雪芙蓉胶囊对去势雄性大鼠性功能和下丘脑室旁核一氧化氮合酶表达的影响

雪芙蓉胶囊对去势雄性大鼠性功能和下丘脑室旁核一氧化氮合酶表达的影响 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 雪芙蓉胶囊对去势雄性大鼠性功能和下 丘脑室旁核一氧化氮合酶表达的影响 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,崔建梅,汪晓阳,刘鸿宇,张磊,宋晓霞 【摘要】 目的 观察补肾中成药(雪芙蓉胶囊)对去势雄性成年SD大鼠雄激素水平、性功能和下丘脑室旁核(PVN)神经元型一氧化氮合酶(nNOS)阳性神经元表达的影响。方法 制作雄性大鼠手术去势模型,术后3d开始灌服中药,每天1次,连续28d;检测血清睾酮水平,观察大鼠性功能;用免疫组织化学方法显示下丘脑PVN中nNOS阳性神经元的变化;用图像处理半定量方法对nNOS神经元的数量、面积及灰度进行测量和分析。结果 ?与去势组比较,雪芙蓉组大鼠血清睾酮明显增加(P0.01),捕捉潜伏期缩短(P0.05),捕捉次数和骑跨次数增多(P0.05,P0.01),捕捉率和骑跨率增高(P0.05);?与去势组比较,雪芙蓉组大鼠PVN中的nNOS阳性细胞数量和阳性产物面积均明显增加(P0.05),而灰度没有统计学差异(P0.05)。结论 中药雪芙蓉胶囊可提高去势雄性大鼠雄激素水平,增强去势大鼠性功能,增加下丘脑PVN中nNOS阳性神经元的表达。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 【关键词】 雪芙蓉胶囊;去势大鼠;性功能;室旁核;一氧化氮合酶 ABSTRACT: Objective To evaluate the effects of Xuefurong capsules, the traditional Chinese medicine for invigorating the kidney, on sexual function and expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in paraventricular nucleus (PVN) in adult castrated SD rats.Methods The male castrated rat model was made and three days after operation the liquid of Xuefurong capsules (5mg/kg) was given by intragastric administration once a day for 28 days. The sexual function was observed and the nNOS expression in PVN was detected by using ABC immunohistochemical method. The number, area and gray degree of nNOS were counted and analyzed with semiquantitative method.Results ?Compared with that in the castrated group, the serum testosterone level increased obviously in Xuefurong group (P0.01); the catching latency was shortened (P0.05), the frequency of catching and mounting increased (P0.01, P0.05). At the same time, the rate of catching and the mounting increased in Xuefurong group (P0.05). ? Compared with those in the castrated group, the number and area of nNOS in PVN increased obviously in Xuefurong group (P0.05), but the gray degree was not significantly different (P0.05).Conclusion Xuefurong capsules can increase the level of testosterone, enhance the sexual function of castrated rats DOC格式论文,方便您的复制修改删减 and nNOS expression in PVN. KEY WORDS: Xuefurong capsules; castrated rat; sexual function; paraventricular nucleus; nitric oxide synthase 性功能障碍是中老年男性的常见病、多发病。NICOLOSi等[1]对29个国家的40,80岁的中老年人进行的调查结果显示,性功能障碍患病率比较高,并且随着年龄的增长有增高的趋势,尤其是中老年男性。一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种具有双重作用的体内局部调节因子,由L精氨酸在一氧化氮合酶(nNOS)的作用下生成,其在雄性生殖系统中分布广泛,对性欲的产生、性腺和附性器官都具有十分重要的调节作用[2]。 祖国传统医学治疗性功能障碍主要以补肾壮阳为主。雪芙蓉胶囊是近年来研制的具有补肾壮阳的中成药,主要由蛇床子、淫羊霍等组成。汪晓阳等[3]已经证明该中药方剂可以提高去势雄性大鼠的睾酮(testosterone, T)水平。本实验通过给予去势大鼠雪芙蓉胶囊28d,检测大鼠雄激素水平、性行为及下丘脑室旁核(paraventricular nucleus, PVN)神经元型一氧化氮合酶(neuron nitric oxide synthase, nNOS)的变化,探讨该药影响大鼠性功能的可能机制,为该药的临床应用提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 健康成年SD大鼠60只,雌雄各半,体重200,250g,由山西医科大学动物饲养中心提供。 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 啮齿类饲料饲养,雌雄分笼,每笼3只,自由摄食和饮水,室温(20?2)?,湿度 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 (45?10)%。将30只雄性大鼠随机分为去势组、雪芙蓉组和对照组3组,每组10只。去势组,手术去势,灌服等量生理盐水。雪芙蓉组,手术去势,灌服中药雪芙蓉胶囊(5mg/kg)。对照组,不去势,灌服等量生理盐水。以上各组均连续灌胃28d。 1.2 制作手术去势模型 雄性大鼠腹腔注射250g/L乌来糖0.5mL,麻醉后剪开阴囊中心部皮肤约1.0cm,将两侧睾丸与附睾尾部分离,结扎睾丸动脉,切除两侧睾丸。术后腹腔注射青霉素,2万u/(kg?d),连续3d。雌性大鼠用250g/L乌来糖0.5mL麻醉,进行双侧卵巢切除术,分层缝合肌肉和皮肤,回笼饲养,术后肌注青霉素,2万u/(kg?d),连续3d。 1.3 药品和试剂 雪芙蓉胶囊,0.40g/粒(山西草泽堂生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司,批号20040611)。将该胶囊于乳钵中研磨后配制成1.5mg/mL的混悬液,供动物灌胃用。试剂,睾酮放射免疫试剂盒(天津德普生物技术医学产品有限公司生产,批号,S10940108);一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。 1.4 性功能测试 最后一次灌胃后12h测试性功能。测试前,每天晚间将雌性大鼠置于笼中使其适应环境,连续3d。测试前48h皮下注射苯甲酸雌二醇30μg/只,4h前再注射黄体酮50μg/只,使雌鼠处于发情期[45]。最后一次灌胃后夜间20?00,22?00时分别将各组雄性大鼠与发情雌性大鼠1?1合笼,在安静的暗室中进行交配实验,监控记录大鼠性行为各项指标。先将1只雄鼠放入笼中使其适应环境10min,然后投入1只发情雌鼠,观测下列指标(30min内),? DOC格式论文,方便您的复制修改删减 捕捉潜伏期(自雌鼠投入至雄鼠第1次扑捉雌鼠的时间);?捕捉次数(雄鼠扑捉雌鼠的次数);?骑跨次数(雄鼠从后面扑向雌鼠,出现骑跨式交尾行为的次数);?捕捉率和骑跨率(各组雄鼠发生捕捉及骑跨的动物数占组内动物数的百分率)。 1.5 睾酮的测定 末次给药后24h经大鼠尾静脉取血分离血清用放射免疫法测睾酮。 1.6 脑组织的取材与切片 性功能测试后第2天,大鼠经30g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,开胸,升主动脉插管,300mL冷生理盐水快速冲洗,继之灌入40g/L多聚甲醛(0.1mol/L PBS配制,pH 7.4) 300mL,再以100g/L蔗糖PBS 300mL灌注;灌注结束立即取脑,置于40g/L多聚甲醛PBS溶液中,4?后固定3h,然后移入200g/L蔗糖PBS溶液(pH 7.2,7.4)中,4?保存过夜。脑冠状位连续冰冻切片,片厚40μm,隔3张取1张。 1.7 免疫组织化学ABC法染色 切片经0.2mol/L Triton100PBS液孵育(37?)1h,山羊血清工作液孵育(37?)1h,加入兔抗nNOS血清第1抗体,37?孵育3h,4?孵育36h;加入生物素羊抗兔第2抗体,37?孵育1h;入卵白素生物素复合物中37?孵育30min。以上各步骤之间均用PBS(pH 7.2,7.4)5min×3次充分漂洗。DAB呈色,缓冲液中止显色,反复漂洗。2g/L明胶裱片,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 1.8 图像分析和统计学处理 采用数码生物显微镜(德国Leica) DOC格式论文,方便您的复制修改删减 和形态学显微图像分析系统(江苏捷达),参照大鼠脑立体定位图谱对PVN区的nNOS免疫阳性产物进行半定量测定。每组大鼠各随机选取10张10×10倍光镜下细胞核轮廓清晰的免疫阳性神经元,分别计数阳性细胞个数和阳性产物面积及灰度。实验数据采用均数士标准差表示,用SPSS 11.5统计学软件处理。各组间比较采用单因素方差分析,交配实验中的捕捉率和骑跨率用卡方检验。P0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 雪芙蓉胶囊对大鼠血清睾酮及性功能的影响 与对照组比较,去势组大鼠血清睾酮显著降低(P0.01);与去势组比较,雪芙蓉组血清睾酮含量显著增高(P0.01)。与对照组比较,去势组捕捉潜伏期延长(P0.01),捕捉次数及骑跨次数显著减少(P0.01),捕捉率和骑跨率显著减少(P0.01);与去势组比较,雪芙蓉组的捕捉潜伏期缩短(P0.05),捕捉次数和骑跨次数增多(P0.05,P0.01),捕捉率和骑跨率增高(P0.05,表1)。上述结果提示中药雪芙蓉胶囊可增强去势雄性大鼠的性功能。表1 雪芙蓉胶囊对大鼠血清睾酮及性功能的影响 2.2 雪芙蓉胶囊对大鼠下丘脑PVN中nNOS免疫阳性细胞数量、面积及灰度的影响 光镜下可见PVN内分布有大量的nNOS免疫阳性神经元,表达较密集,成簇状,表达区域为三角形。定量结果显示,与对照组比较,去势组PVN的nNOS免疫阳性细胞数量和阳性产物面积均显著减少(P0.01),染色较浅(P0.05);与去势组比较,雪芙蓉组PVN的nNOS免疫阳性细胞数量和阳性产物面积均增加 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 (P0.05),灰度没有显著差异(P0.05,表2、图1)。表2 雪芙蓉胶囊对大鼠下丘脑PVN中nNOS免疫阳性细胞数量、面积和灰度的影响 A,对照组;B,去势组;C,雪芙蓉组。大鼠去势后PVN的nNOS免疫阳性神经元(箭头所示)的数量、分布面积和灰度显著减少;雪芙蓉组大鼠PVN的nNOS免疫阳性神经元的数量、分布面积和灰度显著增加。3v为侧脑室。 3 讨 论 祖国医学认为,肾为先天之本,肾阳为全身阳气之根源,肾阳虚累及生殖系统时,患者可表现出性欲减退、阳痿、早泄等性功能障碍症状[6]。研究发现,雄激素与成年男子性行为有直接的关系[7]。本研究结果显示,雪芙蓉组血清睾酮水平比去势组显著增高,但远低于对照组水平。从理论上讲,由于大鼠双侧睾丸已被摘除,血清睾酮水平不会有太大升高。但本实验血清睾酮增多,究其原因,可能与该中药作用于肾上腺皮质网状带,促进雄激素少量分泌有关。可以推测雪芙蓉胶囊可使去势大鼠睾酮降低的趋势得到部分改善,对大鼠性功能恢复有所帮助。 雄激素对雄性性欲及性行为的维持起重要作用,雄性大鼠去势后逐渐失去交配能力。以大鼠交配试验检测性功能,是衡量性功能强弱的最直接也最可信的方法,在国内外普遍应用。受试动物的骑跨、插入和射精等性行为的发生频率和潜伏期可直接反应其性能力的强弱[5]。因此,本实验将大鼠的捕捉潜伏期、捕捉次数、捕捉率、骑跨次数和骑跨率作为检测去势大鼠性行为的最基本手段。从实验结果可 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 以看出,雪芙蓉胶囊可以缩短去势雄性大鼠的捕捉潜伏期,使去势雄性大鼠的捕捉次数和骑跨次数增多、捕捉率和骑跨率增多,表明雪芙蓉胶囊可以改善去势大鼠的性活动能力,提高性欲。 PVN为异质性核团,既具有神经内分泌功能,又参与植物神经活动的调控。近来研究发现,PVN参与许多神经功能的调节,包括雄性大鼠的阴茎勃起与性功能[8],而NO是PVN调节性行为的主要神经递质[9]。吴新红等[10]向去势雄性大鼠的PVN内注射L精氨酸,得出结论,NO是PVN的神经传递素之一,是PVN控制大鼠阴茎勃起的重要神经递质,而且与雄激素水平有关。本研究结果显示,雄性大鼠去势后PVN内的nNOS免疫阳性神经元的数目及面积明显减少,细胞染色灰度变浅,而灌服中药28d后去势大鼠PVN中nNOS的表达明显增强。提示PVN内nNOS表达的减少与去势大鼠的性功能降低有关。这与YOSHIKAZU等[11的研究结果一致。当前去势大鼠PVN内nNOS减少的机制仍不清楚,可能与去势后雄激素水平的下降有关。研究证实,下丘脑NOS与雄激素有依赖关系[12],雄激素可以调节NOS的活性[13]。 中药雪芙蓉胶囊主要由蛇床子、淫羊霍等组成。蛇床子能提高去势雄鼠的睾酮水平,增强阴茎组织中NOS活性,维持NO水平,对阴茎勃起功能障碍有一定作用[14];淫羊霍具有雄激素样作用,可增加去势大鼠前列腺、精囊腺重量,使雄性小鼠的跨骑、交尾及舔阴茎行为的发生频率显著增高,而交尾和舔阴茎行为的潜伏期显著缩短,具有明显地促进性功能作用[15]。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 综上所述,中药雪芙蓉胶囊可以使去势大鼠的性能力得到明显 提高,其机制可能与该药提高雄激素水平、增强PVN内 nNOS的表 达有关,但其确切机制有待于进一步研究。 【参考文献】 [1]NICOLOSI A, LAUMANN EO, GLASSER DB, et al. 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