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黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制尿液代谢组学探究

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黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制尿液代谢组学探究黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制尿液代谢组学探究 黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制尿 液代谢组学探究 摘要采用基于液相色谱飞行时间质谱联用,LCTOFMS,技术的代谢组学方法,分析大鼠尿液内源性代谢物的变化,研究黄芪口服液,HO,降低大鼠顺铂,CDDP,毒性的作用机制。采用低剂量多次腹腔注射CDDP的方法建立CDDP染毒大鼠模型,并连续给予16天HO。于第18天收集正常对照,Control,组、顺铂模型,CDDP,组和黄芪口服液,HO,组大鼠的24h尿液,进行LCTOFMS分析,以获取尿液代谢物组数据集,对...

黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制尿液代谢组学探究
黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制尿液代谢组学探究 黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制尿 液代谢组学探究 摘要采用基于液相色谱飞行时间质谱联用,LCTOFMS,技术的代谢组学方法,分析大鼠尿液内源性代谢物的变化,研究黄芪口服液,HO,降低大鼠顺铂,CDDP,毒性的作用机制。采用低剂量多次腹腔注射CDDP的方法建立CDDP染毒大鼠模型,并连续给予16天HO。于第18天收集正常对照,Control,组、顺铂模型,CDDP,组和黄芪口服液,HO,组大鼠的24h尿液,进行LCTOFMS分析,以获取尿液代谢物组数据集,对所得数据进行主成分分析,PCA,和正交偏最小二乘法判别分析,OPLSDA,等多元统计分析,以筛选潜在生物标志物。于第20天采集大鼠血清测定肌酐和尿素氮水平。血清指标测定结果表明,HO可以显著降低CDDP染毒大鼠的肌酐和尿素氮水平,p 2.3色谱质谱条件及样品分析 色谱条件,Agilent1200液相色谱系统,色谱柱为Poroshell120SBC18,100mm×3.0mm,2.7μm,,预柱为Poroshell120SBC18,5.0mm×3.0mm,2.7μm,。流动相A为含2mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸,流动相B为含2mmol/L 1 甲酸铵和0.1%甲酸的甲醇/乙腈,1〖KG-3?〖KG-51,V/V,。梯度洗脱,0,0.5min,5%B,0.5,12min,5%,100%B,12,16min,16,16.1min,100%,5%B,16.1,22min,5%B,1.3,16.5min切入质谱进行检测。流速,300μL/min,柱温,35?,进样量,5μL,进样室控温,8? 质谱条件,采用ABSCIEXTripleTOFTM5600液相色谱质谱联用仪进行检测,采用电喷雾离子化,ESI,源正负离子扫描模式,喷雾电压,ISVF,,正离子5400V,负离子 4500V,离子化温度,TEM,,550?,雾化气,GS1,,60psi,辅助加热气,GS2,,60psi,气帘气,CUR,,35psi。一级质谱采集范围为m/z100,1000,累积时间0.250015s,DP,80V,CE,10eV。采用IDA模式采集二级质谱,采集范围为m/z50,1000,累积时间0.100006s,DP,80V,CE,35eV,CES,15,IRD为67,IRW为25。IDA转换 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 为,信号强度>500cps,分子量误差50mDa,每个循环最多监测8个离子,在4Da内排除同位素。采用Analyst1.6.0 软件控制LCMS分析系统,并采集分析数据 样品采用上述LCTOFMS分析方法进行分析。为保证并监测分析系统稳定性,确保获取数据的可靠性,本实验首先连续进样5针QC样品以平衡色谱柱和系统,然后分析待测样品。每隔5个样品采用CDS系统自动校准一次,每隔10个样品插入一个QC样品。同时各组样品随机分布在整个分 2 析批,以消除进样次序对分析结果的影响 2.4数据处理 2.4.1数据有效性验证 根据QC样品中分布于不同保留时间的代表性离子的色谱峰强度、保留时间,tR,和质荷比,m/z,准确度信息,对仪器系统的稳定性和分析数据的质量进行 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 ,并为后续样品预处理参数设定提供依据。采用主成分分析,PCA,评估QC样品聚类效果,进一步验证分析数据的有效性和可靠性 2.4.2预处理过程依据QC样品中代表性色谱离子的tR和m/z的误差范围设定参数,将LCMS原始数据导入Markerview软件中进行色谱峰的寻找和校准。根据tRm/z数据对应检测到的色谱峰的离子强度,根据80%原则及去除同位素离子获取有意义的连续性变量,采用色谱峰总面积归一化法对数据进行归一化处理 2.4.3多元统计分析将预处理过的分析数据导入SIMCAP14.0中进行主成分分析,PCA,和正交偏最小二乘法判别分析,OPLSDA,。PCA用于验证分析系统性能的稳定性和分析数据的质量,并发现可能的逃逸样品。OPLSDA用于概览整个分析批的数据,并分辨出导致组间差异的变量。以OPLSDA模型中得到的投射变量影响值,Variableimportanceinprojection,VIP,的统计学差异阈值 3 大于1作为标准筛选差异代谢物。同时,采用Markerview软件的t检验功能对预处理过的数据进行组间双侧独立样本t检验和倍数变化,Foldchange,FC,分析,以同时满足t检验的p2为标准筛选差异代谢物。选取上述两种筛选方法中的共同部分作为最终的差异代谢物。通过对比CDDP组与Control组和HO组间的共有差异代谢物,筛选变化趋势一致者作为HO缓解大鼠CDDP毒性作用的潜在生物标志物,Potentialbiomarkers,PBs, 2.4.4生物标志物鉴定和代谢通路分析通过解析各个PB的母离子和子离子TOFMS图谱中蕴含的元素组成和化学结构信息,获得其相应的候选化合物列表,通过搜索匹配Chemspider,HMDB,METLIN,Massbank和KEGG等代谢组学相关数据库中的相应化合物及其MS/MS2级图谱,排除干扰的候选化合物,最终初步鉴定相应PB的化学结构。将包含峰强度信息的已鉴定PBs的数据集进行如下处理,,1,导入MultipleArrayViewer以生成热图,并进行HCA分析,,2,导入MetaboloAnalyst3.0中进行代谢通路分析,同时结合文献报道对生物标志物的生理学意义进行深入探讨 3结果与讨论 3.1HO对CDDP模型大鼠的肌酐、尿素氮含量的影响 肾脏损害是CDDP最为常见的严重不良反应。血清中肌 4 酐和尿素氮水平是反,,肾功能的主要指标。如表1所示,给予CDDP后,大鼠血清中肌酐和尿素氮水平显著升高,p 为了进一步考察其代谢轮廓变化,采用无监督的PCA方法处理LCMS数据,以表征组间差异。从PCA得分图,图2,可见,3组样品在不同的区域分别聚类,组间可明显区分,且HO组样品位于CDDP组和Control组之间,表明给予HO后可使CDDP所致的机体损伤向正常状态恢复 3.2.2生物标志物的筛选和鉴定先后采用监督性的OPLSDA模式识别方法、组间双侧独立样本t检验和倍数变化分析对LCMS数据进行分析,以同时满足VIP>1,p2为标准筛选导致组间差异的尿液代谢产物。根据其在不同组间的含量变化趋势,共从中筛选出197个,正离子133个,负离子64个,差异代谢物作为HO缓解大鼠CDDP毒性作用的PBs 采用2.5节方法对所有197个PBs进行初步鉴定。以PB3,m/z_tR为141.0658_2.39,正离子为例,根据其分子离子m/z141.0658的精确分子质量测定,误差在5mDa以内,及同位素匹配等原则可知,C6H8N2O2为其候选分子式,在METLIN和KEGG数据库中共有4个内源性代谢物Ethylimidazolecarboxylate,Methylimidazoleaceticacid、Gaboxadol和1,3Dimethyluracil与此分子式相对应。如图3所示,在PB3的二级图谱中,其分子离子可先后丢失18Da 5 ,H2O,和28Da,CO,,表明其化学结构中含有羧基,据此可以排除候选化合物Ethylimidazolecarboxylate、Gaboxadol和1,3Dimethyluracil。而可归属为咪唑环的特征碎片的m/z为68.0516的碎片离子的存在,可进一步证明该图谱应为Methylimidazoleaceticacid的二级图谱。借助TOFMS的精确分子质量测定和Peakview软件的fragmentsPane功能,我们对PB3的特征碎片离子进行了合理归属,如图3所示,。需要指出的是,上述步骤并不能保证PBs的唯一归属,尚需参考相关文献报道来确认鉴定结构。最终,通过匹配METLIN等数据库,解析2级图谱和参考相关报道,初步鉴定了35个PBs。表2 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 了35个PBs的详细信息,包括离子类型、质荷比、保留时间、分子式、化合物名称、CDDP组与Control组相比的变化趋势、VIP值、p值、FC值等 将包含35个PBs化合物名称和相对色谱峰强度的数据导入MultipleArrayViewer软件,经lg2转化后进行HCA聚类分析生成其相应的热图,图4,。由图4中颜色变化可以清晰地看到,给予CDDP后,各个PBs在尿液中的含量与Control组相比出现了明显变化,而给予HO可改善这些改变,树状分支图显示了各个样品间的亲缘关系,由此可知,HO大体位于CDDP和Control中间,形象地反映了HO改善CDDP所致损伤的作用 6 3.3代谢通路分析及其生物学意义探讨 将包含35个PBs化合物名称和相对色谱峰强度的数据导入MetaboloAnalyst3.0中进行代谢通路分析,如图5所示,有6条显著改变,p>0.05,的代谢通路,分别对应12个已鉴定的PBs。而通过HMDB和KEGG等数据库及文献搜索可知,剩余21个PBs对应于7条通路,详见表2中的PA14,20,。这些通路的紊乱与回调与CDDP的机体毒性及HO的解毒作用机制紧密相关 氨基酸是机体的重要营养物质,和蛋白质及多肽一样,氨基酸代谢对于机体的生长、繁殖及免疫等而言至关重要[14]。标志物鉴定结果,表2,表明,共有16个潜在生物标志物可能与9条氨基酸生物合成及代谢通路相关,其中13个在给予CDDP后浓度水平显著上调,而在给予HO后可明显下降,说明连续给予HO可回调CDDP导致〖CM,44的机体氨基酸代谢通路紊乱。而代谢通路分析,图5,结果显示,苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代谢〖CM, 通路为改变最为显著的代谢通路,且有多达12个潜在标志物与此通路相关,图6,。由此可知,回调苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代谢通路的紊乱为HO降低CDDP机体毒性的主要作用途径之一。此外,给予CDDP后Allysine[15] 和4Pyridoxicacid的下调,表明CDDP会导致机体维生素B6代谢通路紊乱。而维生素B6是机体内某些辅酶的组成成 7 分,参与多种代谢反应,尤其是和氨基酸代谢有密切关系[16]。由此可以推测,CDDP导致的氨基酸代谢紊乱可能与维生素B6代谢紊乱有关 脂肪酸是细胞膜的重要组成成分和体内最大的能量储备物质。据报道,单一剂量的CDDP会导致细胞内钙非依赖性磷脂酶A2的激活和线粒体脂肪酸氧化的抑制,最终会使非酯化脂肪酸和甘油三酯在血清、尿液和肾脏组织内积累[17]。由表2和图6可知,给予CDDP后,有3个脂肪酸类代谢产物,PB16,PB27,PB35,出现明显上调,这与之前的研究报道一致,同时也发现1个脂肪酸类代谢产物,PB26,下调 ,,酸及烟酰胺是辅酶?和辅酶?的组成部分,参与体内脂质代谢,组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解等过程。因此,给予CDDP后3个烟酸和烟酰胺通路相关代谢物的含量上调,PB23和PB24,或下降,PB21,,提示可能存在脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢通路紊乱,而三羧酸循环代谢产物PB9的上调进一步表明CDDP导致了三羧酸循环的紊乱。而这些现象与先前有关CDDP可导致机体线粒体机能失调,继而引发ATP合成障碍,造成机体能量代谢紊乱的报道相一致[18] 根据VIP值大小可判断代谢物对组间差异的贡献度。将表2中所有35个PBs按VIP值重新排序发现,共有15个 8 PBs的组间对比VIP值均大于2,表明与这些PBs相关的代谢通路与HO改善CDDP毒性作用最为相关。而在这15个PBs中,除了11种化合物与上述的氨基酸代谢和能量代谢紊乱外,另有PB25,VIP排名第2,与嘌呤代谢相关,PB4,PB1和PB14,VIP排名第7,11,12,与嘧啶代谢相关,它们在给予CDDP后均显著升高,而在给予HO后又可显著回调,这表明回调核苷酸代谢的异常激活可能为HO降低顺铂毒性的主要作用机制之一。 基于上述分析,根,,文献报道和KEGG数据库信息,可将HO减弱顺铂所致大鼠机体毒性所涉及到的体内主要代谢通路网络总结如图6所示,HO主要可通过调节机体苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代谢、脂肪酸代谢、三羧酸循环、维生素B6代谢、烟酸烟酰胺代谢、嘌呤和嘧啶代谢等通路的紊乱,恢复机体氨基酸、能量和核苷酸的代谢平衡,发挥其降低CDDP机体毒性的作用 4结论 本研究采用基于LCTOFMS的尿液代谢组学研究方法,从整体水平代谢产物轮廓层面证明了HO降低大鼠CDDP毒性的作用,并从尿液中筛选鉴定出35个表征HO减毒作用的PBs。本研究初步阐明了HO降低大鼠CDDP毒性的作用机制主要与改善机体氨基酸、能量和核苷酸代谢相关 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AbstractAliquidchromatographyquadrupoletimeofflightmas sspectrometer,LCQ/TOFMS,basedurinarymetabolomicapproachwasemployedtoassess thetoxicityalleviationeffectofHuangqioralsolution,HOs, 12 oncisplatinexposedratsandexploreitspossiblemechanisms.Rattoxicitymodelwasdevelopedbymultipleintraperitonealinjectionoflowdosecisplatin, whileHOswasorallyadministratedtoratssimultaneouslyfor16consecutivedaystoattenuateorreducethecisplatininducedtoxicity.24hoururinesamplesonday18werecollectedandanalyzedusingLCQ/TOFMStoobtainthedatasetofurinarymetabolites.Principalcomponentanalysis,PCA, andorthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis,OPLSDA, wereemployedtoassessthequalityofthedatasetandscreenthepotentialtoxicityalleviationbiomarkers.Theserumlevelofratcreatinineandureanitrogenonday20wasdetermined, andtheresultsshowedthatsuccessiveadministrationofHOssignificantlyreducedthecisplatininducedincreaseofcreatinineandureanitrogen.PCAclusteranalysisclearlydemonstratedthatHOscouldpartlyimprovetheCDDPinducedabnormalityofmetabolicprofiling.35urinarymetaboliteswerefinallyscreenedasthepotentialbiomarkersassociatedwiththetoxicityattenuationeffectofHOs, accordingtothecombinationoftheanalysisresultsofOPLSDA, 13 ttestandfoldchangeanalysis.FurthermetabolicpathwayanalysisrevealedthatHOscouldrestorethemetabolicdisordersofaminoacid,energyandnucleotide, therebyexerteditstoxicityalleviationeffect. KeywordsHuangqioralsolution,Cisplatin,Urine, Metabolomics, Liquidchromatographytimeofflightmassspectrometry, Toxicity ,Received1November2016, accepted30December2016, ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.81503300,. 14
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