯子,沥干液体,放在超净台中,使乙醇充分挥发,盖上盖子放干燥地方备用)取℃保存的感受态细胞插入冰中,待细胞刚化冻后,加入质粒DNA或连接产物(洗脱或溶解质粒的溶液中离子不能太高,或用双蒸水稀释,对照pUC可以用无菌水稀释到pgμl),用手指拨打管底轻轻混匀,立即插入冰中,在超净台中用无菌吸头将细胞DNA混合物快速转移到电击杯中,避免产生气泡,确保细胞沉到杯底,盖上杯盖,空管保留待用。启动电转仪,设置电击参数:kV,Ω,μF(BTXECM或BioRadGenePulser)。用纸巾擦掉电转杯外部的水分,将电转杯放入电转槽中进行电击。完成后,将电转杯插入冰中,加入μl无抗生素的SOC或LB培养基,并将液体转移到原来保留的感受态空管中,℃,rpm振荡培养小时。取μl左右的菌液或稀释后的菌液,涂布于含相应抗生素的LB平板上,倒置放于℃培养箱培养小时。注意事项:电转杯必须预冷。感受态细胞应该在冰水浴中化冻,加入DNA后应轻柔混匀,加入DNA的体积小于细胞体积的。一旦DNA加入到细胞中,电击操作应该立即进行。DNA应该溶解在水或TE中,连接酶的存在会降低转化效率,必要时需纯化连接产物。电击时,电转杯中的气泡和含高浓度盐离子的DNA或转化产物会导致电弧现象的发生。电击完成后应该立刻加上LB或SOC等复苏培养基,每分钟延迟加入会导致倍转化效率的降低。He,TC,Zhou,S,daCosta,LT,Yu,J,Kinzler,KWetal()ProcNatlAcadSciUSA():

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