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蛋白质lowry法.doc.doc

蛋白质lowry法.doc

张瑶瑶小遥
2017-10-11 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《蛋白质lowry法.docdoc》,可适用于综合领域

蛋白质lowry法doc蛋白质含量的测定方法:(斐林酚试剂法原理斐林(Folin)酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应其中包括两步反应:第一步是在碱性条件下与铜试剂作用生成蛋白质铜络合物第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物颜色深浅与蛋白含量成正相关。在nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高倍。由于肤键显色效果增强从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为,lμg蛋白质)。(一)材料各种植物材料。(二)仪器设备分光光度计离心机恒温水浴定量加样器冷凝回流装置一套研钵离心管刻度移液管微量滴定管试管等。(三)试剂()(mol,LNaH。()斐林酚试剂甲液:由A、B两种溶液组成:A液:,碳酸钠(NaC)溶液与molL氢氧化钠(NaH)溶液等体积混合。B液:,硫酸铜(CuS•H)溶液与,酒石酸钾钠溶液等体积混合。使用前将A与B按:的比例混合即成此试剂只能在使用当天配制。()斐林酚试剂乙液:称取钨酸钠(NaW。H)g钼酸钠(NaMo•H)g加蒸馏水ml溶解于mL的圆底烧瓶中。之后加入,的HPOmL浓HclmL安上回流装置(使用磨口接头若用软木塞或橡皮塞时就必须用锡铂纸包起来)使其慢慢沸腾h。冷却后加入硫酸锂(LiSOHO)g,蒸馏水ml溴水滴打开瓶口煮沸min以逐出过量的溴冷却后溶液呈黄色(若仍绿色须再滴加几滴溴水继续煮沸min)。待冷却后稀释至ml过滤入棕色瓶中保存。使用时大约加水倍使最终浓度相当于molL酸度。因此在使用前应进行标定。标定方法:取ml福林酚试剂乙液放入锥形瓶内用molL标准氢氧化钠溶液滴定酚酞作指示剂当溶液突然转红再转灰绿时即为滴定终点。计算其相当的酸度用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于molL的酸度。在测定时要注意因为酚试剂仅在酸性稳定但此实验的瓜只在pH的情况下发生所以当加酚试剂时必须立即混匀以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应否则会使显色程度减弱。标准蛋白质溶液:称取mg牛血清蛋白溶于ml蒸馏水中使终浓度为μgml。实验步骤(一)标准曲线的绘制()取mm×mm试管支编号分别加入mL、mL、mL、mL、mL、mL、mL标准蛋白质溶液用蒸馏水补足mL使每管含蛋白量分别为μmolL、μmolL、μmolL、μmolL、μmolL、μmolL、μmolL。()用定量加样器给每支试管中加入mL甲液混匀于下放置min。()再向试管中喷射加入mL乙液立即振荡混匀在下准确保温min()以不加标准蛋白的号管为空白在nm下用cm光径的比色皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标吸光度为纵坐标绘制标准曲线。(二)样品的测定样品的提取:称取鲜样(g用mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后r,min离心min取上清液(mL(视蛋白质含量适当稀释)于试管中然后重复标准曲线绘制中的,步骤以空白管调零测定吸光度。根据吸光度查标准曲线求出样品中的蛋白质含量。结果计算样品中蛋白的含量,=C×VT(Vs×FW×)式中:C为查标准曲线值μgVT为提取液总体积mLWF为样品鲜重gVs为测定时加样量mL。‘注意事项还原物质其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。

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