头孢丙烯片在健康受试者体内的生物等效性研究

头孢丙烯片在健康受试者体内的生物等效性研究 【摘要】目的:建立人血浆中头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体的高效液相测定法,并评价两种制剂的人体生物等效性。方法:单剂口服头孢丙烯片0.5g后,血样经处理后,进行HPLC分析。结果:头孢丙烯顺式(Z)异构体的线性范围为0.1000~16.0000 ?g?mL-1,提取回收率为94.9%~96.0%;头孢丙烯反式(E)异构体的线性范围为0.0200~1.6000 ?g?mL-1,提取回收率为92.7%~ 94.1%。人体中受试制剂和参比制剂的头孢丙烯顺式(Z)异构体的药代动力学参数为:Cmax为(7.93±1.87)和(7.82±1.76)?g?mL-1,Tmax为(1.75±0.67)和(1.81±0.61)h, t1/2为(1.35±0.15)和(1.32±0.16)h ,AUC0-t为(24.56±3.44)和(24.71±3.85)?g?h?mL-1,;头孢丙烯反式(E)异构体的药代动力学参数为:Cmax为(0.70±0.15)和(0.68±0.16)?g?mL-1,Tmax为(1.72±0.52)和(1.77±0.62)h, t1/2为(1.20±0.28)和(1.24±0.21)h ,AUC0-t为(2.02±0.33)和(2.00±0.44)?g?h?mL-1。结论:本方法灵敏、准确、简便,适用于临床药代动力学研究;两制剂生物等效。 【关键词】头孢丙烯顺式(Z)异构体;头孢丙烯反式(E)异构体;高效液相色谱法;生物等效性 【中图分类号】R978.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2014)05-2754-02 头孢丙烯为第二代头孢菌素类抗生素,具有广谱抗菌作用[1]。本品的作用机制是抑制细菌细胞壁的合成,使细菌迅速破裂溶解。临床用于治疗敏感菌所致的轻、中度感染,包括上呼吸道感染,下呼吸道感染及皮肤和皮肤软组织感染。头孢丙烯中顺式异构体的含量在90 %以上,而反式异构体只占10 %以下。顺反式异构体在化学稳定性和抗GP(革兰阳性)链球菌和葡萄球菌活性方面是相同的,但在抗GN(革兰阴性)大肠埃希杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌方面,顺式头孢丙烯的抗菌活性是反式头孢丙稀的6~8倍。目前国内尚无同时测定头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体含量并进行生物等效性的报道。本文建立了高效液相色谱同时测定人血浆中头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体浓度的方法,用于头孢丙烯在人体的药代动力学研究。 1材料与方法 1.1 药品与仪器 受试制剂(A药):规格:0.25 g/片,批号:091006,北京赛科药业有限责任公司提供;参比制剂(R药):商品名:施复捷?,规格:0.25 g/片,批号:0905773,中美上海施贵宝制药有限公司生产。 头孢丙烯顺式(Z)异构体对照品(含量:92.7 %,批号: H01099);头孢丙烯反式(E)异构体对照品(含量:89.5 %,批号:H05336),均由厂家提供;头孢拉定对照品(含量: 91.8 %,批号:13),购自中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈均为色谱纯,三氯乙酸和二氯甲烷均为分析纯;水为纯净水;空白血浆由吉林大学第一医院提供。 LC-10ATvp高效液相色谱仪,配有LC solution Lite工作站(日本岛津公司);XW-80A旋涡混合器(上海沪西仪器厂有限公司);TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);AUW120D分析天平(日本岛津公司);雷磁pHS-3E pH 计(上海精密科学仪器有限公司);KS康式振荡器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)。 1.2 受试对象 18名健康男性志愿者,年龄20~24岁,体重为54~70 kg,体重指数(BMI)为20~24(BMI=体重(Kg)/身高(m)的平方)。于试验前在医院接受全面的体格及化验检查,结果血、尿常规,肝、肾功能正常,心电图正常,均符合受试者入选要求。试验前2周内未服用任何药物。受试者试验前均签署知情同意书。试验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 经吉林大学第一医院医学伦理委员会批准。临床试验于吉林大学第一医院进行。 1.3 给药方案与血样采集 试验采用双周期自身对照交叉试验设计。18例受试者随 机分成2组,每组9人。受试者试验日晨采集空白血样后,空腹口服受试制剂2片或参比制剂2片以250 mL温开水送服并做记录。服药后2 h可饮水,4 h进统一清淡饮食。分别在给药后的0.25、0.5、0.75、1.0、1.25,1.5、2、2.5、3、4、5、6、8小时由静脉采血5 ml,置肝素化试管中,离心10min (3500 r?min-1),分离血浆,于-70℃冰箱中保存待测。 1.4 血药浓度测定 1.4.1 色谱条件 色谱柱:依利特ODS(250×4.6 mm,5 μm);预柱: C18 保护柱;流动相:0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH值2.60 ±0.05)-乙腈(85:15);检测波长:280 nm;柱温:30 ℃;流速:1.0 ml/min;进样量:50 μl。 1.4.2 血浆样品处理 精密量取血浆样品500 μl,加入甲醇-水(1:1)100 μl,加入内标溶液(100.2000 μg/ml头孢拉定)50 μl,20 %三氯醋酸100 μl,漩涡混合1分钟,14000 rpm离心6分钟,取上层液转置于10 ml离心管中,依次加入乙腈0.5 ml和二氯甲烷2 ml,振荡6分钟,12000 rpm离心6分钟,取上层液转置于1.5 ml离心管中,14000 rpm离心6分钟,取50 μl上清液进样分析。 1.4.3 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的制备精密量取空白血浆500 μl,分别加入头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E) 异构体标准系列溶液各50 μl,配制成血浆中头孢丙烯顺式(Z)异构体浓度为0.1000,0.3000,1.0000,2.0000,4.0000, 8.0000,16.0000 μg/ml和头孢丙烯反式(E)异构体浓度为20.0,40.0,100.0,200.0,400.0,1000.0,1600.0 ng/ml的血浆样品,按“血浆样品处理方法”项下自“加入内标溶液(100.0000 μg/ml头孢拉定)50 μl”起同法试验,每一浓度进行双样本分析,制备头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体的标准曲线。以待测物浓度为横坐标X,待测物与内标物的峰面积比值(AS/Ai)为纵坐标Y,用加权最小二乘法[2](权重系数:1/X2)进行线性回归运算,求得的线性回归方程即为标准曲线方程。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,头孢丙烯顺式(Z)异构体在0.1000 ~16.0000 μg/ml范围内、头孢丙烯反式(E)异构体在20.0 ~1600.0 ng/ml范围内分别与待测物和内标物峰面积之比线性关系良好,浓度测定结果均达到试验要求的精密度与准确度[3]。 1.4.4 精密度与准确度 精密量取空白血浆500 μl,分别加入不同浓度的头孢丙烯顺式(Z)异构体和反式(E)异构体质控标准溶液50 μl,配制成血浆中头孢丙烯顺式(Z)异构体浓度为0.2000, 1.6000和12.8000 μg/ml、头孢丙烯反式(E)异构体浓度为50.0,300.0和1280.0 ng/ml的血浆样品(每浓度六样本分析),按“血浆样品处理方法”项下自“加入内标溶液(100.0000 μ g/ml头孢拉定)50 μl”起同法试验,连续测定三批(与标准曲线的测定同时进行),计算血浆样品的浓度,求得方法的精密度与准确度。结果表明,头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体的低、中、高3个浓度QC样品的批内、批间RSD均小于15%,符合有关的国际 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 要求[3]。 1.4.5 提取回收率 精密量取空白血浆500 μl,分别加入不同浓度的头孢丙烯顺式(Z)异构体和反式(E)异构体质控标准溶液50 μl,配制成血浆中头孢丙烯顺式(Z)异构体浓度为0.2000, 1.6000和12.8000 μg/ml,头孢丙烯反式(E)异构体浓度为50.0,300.0和1280.0 ng/ml的血浆样品(每浓度六样本分析),按“血浆样品处理方法”项下自“加入内标溶液(100.2000 μg/ml头孢拉定)50 μl”起同法试验,获得相应色谱峰面积;另取对应浓度的头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体质控标准溶液各50 μl,加入内标溶液(100.0000 μg/ml头孢拉定溶液)50 μl,甲醇-水(1:1)600 μl(每浓度六样本分析),涡旋混合30秒,取50 μl上清液进样分析,获得相应色谱峰面积(六次测定的平均值)。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果表明, 3种浓度下头孢丙烯顺式(Z)异构体的提取回收率分别为95.1%,94.9%和96.0%;头孢丙烯反式(E)异构体分别为 92.9%,94.1%和92.7%,内标提取回收率为91.0,符合有关规定[3]。 1.4.6 血浆样品的稳定性 制备低、中、高3个浓度的血浆样品各3份,共配制3组,分别进行室温、反复冻融及-70℃冻存条件下稳定性试验。结果测定RSD均在15%以内,表明头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体血浆样品在室温放置24 h、反复冻融3次及-70℃冻存条件下31天均稳定性良好。 1.5 数据分析 采用Phoenix WinNonlin 6.0数据统计软件处理血药浓度数据并进行计算。Tmax和Cmax均为实测值,药-时曲线下面积(AUC0-t)按梯形面积法计算。对Cmax、AUC的对数转换值及Tmax的实测值进行方差分析、双单侧t检验和90%置信区间估计,评价两制剂的生物等效性。 2 结果 2.1 专属性 色谱图结果表明,头孢丙烯顺式(Z)异构体保留时间为8.8分钟左右,头孢丙烯反式(E)异构体的保留时间为13.8分钟左右,头孢拉定的保留时间为15.4分钟左右,血浆中内源性物质不干扰头孢丙烯顺式(Z)异构体、反式(E)异构体和内标物头孢拉定的测定(A为头孢丙烯顺式(Z)异构体,B为头孢丙烯反式(E)异构体,C为头孢拉定)。 因此本方法具有良好的专属性,符合测定要求。结果见图1。 异构体标准溶液和内标的样品色谱图 (峰A为头孢丙烯顺式(Z)异构体;峰B 为罗头孢丙烯反式(E)异构体;峰C为头孢拉定(内标)) (峰A为头孢丙烯顺式(Z)异构体;峰B 为罗头孢丙烯反式(E)异构体;峰C为头孢拉定(内标)) 2.2 血药浓度-时间曲线 18名健康受试者单剂量口服头孢丙烯顺式(Z)异构体受试制剂和参比制剂后,平均血药浓度-时间曲线见图2。 2.3 血药浓度及药代动力学参数 18名受试者单剂量口服受试制剂和参比制剂后头孢丙 烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体的主要药代动力学参数见表1。 2.4 生物等效性评价 以AUC0-t计算,头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体的相对生物利用度分别为102.2 % ±13.7 %和103.5 % ±15.2。对头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体的主要药动学参数经对数转换后进行方差分析,并进一步采用双单侧t 检验进行生物等效性评价。头孢丙烯顺式(Z)异构体AUC0-t和AUC0-∞的90%置信区间为100.3%~110.7%和100.4%~110.6%;Cmax的90%置信区间为98.3%~112.8%和94.6%~103.9% ,Tmax在受 试制剂与参比制剂间无显著性差异。头孢丙烯反式(E)异构体的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信区间为94.5%~ 103.6%和94.5%~103.7%,Cmax的90%置信区间为98.3%~ 112.8%和94.6%~103.9%,Tmax在受试制剂与参比制剂间无显著性差异。 3 讨论 血浆样品处理时,如果不用乙腈和二氯甲烷除杂,色谱图上待测物及内标处会有杂质峰的干扰。本法提取回收率较高,且方法的重现性较好。与有关文献比较[4],该法灵敏度高且选择性好,完全可以满足临床药代动力学的要求。 采用HPLC法研究头孢丙烯片在健康志愿者体内的药代动力学过程。结果表明,18名健康男性志愿者分别口服0.5g 头孢丙烯片受试制剂与参比制剂后,两制剂的主要药代动力学参数(Cmax,AUC)经对数转换后,方差分析结果表明头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体在两种制剂间、周期间无显著性差异(P>0.05),个体间有显著性差异(P<0.05),说明两药物在人体内的吸收分布过程基本相似;经双单侧t检验和[1-2α] 置信区间分析,头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体受试制剂的AUC0-t 和AUC0-∞的90%置信区间在参比制剂相应参数的80%~ 125%内,表明头孢丙烯顺式(Z)异构体和头孢丙烯反式(E)异构体受试制剂与参比制剂具有生物等效性。 在临床试验过程中,医生对受试者进行严格监护,未观 察到临床不良反应现象;受试者在试验后进行体检,检测指标有超出正常值范围者,经临床医生判断无临床意义。 参考文献 [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典临床用药须知(化学药和生物制品卷)[M]. 人民卫生出版社,2005: 485-486. [2] 钟大放. 以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 [J]. 药物分析杂志,1996,1(5):343-346. [3] 国家药典委员会. 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则(中华人民共和国药典二部2010年版) [M]. 化学工业出版社,2010,附录:195-199. [4] Tae-Hwan Park,Jin-Ki Kim,Jun-Pil Jee,et al. HPLC method for simultaneous determination of cefprozil diastereomers in human plasma [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2004,36:243-248.