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柑橘黄龙病原16SrDNA 序列异质性分析病原分析序列柑.doc

柑橘黄龙病原16SrDNA 序列异质性分析病原分析序列柑.doc

上传者: 于敏熙 2017-10-18 评分 0 0 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《柑橘黄龙病原16SrDNA 序列异质性分析病原分析序列柑doc》,可适用于综合领域,主题内容包含柑橘黄龙病原SrDNA序列异质性分析病原分析序列柑柑橘黄龙病原SrDNA序列异质性分析,,孙大光~郑雪芳~刘波~阮传清~范国成~HallD~段永平(符等。

柑橘黄龙病原SrDNA序列异质性分析病原分析序列柑柑橘黄龙病原SrDNA序列异质性分析,,孙大光~郑雪芳~刘波~阮传清~范国成~HallD~段永平(福建师范大学生命科学学院福州福建省农业科学院农业生物资源研究所福州福建省农业科学院果树研究所福州美国农业部佛罗里达园艺试验室弗罗里达)摘要:本研究采用NestedPCR技术检测柑橘不同部位叶片黄龙病病原携带情况通过对柑橘黄龙病病原菌SrDNA的测序并构建系统发育树比较不同地区柑橘黄龙病病原菌之间的进化关系并分析不同地区的柑橘黄龙病病原菌SrDNA的序列差异性。结果表明:顺昌红心柚叶片黄龙病病原菌阳性检出率为其中(个)为显性性状(个)为隐性性状。不同部位叶片内柑橘黄龙病病原SrDNA的同源性达以上。不同地区的柑橘黄龙病病原菌SrDNA进化分析表明顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型其SrDNA的序列差异性分析表明亚洲种与非洲种的差异性为非洲种与美洲种的差异性为亚洲种与美洲种的差异性为。关键词:柑橘黄龙病巢式PCRSrDNA系统进化分析PhylogenicanalysisoncitrusHuanglongbing(HLB)pathogenbySrDNAsequenceintheleavesfromdifferentpartsofinfectedcitrusplant~*SUNDaguangZHENGXuefangLIUBo,RUANChuanqing,FANGuocheng,HallD,DUANYongpingCollegeOfLifeScienceFujiannormaluniversity,Fuzhou,ChinaAgriculturalBioResourceResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,ChinaResearchInstituteofPomology,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,ChinaHorticulturalResearchLaboratory(USDAARS),Florida,,USAAbstract:TheleavesweresampledinthedifferentdirectionsofHLBinfectedcitrusplant,CitrusgrandisOsbeckcvChandlerTheNestedPCRdetectionofcitrusleafHLBpathogenwascarriedThephylogenetictreebasedonSrDNAsequencingwasbuilttofindouttheevolutionaryrelationshipamongthecitrusHLBpathogensfromthedifferentpartsofacitrusplantTheresultsshowedthatthepositivedetectionratewasintheleavesfromthedifferentdirectionsofHLBinfectedcitrusplant,amongwhichweredominantcharacter,wererecessivecharacterThesimilarityofSrDNAsequencesintheleavesfromthedifferentpartsofaHLBinfectedcitrusplantwereupto,itmeantthatnodifferentiationofHLBhappenedintheleavesfromdifferentpartsofthecitrusnomatterwithdominantorrecessiveTheSrDNAphylogeneticanalysisshowedthattheHuanglongbingpathogenintheexperimentswasCandidatusLiberibacterasiaticumTheSrDNAsequencegapanalysisindicatedthatthedifferencebetweenAsiansubspeciesandAfricansubspecieswas,whichbetweenAfricansubspeciesandAmericansubspecieswas,whichbetweenAmericansubspeciesandAsiansubspecieswas基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(No)中美合作项目抗虫柑橘品种研究(NoS)福建省财政专项福建省农业科学院科技创新团队建设基金(NoSTIFY)作者简介:孙大光()男硕士研究生主要从事植物内生菌的研究Email:woshisdgcom*通讯作者(责任作者):刘波()男博士研究员从事微生物生物技术与农业生物药物研究Email:liubofaascomKeywords:CitrusHuanglongbingNestedPCRSrDNAPhylogeneticanalysis柑橘黄龙病(CitrusHuanglongbing简称HLB)又叫柑橘青果病(Citrusgreeningdisease)是柑橘生产中最严重的病害之一(Boveetal,)。柑橘黄龙病病原菌是一种只限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌属于变形菌门的α亚群根据病原的热敏性、传播媒介等可以将其分为亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticum)非洲种(CandidatusLiberibacterafricanus)和美洲种(CandidatusLiberibacteramericanus)个种。我国的黄龙病病原为亚洲种(CaLasiaticus)(廖晓兰,)。目前柑橘黄龙病病原菌还是一种难以人工培养的细菌(Doetal,)有关其纯培养的报道很少见柑橘黄龙病病原SrDNA序列已成功测序(Subandiyahetal,)。FangDing等()通过构建系统进化树对我国不同地区柑橘黄龙病病原进行了分类。叶片黄化或斑驳症状是柑橘黄龙病田间诊断的主要依据然而上述典型症状会受到环境条件的影响从而造成柑橘黄龙病诊断的不准确(田亚南等,)。聚合酶链式反应(PCR)技术因具有准确、快速、灵敏等特性被应用于柑橘黄龙病病原的检测(孔维文等,丁芳等,鹿连明等,)。NestedPCR(鹿连明等,)检测柑橘黄龙病病原菌的灵敏度比常规PCR高利用NestedPCR技术可以检测出倍稀释低于fg数量级(丁芳等,)。目前尚未见柑橘植株不同部位叶片黄龙病病原检测的报道。本文采用NestedPCR技术检测柑橘黄龙病植株不同部位叶片携带的黄龙病病原对特异的柑橘黄龙病病原DNA进行测序分析构建不同地区柑橘黄龙病病原菌系统进化树并对不同类型黄龙病病原SrDNA的序列进行差异性分析。以期为柑橘黄龙病的早期诊断和黄龙病病原在柑橘植株体内的分布特性提供一种稳定、可靠的检测技术并且为研究不同类型柑橘黄龙病病原菌进化之间的关系奠定基础。结果与分析柑橘不同部位叶片黄龙病病原的检测柑橘不同部位叶片黄龙病病症表型及其黄龙病病原检测结果见表图。阳性对照和携带有黄龙病病原的叶片DNA均扩增出一条bp的目的片断而阴性对照和没有携带黄龙病病原的叶片DNA均未扩增出相应的条带。份供试叶片中有份叶片检测到携带有黄龙病原阳性检出率为其中个为显性性状分别是东面上部、东面中部、西面下部和北面下部个为隐性性状分别是西面上部、西面中部、北面中部。柑橘黄龙病植株的不同空间位置叶片中黄龙病病原侵染情况有很大差别在不同朝向叶片中西面叶片受黄龙病病原侵染最为严重侵染率为南面叶片未受黄龙病病原侵染。在不同高度叶片中中部叶片受黄龙病病原侵染最为严重侵染率为上部和下部叶片的侵染率为。表不同部位叶片黄龙病病症表型及其黄龙病病原检测结果TableDetectionforcitrusHuanglongbingpathogenofleavesindifferentdirectionsofcitrusplant部位东面East南面Southposition表型Phenotype病原菌遗传型表型Phenotype病原菌遗传型PathogenGenetictypePathogenGenetictypend上部Upside黄化Yellowing显性Dominant正常Normalnd中部Middle斑驳Variegated显性Dominant正常Normalchlorosisndnd下部Downside正常Normal正常Normal(续表)部位西面West北面Northposition表型Phenotype病原菌遗传型表型Phenotype病原菌遗传型PathogenGenetictypePathogenGenetictypend上部Upside正常Normal隐性正常NormalRecessive中部Middle正常Normal隐性正常Normal隐性RecessiveRecessive下部黄化Yellowing显性黄化Yellowing显性DownsideDominantRecessive注:―‖代表检测出黄龙病病原―‖代表没有检测出黄龙病病原―nd‖表示未鉴定或未知。Note:―‖meansthispartcontainshuanglongbingpathogen,―‖meansno―nd‖meansnotbeingidentifiedorunknow图NestedPCR检测不同部位叶片黄龙病病原电泳图M:marker分子量标准(bp、bp、bp、bp、bp、bp、bp、bp、bp、bp、bp、bp、bp、bp):依次为北边上部、中部、下部南边上部、中部、下部西边上部、中部、下部东边上部、中部、下部叶片CK:阳性对照CK:阴性对照琼脂糖凝胶V电泳小时FigNestedPCRdetectionfortheleavesfromdifferentdirectionsinHLBinfectedcitrusplant,CitrusgrandiscvOsbeckM:DNAmarkerLanes–representnorthupside,middle,downsidesouthupside,southmiddle,southdownsidewestupside,westmiddle,westdownsideeastupside,eastmiddle,eastdownsideleavesCKispositivecontrolCKisnegativecontrolagarosegel,V,helectrophoresis柑橘不同部位黄龙病病原SrDNA的测序将柑橘不同部位黄龙病病原SrDNA进行测序的获得条完全相同的SrDNA序列序列长度为bp(图划线部分为引物序列所在位置)。将序列登录到Genbank获得序列号分别为JN(北面中部叶片)、JN(北面下部叶片)、JN(西面上部叶片)、JN(西面中部叶片)、JN(西面下部叶片)、JN(东面上部叶片)、JN(东面中部叶片)。图柑橘黄龙病病原菌SrDNA部分核苷酸序列注:下划线部分为引物FigpartialsequenceofSrDNAfortheleavesfromdifferentdirectionsinHLBinfectedcitrusplant,CitrusgrandiscvOsbeckNote:underlinedisprimersCGRLJf柑橘黄龙病病原SrDNA进化分析将所测得的序列递交GenBank进行Blast同源序列检索结果在亲缘关系相近的前个序列都为柑橘黄龙病病原亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus)同源性达到。用Clustalx软件将本试验获得条序列与GenBank中的条亚洲种(AB、AB和L)、条非洲种(AF和L)和条美洲种(AY)及一条土壤杆菌(Agrobacteriumsp)的SrDNA序列进行多重序列比较后用MEGA软件邻接法构建了系统发育树(图)。该系统树将我们所测得个部位的柑橘黄龙病病原SrDNA序列与个亚洲种聚在同一个类群中。图柑橘黄龙病病原SrDNA序列系统发育树(Bootstrapvalue依据次重复计算)注:AB(亚洲种)AB(亚洲种)L(亚洲种)AF(非洲种)L(非洲种)AY(土壤杆菌)AY(美洲种)FigPhylogenetictreeconstructedusingtheneighbourjoiningmethod,basedonSrDNAsequencedataforChineseHLBbacteriumisolateswithotherrepresentativeisolatesfromGenBank(bootstrappingis,)Note:AB(CandidatusLiberibacterasiaticum)AB(CandidatusLiberibacterasiaticum)L(CandidatusLiberibacterasiaticum)AF(CandidatusLiberibacterafricanus)L(CandidatusLiberibacterafricanus)AY(Agrobacterium)AY(CandidatusLiberibacteramericanus)不同类型黄龙病病原SrDNA的序列差异性分析()应用DNAMANversion软件对本研究中获得的柑橘黄龙病病原序列(登录号:JN)与Genbank中的获取的黄龙病病原的亚洲种(登录号:AB)、非洲种(登录号:L)和美洲种(登录号:AY)的序列进行多重比对结果如表和图所示这种不同类型黄龙病病原序列存在一定的差异性(图中阴影部分表示种不同类型黄龙病病原序列在该位点的差异碱基)差异性为。()亚洲种与非洲种差异性为分别是第bp和bp位点非洲种缺失碱基―G‖第bp、bp、bp、bp和bp位点发生碱基颠换分别是(TC)、(CT)、(GA)、(AG)和(GA)。()亚洲种与美洲种的差异性为有位点发生碱基颠换分别第bp、bp、bp和bp发生GA碱基颠换第bp、bp和bp发生TC碱基颠换第bp和bp发生TG碱基颠换第bp发生GT碱基颠换第bp发生CT碱基颠换第bp发生AG碱基颠换第bp和bp发生AT碱基转换第位点美洲种缺失碱基―A‖。()非洲种与美洲种的差异性为有个位点发生碱基缺失分别是bp位点非洲种缺失碱基―A‖bp位点非洲种缺失碱基―G‖bp美洲种缺失碱基―A‖个位点发生碱基颠换分别是bp(TC)、bp(TC)、bp(GA)、bp(GA)、bp(AG)、bp(AG)、bp(TG)、bp(GT)和bp(TG)个位点发生碱基转换分别是bp和bp发生AT碱基转换。表不同地区柑橘黄龙病病原菌SrDNA序列核苷酸比对TableNucleotidecomparisonofSrDNAsequencebetween―CandidatusLiberibacter‖strainsfromdifferentareas核苷酸位点菌株登录号NucleotidepositionAccessionNOJNABLAYGGAGGATTTCCTTTCTTTCAAATGGGAGGGACCTTGCGCCGGCAAAGAANAGGGGTATAGTATAATGTAGGTGA,,,注:―‖表示该部位碱基缺失Note:―‖meannobaseexistsinthissiteAYGGGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAAGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGTTTGTCTGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGTTGTCTJNGGGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCTGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCTABGGGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCTGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCTLGGGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGATTGTCTGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGTTGTCTAYAAGAGTTCAGGAGAGGTGAGCGGAATTCCGAGTGGAGAGGTGAAATTCGTTGATATTCGGAGGAACGAGTTCAGGAGAGGTGAGGGAATTCCGAGTGAGAGGTGAAATTCGTGATATTCGGAGGAACJNAAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACGAGTTAGGAGAGGTGAGGGAATTCCGAGTGAGAGGTGAAATTCGTGATATTCGGAGGAACABAAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACGAGTTAGGAGAGGTGAGGGAATTCCGAGTGAGAGGTGAAATTCGTGATATTCGGAGGAACLAAGAGTTCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACGAGTTCAGGAGAGGTGAGGGAATTCCGAGTGAGAGGTGAAATTCGTGATATTCGGAGGAACAYAACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACCGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAAJNAACCGGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACCGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAAABAACCGGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACCGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAALAACCGGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACCGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAAAYCCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAJNCCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAABCCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCALCCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAAYTTTCAGTGGCGCAGCTAACGCGTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCATCAGTGGCGCATAACGCTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAJNTTTCAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCATCAGTGGCGCATAACGCTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAABTTTCAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCATCAGTGGCGCATAACGCTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCALTTTCAGTGGCGCACGTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCATCAGTGGCGCATAACGCTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAYAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAAGGAATTGCGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAJNAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAAGGAATTGCGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAABAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAAGGAATTGCGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAALAAAGGAATTGNCGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAAGGAATTGCGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAAYCCCTTACCAGCCCTTGACATGGTGGGACGATATCAGAGATGATATCTTACCAGCCCTTGACATGGACGATATCAGAGATGATATJNCCCTTACCAGCCCTTGACATGTATAGGACGATATCAGAGATGGTATCTTACCAGCCCTTGACATAAGGACGATATCAGAGATGTATABCCCTTACCAGCCCTTGACATGTATAGGACGATATCAGAGATGGTATCTTACCAGCCCTTGACATAAGGACGATATCAGAGATGTATLCCCTTACCAGCCCTTGACATATGTTGGACGATATCAGAGATGATATCTTACCAGCCCTTGACATGGACGATATCAGAGATGATAT图不同类型黄龙病病原SrDNA的序列差异性分析FigGapanalysisofSrDNAsequenceforthedifferentHLBpathogeny讨论柑橘黄龙病的田间诊断只是初步判断柑橘是否感染黄龙病然而有些原因如缺素(胡文召等)、水害(贺红等,)等造成柑橘的病症和柑橘黄龙病症状相混淆因此柑橘黄龙病田间诊断并不能确定其是否携带有柑橘黄龙病病原菌。随着现代分子技术的发展越来越多的手段应用于柑橘黄龙病病原的检测。本研究采用NestedPCR对同一株柑橘(红心柚)不同部位叶片进行黄龙病病原检测作者发现在同一柑橘黄龙病株的不同方位叶子同时存在着黄龙病感染和不感染的部位这一现象提示在对柑橘黄龙病进行调查时靠随机取样往往会误判病害的发生。不同程度病症柑橘黄龙病病原菌的阳性检出率不同柑橘(红心柚)叶片严重黄化植株黄龙病病原菌的阳性检出率为。结果表明了柑橘黄龙病发病状态的异质性这种差异或是柑橘不同部位叶片对黄龙病病原菌的抵抗能力造成的或是柑橘黄龙病病原入侵柑橘叶片的途径有所差异。关于柑橘不同部位叶片黄龙病病原携带情况异质性的研究未见报道。通过对比柑橘不同部位叶片的黄化情况和柑橘黄龙病病原检测结果对比分析所有的黄化叶片都带有柑橘黄龙病病原而有些无柑橘黄龙病症状叶片的柑橘黄龙病病原检测结果却呈现出阳性。这说明有些叶片不表现出典型的黄龙病病症并不代表叶片内没有黄龙病病原已有研究表明(谢钟琛,)柑橘黄龙病的潜伏期为个月所以在部分无黄龙病病症叶片中可以检测出柑橘黄龙病病原菌的存在。同时作者发现在柑橘不同部位(上、中、下)、不同方位(东、西、南、北)采集到的黄龙病叶片尽管有的为隐性、有的为显性、有的无症状其SrDNA序列完全相同表明侵染的病原无分化表型差异只是病程特性的差异。已有报道(DingFetal,)通过对我国不同地区柑橘黄龙病病原的SrDNA序列分析得出柑橘黄龙病病原属于亚洲种CandidatusLiberibacterasiaticus。本研究将柑橘个部位叶片黄龙病病原菌SrDNA的序列在NCBI网站比对(Blast)发现顺昌红心柚黄龙病病原菌属于亚洲种CandidatusLiberibacterasiaticus这与FangDing等()的结果相同。通过JN等个序列与不同地区柑橘黄龙病病原SrDNA的比对分析和系统进化分析得知JN等个序列与亚洲型柑橘黄龙病病原的同源性高于非洲型和美洲型该序列为以后比较与其它地区柑橘黄龙病的同源性以及对病原分类地位的研究都奠定了一定的基础。材料与方法材料柑橘样本采集:于年月日在顺昌北门水库边赵氏园艺技术研究所果树基地(经纬度东经北纬)进行样本采集采集方法选择一株具有典型黄龙病病症的红心柚(CitrusgrandisOsbeckChandler)分别从植株东面、南面、西面、北面取其上部、中部、下部共个部位叶片并记录不同方位叶片症状。置于冰箱保存备用。试剂与仪器:CTAB、β巯基乙醇、异戊醇、氯仿、引物(博尚公司合成)、PCR仪、BioRad电泳仪、UVP凝胶成像系统等。方法柑橘叶脉总DNA的提取采用改良的CTAB法提取叶脉总DNA(丁芳等)。柑橘黄龙病病原菌检测采用NestedPCR技术检测柑橘黄龙病病原以本实验室现有红心柚黄龙病叶片DNA做为阳性对照红心柚健康叶片DNA为阴性对照。μL的扩增体系中含有UTaq酶μL的PCRBufferμL的mM的种dNTPμL的μM的引物和ng的DNA模板每个反应重复次。先使用外引物进行第一轮扩增内引物进行第二轮扩增将第一轮扩增的产物稀释倍作为第二轮扩增的模板。引物序列、扩增程序见表。扩增产物在电压V琼脂糖凝胶电泳EB染色使用UVP凝胶成像系统照相。表PCR引物序列及其扩增程序TablePrimersequenceandamplificationprocedureaboutNestedPCR分析步骤PCR反应程序引物序列PrimersAnalysisPCRresponseproceduressteps第一步CGF:’RGGGAAAGATTTTATTGGAG’预变性min变性s退火sNestedPCRCGR:延伸s个循环后延伸min。’GAAAATAYCATCTCTGATATCGT’(外引物)第二部预变性min变性s退火sLJf:’CGGGCGATTAAGTTAGAGGT’NestedPCRCGR:’GAAAATAYCATCTCTGATATCGT’延伸s个循环后延伸min。(内引物)柑橘不同部位黄龙病病原菌SrDNA的测序及序列分析将个部位的柑橘黄龙病病原菌SrDNA进行测序并将序列录入到Genbank。使用DNAstar软件的MegAlign将个部位的柑橘黄龙病病原菌SrDNA进行同源性比对黄龙病病原菌的SrDNA序列分析及其进化树的构建NestedPCR的引物是根据黄龙病病原菌亚洲种SrDNA部分序列设计的将第二步NestedPCR产物进行纯化送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序。所得到的序列通过NCBI网站的Blast在线比对。从GenBank中获取不同来源的柑橘黄龙病病原的SrDNA序列用于序列同源性分析。参考DingFang等()的方法将不同来源的柑橘黄龙病病原的SrDNA序列用Clustalx软件进行多序列比对并用MEGA软件分析比对的结果使用邻接法(Neiborjoining,NJ)构建系统进化树Bootstrapvalue依据次重复计算。不同类型黄龙病病原SrDNA的序列差异性分析应用DNAMANversion软件对本研究中获得的柑橘黄龙病病原序列与Genbank中的获取的黄龙病病原的亚洲种(登录号:AB)、非洲种(登录号:L)和美洲种(登录号:AY)的序列进行多重比对。参考文献BoveJM,,Huanglongbing:adestructive,newlyemerging,centuryolddiseaseofcitrus,JournalofPlantPathology,():DingF,YiGJ,WangGP,,ResearchonthePCRandNestedPCRdetectionofcitrusHuanglongbingpathogen,ActaHorticulturaeSinina,():(丁芳,易干军,王国平,,应用PCR及NestedPCR技术检测柑橘黄龙病病原研究,园艺学报,():)DingF,DengX,HongN,,PhylogeneticanalysisofthecitrusHuanglongbing(HLB)bacteriumbasedonthesequencesofSrDNAandSSrDNAintergenicregionsamongisolatesinChina,Europeanjournalofplantpathology,():DoC,TeixeiraD,DanetJ,EveillardS,,CitrusHuanglongbinginSoPauloState,Brazil:PCRdetectionoftheCandidatusLiberibacterspeciesassociatedwiththedisease,Molecularandcellularprobes,():HeH,ZhangGF,PanCM,HuangHB,LinXH,,NewrecordofHuanglongbingonCitrusmedicavarSarcodactylis(Noot)swingleinGuangdong,ActaPhytopathologicaSinica,():(贺红,张桂芳,潘超美等,,佛手柑黄龙病发生初报,植物病理学报,():)HuWZ,ZhouCY,,AdvancesinthepathogenofcitrusHuanglongbing,PlantProtection,()(胡文召周常勇柑橘黄龙病病原研究进展植物保护,():)KongWW,DengXL,,CloningandsequencingofthecitrusHuanglongbingpathogenDNA,ActaPhytopathologicaSinica,():(孔维文,邓晓玲,,柑桔黄龙病病原DNA片段的克隆及序列分析植物病理学报,():)LiaoXL,ZhuSF,ZhaoWJ,LuoK,QiYX,ChenHY,HeK,ZhuXX,,JournalofAgriculturalBiotechnology,():(廖晓兰,朱水芳,赵文军,罗宽,漆艳香,陈红运,何昆,朱晓湘,,柑桔黄龙病病原SrDNA克隆,测序及实时荧光PCR检测方法的建立,农业生物技术学报,():)LuLM,HuXR,ZhangLP,HuangZD,ChenGQ,,AComparisonofDetectionSensitivityofConventionalPCRandNestedPCRforCitrusHuanglongbingPathogen,ChineseJournalofTropicalCrops,():(鹿连明,胡秀荣,张利平,黄振东,陈国庆,,常规和巢式PCR对柑橘黄龙病菌的检测灵敏度比较,热带作物学报,():)SubandiyahS,IwanamiT,TsuyumuS,,ComparisonofSrDNAandSSintergenicregionsequencesamongcitrusgreeningorganismsinAsia,PlantDisease,():TianYN,KeC,,TheprogressondiagnosisanddetectionofcitrusHuanglongbing,FujianJournalofAgriculturalSciences,():(田亚南,柯冲,,柑桔黄龙病诊断法的研究进展,福建农业学报,():)XieZC,LiJ,ShiQ,,DamageandepidemicsofCitrusHuanglongbinginFujianprovince,ScientiaAgriculturaSinica,():(谢钟琛,李健,施清,,福建省柑橘黄龙病危害及其流行规律研究,中国农业科学,():)

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