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【精品】qPCR原理及应用【精品】qPCR原理及应用实时荧光定量PCR的原理和应用 2010.10 雅睿生物黄宝福目录实时荧光定量PCR原理 PCR 荧光标记绝对定量和相对定量实时荧光定量PCR应用实时荧光定量PCR发展 digital PCRqPCR Array实时荧光定量PCR原理聚合酶链式反应Polymerase chain reaction PCR1971年，Khorana提出:经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。聚合酶链式反应 Polymerase chai...

【精品】qPCR原理及应用实时荧光定量PCR的原理和应用 2010.10 雅睿生物黄宝福目录实时荧光定量PCR原理 PCR 荧光标记绝对定量和相对定量实时荧光定量PCR应用实时荧光定量PCR发展 digital PCRqPCR Array实时荧光定量PCR原理聚合酶链式反应Polymerase chain reaction PCR1971年，Khorana提出:经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction PCR 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(PCR) 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首比喻1989年为PCR爆炸年Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR DNA 5’ 3’解旋解链 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC结合引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG子链延长 3’ 5’ PCR 5’ 3’ DNA ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC解旋解链 DNA 3’ 聚合酶 GGAUCG 5‘结合引物 5‘ DNA 3’ AUCGCG 聚合酶子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ PCR 5’ 3’ DNA ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC解旋解链 DNA TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGAUCG 3’聚合酶 5‘结合引物 5‘ DNA 3’ AUCGCG ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 聚合酶子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’PCR原理 1 2 3 高温变性低温退火适温延伸重复13步 2530轮温 94 形度成目的DNA片段 DNA 72 条变扩增100万倍以上 2(?) 单性子链延伸链 DNA加倍 55 DNA单链与引物复性 22 DNA双螺旋 1 2 3 4 5 时间(min) 模板 DNA 第四轮扩增第五轮扩增第一轮扩增第二轮扩增第三轮扩增实时荧光定量PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR和常规PCR常规PCR技术: 实时荧光定量PCR技术: 对PCR扩增反应的终点产利用荧光信号的变化实物进行定量和定性分析。无时检测PCR扩增反应中每一个法对起始模板准确定量，无循环扩增产物量的变化，通法对扩增反应实时检测。过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。荧光PCR特点灵敏度高特异性强全封闭PCR过程，无需后处理即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品可实现一管多检仪器自动分析，更快获得结果实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理Ct值的定义: PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 Ct valueCt值的重现性纵轴 : 荧光信号量横轴:PCR反映循环数 Ct值的特点: 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定; Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理-定量原理理想的PCR反应: XX02n非理想的PCR反应: XX0 1Exn n:扩增反应的循环次数 X:第n次循环后的产物量 X0:初始模板量 Ex:扩增效率实时荧光定量PCR原理-定量原理在扩增产物达到阈值线时: XCtX0 1ExCt M 1 XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后它是一个常数我们设为M方程式1两边同时取对数得: lg Mlg X0 1ExCt 2整理方程式2得: lg X0 - Ct× lg1Ex lg M 3 Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理-定量原理 Standard Curve 40 39 38 37 36 35 34 33 32 Ct Value 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 Copy Numbers 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理-相对定量靶核酸: XCtX01ExCtxKx 参比内标: RCtR01ERCtR KR XCt X01ExCtx Kx K RCt R01ERCtR KR ExERE: X0 × 1ECtx-CtR K R0 X0 XN Ct Ctx-CtR: XN × 1E Ct K R0 XN K ×1E -Ct样本q的XN除以 XNq K ×1E -Ctq校准样本(Calibrator) XNcb K ×1E -Ctcb 1E - Ctcb的XN: Ct Ctq- Ctcb

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