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柑橘黄龙病原16SrDNA 序列异质性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 病原分析序列柑 1 柑橘黄龙病原16SrDNA序列异质性分析 1,222,2344 孙大光～郑雪芳～刘波～阮传清～范国成～Hall D.～段永平 (1福建师范大学生命科学学院，福州350108;2福建省农业科学院农业生物资源研 究所，福州 350003;3福建省农业科学院果树研究所，福州 350003 ;4美国农业 部佛罗里达园艺试验室，弗罗里达34945) 摘要:本研究采用Nested-PCR技术检测柑橘不同部位叶片黄龙病病原携带情况，通过对柑橘黄龙病病原菌16S rDNA 的测序并构建系统发育树，比较不同地区柑橘黄龙病病原菌之间的进化关系，并分析不同地区的柑橘黄龙病病原菌 16S rDNA的序列差异性。结果表明:顺昌红心柚叶片黄龙病病原菌阳性检出率为58.33%，其中33%(4个)为显性 性状，25%(3个)为隐性性状。不同部位叶片内柑橘黄龙病病原16S rDNA的同源性达99%以上。不同地区的柑橘 黄龙病病原菌16S rDNA进化分析表明，顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型，其16S rDNA的序列差异性分析表明， 亚洲种与非洲种的差异性为2.75%，非洲种与美洲种的差异性为3.90%，亚洲种与美洲种的差异性为3.44%。 关键词:柑橘黄龙病，巢式PCR，16S rDNA，系统进化分析 Phylogenic analysis on citrus Huanglongbing(HLB)pathogen by 16S rDNA sequence in the leaves from different parts of infected citrus plant ～1222*SUN Da-guang，ZHENG Xue-fang，LIU Bo, 2344 RUAN Chuan-qing, FAN Guo-cheng, Hall D., DUAN Yong-ping 1. College Of Life Science Fujian normal university, Fuzhou 350108, China; 2. Agricultural Bio-Resource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China; 3. Research Institute of Pomology , Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China; 4. Horticultural Research Laboratory (USDA/ARS), Florida, 34945, U.S.A Abstract:The leaves were sampled in the different directions of HLB-infected citrus plant, Citrus grandis Osbeck cv.Chandler. The Nested-PCR detection of citrus leaf HLB pathogen was carried. The phylogenetic tree based on 16SrDNA sequencing was built to find out the evolutionary relationship among the citrus HLB pathogens from the different parts of a citrus plant. The results showed that the positive detection rate was 58.33% in the leaves from the different directions of HLB-infected citrus plant, among which 33% were dominant character, 25% were recessive character. The similarity of 16S rDNA sequences in the leaves from the different parts of a HLB-infected citrus plant were up to 99%, it meant that no differentiation of HLB happened in the leaves from different parts of the citrus no matter with dominant or recessive. The 16S rDNA phylogenetic analysis showed that the Huanglongbing pathogen in the experiments was Candidatus Liberibacter asiaticum. The 16S rDNA sequence gap analysis indicated that the difference between Asian subspecies and African subspecies was 2.75%, which between African subspecies and American subspecies was 3.90%, which between American subspecies and Asian subspecies was 3.44%. 基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项 (No.201003067-05);中美合作项目-抗虫柑橘品种研究(No.6618-22000-037-01S);福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金(No.STIF-Y03) 作者简介:孙大光(1987—)，男，硕士研究生.，主要从事植物内生菌的研究，E-mail:woshisdg@163.com *通讯作者(责任作者):刘波(1957—)，男，博士，研究员，从事微生物生物技术与农业生物药物研究，E-mail:liubofaas@163.com 2 Keywords:Citrus Huanglongbing，Nested-PCR，16S rDNA，Phylogenetic analysis 柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，简称HLB)又叫柑橘青果病(Citrus greening disease)是柑橘生产中最严重的病害之一(Bove et al., 2006)。柑橘黄龙病病原菌是一种只限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌，属于变形菌门的α亚群，根据病原的热敏性、传播媒介等可以将其分为亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticum)，非洲种(Candidatus Liberibacter africanus)和美洲种(Candidatus Liberibacter americanus)3个种。我国的黄龙病病原为亚洲种(Ca.L.asiaticus)(廖晓兰, 2004)。目前柑橘黄龙病病原菌还是一种难以人工培养的细菌(Do et al., 2005)，有关其纯培养的报道很少见，柑橘黄龙病病原16S rDNA序列已成功测序(Subandiyah et al., 2000)。Fang Ding等(2009)通过构建系统进化树对我国不同地区柑橘黄龙病病原进行了分类。 叶片黄化或斑驳症状是柑橘黄龙病田间诊断的主要依据，然而上述典型症状会受到环境条件的影响，从而造成柑橘黄龙病诊断的不准确(田亚南等, 1998)。聚合酶链式反应(PCR)技术因具有准确、快速、灵敏等特性被应用于柑橘黄龙病病原的检测(孔维文等, 2000;丁芳等, 2004;鹿连明等, 2010)。Nested-PCR(鹿连明等, 2010)检测柑橘黄龙病病原菌的灵敏度比常规PCR高，利用 - 8Nested-PCR技术可以检测出10倍稀释，低于fg数量级(丁芳等, 2004)。目前尚未见柑橘植株不同部位叶片黄龙病病原检测的报道。本文采用Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病植株不同部位叶片携带的黄龙病病原，对特异的柑橘黄龙病病原DNA进行测序分析，构建不同地区柑橘黄龙病病原菌系统进化树，并对不同类型黄龙病病原16S rDNA的序列进行差异性分析。以期为柑橘黄龙病的早期诊断和黄龙病病原在柑橘植株体内的分布特性提供一种稳定、可靠的检测技术，并且为研究不同类型柑橘黄龙病病原菌进化之间的关系奠定基础。 1结果与分析 1.1柑橘不同部位叶片黄龙病病原的检测 柑橘不同部位叶片黄龙病病症表型及其黄龙病病原检测结果见表1，图1。阳性对照和携带有黄龙病病原的叶片DNA均扩增出一条440bp的目的片断，而阴性对照和没有携带黄龙病病原的叶片DNA均未扩增出相应的条带。12份供试叶片中有7份叶片检测到携带有黄龙病原，阳性检出率为58.33%，其中4个为显性性状，分别是东面上部、东面中部、西面下部和北面下部，3个为隐性性状，分别是西面上部、西面中部、北面中部。柑橘黄龙病植株的不同空间位置叶片中，黄龙病病原侵染情况有很大差别，在不同朝向叶片中，西面叶片受黄龙病病原侵染最为严重，侵染率为100%，南面叶片未受黄龙病病原侵染。在不同高度叶片中，中部叶片受黄龙病病原侵染最为严重，侵染率为75%，上部和下部叶片的侵染率为50%。 表1不同部位叶片黄龙病病症表型及其黄龙病病原检测结果 Table 1 Detection for citrus Huanglongbing pathogen of leaves in different directions of citrus plant 部位 东面East 南面South position 表型Phenotype 病原菌遗传型 表型Phenotype 病原菌遗传型 Pathogen Genetic type Pathogen Genetic type + - nd 上部Upside 黄化Yellowing 显性Dominant 正常 Normal + - nd 中部Middle 斑驳Variegated 显性Dominant 正常Normal chlorosis - nd - nd 下部Downside 正常Normal 正常Normal 3 (续表2) 部位 西面West 北面North position 表型Phenotype 病原菌遗传型 表型Phenotype 病原菌遗传型 Pathogen Genetic type Pathogen Genetic type + - nd 上部Upside 正常Normal 隐性正常Normal Recessive + + 中部Middle 正常Normal 隐性正常Normal 隐性 Recessive Recessive + + 下部黄化Yellowing 显性黄化Yellowing 显性Downside Dominant Recessive 注:―+‖代表检测出黄龙病病原，―-‖代表没有检测出黄龙病病原，―nd‖表示未鉴定或未知。Note: ―+‖ means this part contains huanglongbing pathogen, ―-‖means no，―nd‖means not being identified or unknow 图1 Nested-PCR检测不同部位叶片黄龙病病原电泳图 M:marker分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 (3000bp、2000bp、1500bp、1200bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，1-12:依次为北边上部、中部、下部，南边上部、中部、下部，西边上部、中部、下部，东 边上部、中部、下部叶片，CK+:阳性对照，CK-:阴性对照;1.5%琼脂糖凝胶，90V电泳， 1小时 Fig 1 Nested-PCR detection for the leaves from different directions in HLB-infected citrus plant, Citrus grandis cv Osbeck M: DNA marker; Lanes 1–12represent north upside, middle , downside; south upside , south middle , south downside; west upside, west middle, west downside; east upside , east middle , east downside leaves; CK+ is positive control;CK-is negative control;1.5% agarose gel,90V,1h electrophoresis 1.2柑橘不同部位黄龙病病原16S rDNA的测序 将柑橘不同部位黄龙病病原16S rDNA进行测序的，获得7条完全相同的16S rDNA序列，序列长度为443bp(图2，划线部分为引物序列所在位置)。将序列登录到Genbank，获得序列号分别为JN185609(北面中部叶片)、JN168868(北面下部叶片)、JN185610(西面上部叶片)、JN185611(西面中部叶片)、JN185612(西面下部叶片)、JN185613(东面上部叶片)、JN185614(东面中部叶片)。 图2柑橘黄龙病病原菌16S rDNA部分核苷酸序列 4 注:下划线部分为引物 Fig 2 partial sequence of 16S rDNA for the leaves from different directions in HLB-infected citrus plant, Citrus grandis cv Osbeck Note : underlined is primers CG05R/LJ74f 1.3柑橘黄龙病病原16S rDNA进化分析 将所测得的序列递交GenBank进行Blast同源序列检索，结果在亲缘关系相近的前100个序列都为柑橘黄龙病病原亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)，同源性达到99%。用Clustalx 1.83软件将本试验获得7条序列与GenBank中的3条亚洲种(AB038369、AB008366和L22532)、2条非洲种(AF137368和L22533)和1条美洲种(AY919312)及一条土壤杆菌(Agrobacterium sp)的16S rDNA序列进行多重序列比较后，用MEGA 4.0软件邻接法构建了系统发育树(图3)。该系统树将我们所测得7个部位的柑橘黄龙病病原16S rDNA序列与3个亚洲种聚在同一个类群中。 图3柑橘黄龙病病原16Sr DNA序列系统发育树 (Bootstrap value依据1000次重复计算) 注:AB038369(亚洲种);AB008366(亚洲种);L22532(亚洲种);AF137368(非洲种);L22533(非洲种);AY528932 (土壤杆菌);AY919312(美洲种) Fig 3 Phylogenetic tree constructed using the neighbour-joining method, based on 16S rDNA sequence data for Chinese HLB bacterium isolates with other representative isolates from GenBank (bootstrapping is 10,000). Note :AB038369(Candidatus Liberibacter asiaticum);AB008366(Candidatus Liberibacter asiaticum);L22532(Candidatus Liberibacter asiaticum);AF137368(Candidatus Liberibacter africanus);L22533(Candidatus Liberibacter africanus); AY528932(Agrobacterium);AY919312(Candidatus Liberibacter americanus) 1.4不同类型黄龙病病原16S rDNA的序列差异性分析 (1)应用DNAMAN version 5.2.2.0软件对本研究中获得的柑橘黄龙病病原序列(登录号:JN168868)与Genbank中的获取的黄龙病病原的亚洲种(登录号:AB038369)、非洲种(登录号: 5 L22533)和美洲种(登录号:AY919312)的序列进行多重比对，结果如表2和图4所示，这3种不同类型黄龙病病原序列存在一定的差异性(图中阴影部分表示3种不同类型黄龙病病原序列在该位点的差异碱基)，差异性为2.14%。 (2)亚洲种与非洲种，差异性为2.75%，分别是第28bp和353bp位点，非洲种缺失碱基―G‖，第59bp、224bp、410bp、412bp和433bp位点发生碱基颠换，分别是(T/C)、(C/T)、(G/A)、(A/G)，和(G/A)。 (3)亚洲种与美洲种的差异性为3.44%，有12位点发生碱基颠换，分别第28bp、134bp、176bp和433bp发生G/A碱基颠换，第72bp、85bp和99bp发生T/C碱基颠换，第411bp和413bp发生T/G碱基颠换，第59bp发生G/T碱基颠换，第224bp发生C/T碱基颠换，第281bp发生A/G碱基颠换，第115bp和412bp发生A/T碱基转换，第414位点美洲种缺失碱基―A‖。 (4)非洲种与美洲种的差异性为3.90%，有3个位点发生碱基缺失，分别是28bp位点非洲种缺失碱基―A‖，353bp位点非洲种缺失碱基―G‖，414bp美洲种缺失碱基―A‖，9个位点发生碱基颠换，分别是85bp(T/C)、99bp(T/C)、134bp(G/A)、176bp(G/A)、281bp(A/G)、410bp(A/G)、411bp(T/G)、412bp(G/T)和413bp(T/G)，2个位点发生碱基转换，分别是59bp和115bp发生A/T碱基转换。 表 2不同地区柑橘黄龙病病原菌16S rDNA序列核苷酸比对 Table 2 Nucleotide comparison of 16S rDNA sequence between ―Candidatus Liberibacter‖ strains from different areas 核苷酸位点 菌株登录号 Nucleotide position Accession NO JN168868 AB038369 L22533 AY919312 28 G G - A 59 G G A T 72 T T C C 85 T T T C 99 T T T C 115 A A A T 134 G G G A 176 G G G A 224 C C T T 273-74 GC GC CG GC 281 A A A G 335 A A N A 353 G G - G 410-414 GTATA GTATA ATGTA GGTG- 433 A , , , 注:―-‖ 表示该部位碱基缺失 Note: ―-‖mean no base exists in this site 6 AY919312GGGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAAGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGTTTGTCTGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGTTGTCT 65JN168868GGGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCTGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCT 65AB038369GGGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCTGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCT 65L22533GGGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCA.GGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGATTGTCTGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGTTGTCT 64AY919312AAGAGTTCAGGAGAGGTGAGCGGAATTCCGAGTGGAGAGGTGAAATTCGTTGATATTCGGAGGAACGAGTTCAGGAGAGGTGAGGGAATTCCGAGTGAGAGGTGAAATTCGTGATATTCGGAGGAAC 130JN168868AAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACGAGTTAGGAGAGGTGAGGGAATTCCGAGTGAGAGGTGAAATTCGTGATATTCGGAGGAAC 130AB038369AAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACGAGTTAGGAGAGGTGAGGGAATTCCGAGTGAGAGGTGAAATTCGTGATATTCGGAGGAAC 130L22533AAGAGTTCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACGAGTTCAGGAGAGGTGAGGGAATTCCGAGTGAGAGGTGAAATTCGTGATATTCGGAGGAAC 129AY919312AACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACCGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAA 195JN168868AACCGGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACCGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAA 195AB038369AACCGGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACCGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAA 195L22533AACCGGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACCGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAA 194AY919312CCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCA 260JN168868CCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCA 260AB038369CCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCA 260L22533CCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCAAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCA 259AY919312TTTCAGTGGCGCAGCTAACGCGTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCATCAGTGGCGCATAACGCTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCA 325JN168868TTTCAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCATCAGTGGCGCATAACGCTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCA 325AB038369TTTCAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCATCAGTGGCGCATAACGCTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCA 325L22533TTTCAGTGGCGCACGTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCATCAGTGGCGCATAACGCTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCA 324AY919312AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAAGGAATTGCGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAA 390JN168868AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAAGGAATTGCGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAA 390AB038369AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAAGGAATTGCGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAA 390L22533AAAGGAATTGNCGGGGGCCCGCACAAGC.GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAAAGGAATTGCGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAA 388AY919312CCCTTACCAGCCCTTGACATGGTG.GGACGATATCAGAGATGATATCTTACCAGCCCTTGACATGGACGATATCAGAGATGATAT 434JN168868CCCTTACCAGCCCTTGACATGTATAGGACGATATCAGAGATGGTATCTTACCAGCCCTTGACATAAGGACGATATCAGAGATGTAT 435AB038369CCCTTACCAGCCCTTGACATGTATAGGACGATATCAGAGATGGTATCTTACCAGCCCTTGACATAAGGACGATATCAGAGATGTAT 435L22533CCCTTACCAGCCCTTGACATATGTTGGACGATATCAGAGATGATATCTTACCAGCCCTTGACATGGACGATATCAGAGATGATAT 433 图4不同类型黄龙病病原16S rDNA的序列差异性分析 Fig 4 Gap analysis of 16S rDNA sequence for the different HLB pathogeny 2讨论 柑橘黄龙病的田间诊断只是初步判断柑橘是否感染黄龙病，然而有些原因如缺素(胡文召等，2010)、水害(贺红等, 2005)等造成柑橘的病症和柑橘黄龙病症状相混淆，因此柑橘黄龙病田间诊断并不能确定其是否携带有柑橘黄龙病病原菌。随着现代分子技术的发展，越来越多的手段应用于柑橘黄龙病病原的检测。本研究采用Nested-PCR对同一株柑橘(红心柚)不同部位叶片进行黄龙病病原检测，作者发现，在同一柑橘黄龙病株的不同方位叶子，同时存在着黄龙病感染和不感染的部位，这一现象提示，在对柑橘黄龙病进行调查时，靠随机取样往往会误判病害的发生。不同程度病症柑橘黄龙病病原菌的阳性检出率不同，柑橘(红心柚)叶片严重黄化植株黄龙病病原菌的阳性检出率为58.3%。结果表明了柑橘黄龙病发病状态的异质性，这种差异或是柑橘不同部位叶片对黄龙病病原菌的抵抗能力造成的，或是柑橘黄龙病病原入侵柑橘叶片的途径有所差异。关于柑橘不同部位叶片黄龙病病原携带情况异质性的研究未见报道。 通过对比柑橘不同部位叶片的黄化情况和柑橘黄龙病病原检测结果对比分析，所有的黄化叶片都带有柑橘黄龙病病原，而有些无柑橘黄龙病症状叶片的柑橘黄龙病病原检测结果却呈现出阳性。这说明有些叶片不表现出典型的黄龙病病症，并不代表叶片内没有黄龙病病原，已有研究表明(谢钟琛, 2009)，柑橘黄龙病的潜伏期为6-18个月，所以在部分无黄龙病病症叶片中可以检测出柑橘黄龙病病原菌的存在。同时，作者发现，在柑橘不同部位(上、中、下)、不同方位(东、西、南、北)采集到的黄龙病叶片，尽管有的为隐性、有的为显性、有的无症状，其16S rDNA序列完全相同，表明侵染的病原无分化，表型差异只是病程特性的差异。 7 已有报道(Ding F et al.,2009)通过对我国不同地区柑橘黄龙病病原的16S rDNA序列分析得出柑橘黄龙病病原属于亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus。本研究将柑橘7个部位叶片黄龙病病原菌16S rDNA的序列在NCBI网站比对(Blast)，发现顺昌红心柚黄龙病病原菌属于亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus，这与Fang Ding等(2009)的结果相同。通过JN168868等7个序列与不同地区柑橘黄龙病病原16S rDNA的比对分析和系统进化分析，得知JN168868等7个序列与亚洲型柑橘黄龙病病原的同源性高于非洲型和美洲型，该序列为以后比较与其它地区柑橘黄龙病的同源性，以及对病原分类地位的研究都奠定了一定的基础。 3材料与方法 3.1材料 柑橘样本采集:于2010年7月23日在顺昌北门水库边赵氏园艺技术研究所果树基地(经纬度，东经117.8?，北纬26.8?)进行样本采集;采集方法，选择一株具有典型黄龙病病症的红心柚(Citrus grandis Osbeck.Chandler)，分别从植株东面、南面、西面、北面取其上部、中部、下部共12个部位叶片，并记录不同方位叶片症状。置于4?冰箱保存备用。试剂与仪器:CTAB、β-巯基乙醇、异戊醇、氯仿、引物(博尚公司合成)、PCR仪、Bio-Rad电泳仪、UVP凝胶成像系统等。 3.2方法 3.2.1柑橘叶脉总DNA的提取 采用改良的CTAB法提取叶脉总DNA (丁芳等，2004)。 3.2.2柑橘黄龙病病原菌检测 采用Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原，以本实验室现有红心柚黄龙病叶片DNA做为阳性对照，红心柚健康叶片DNA为阴性对照。25μL的扩增体系中含有1U Taq酶，2.5 μL的10×PCR Buffer，0.5μL的10 mM的4种dNTP，1μL的10μM的引物和25 ng的DNA模板，每个反应重复3次。先使用外引物进行第一轮扩增，内引物进行第二轮扩增，将第一轮扩增的产物稀释100倍作为第二轮扩增的模板。引物序列、扩增程序见表3。扩增产物在电压90V，1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，使用UVP凝胶成像系统照相。 表3 PCR引物序列及其扩增程序 Table 3 Primer sequence and amplification procedure about Nested-PCR 分析步骤 PCR反应程序 引物序列Primers Analysis PCR response procedures steps 第一步CG03F :5’-RGGGAAAGATTTTATTGGAG-3’; 预变性94?3min;变性94?30s，53?退火30s，Nested PCR CG05R: 72?延伸45s，40个循环;72?后延伸7min。 5’-GAAAATAYCATCTCTGATATCGT-3’ (外引物) 第二部预变性94?3min;变性94? 30s，53?退火30s，LJ74f:5’-CGGGCGATTAAGTTAGAGGT-3’; Nested PCR CG05R:5’-GAAAATAYCATCTCTGATATCGT-3’ 72?延伸30s，35个循环;72?后延伸7min。 (内引物) 3.2.3柑橘不同部位黄龙病病原菌16S rDNA的测序及序列分析 将7个部位的柑橘黄龙病病原菌16S rDNA进行测序并将序列录入到Genbank。使用DNAstar软件的MegAlign将7个部位的柑橘黄龙病病原菌16S rDNA进行同源性比对， 3.2.4黄龙病病原菌的16S rDNA序列分析及其进化树的构建 Nested-PCR的引物是根据黄龙病病原菌亚洲种16S rDNA部分序列设计的，将第二步Nested-PCR产物进行纯化，送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序。所得到的序列通过NCBI网站的Blast在线比对。从GenBank中获取不同来源的柑橘黄龙病病原的16Sr DNA序列，用于序列 8 同源性分析。参考Ding Fang等(2009)的方法，将不同来源的柑橘黄龙病病原的16Sr DNA序列用 Clustalx 1.83软件进行多序列比对，并用MEGA 4.0软件分析比对的结果，使用邻接法 (Neibor-joining,NJ)构建系统进化树，Bootstrap value依据1000次重复计算。 3.2.5不同类型黄龙病病原16S rDNA的序列差异性分析 应用DNAMAN version 5.2.2.0软件对本研究中获得的柑橘黄龙病病原序列与Genbank中的获取 的黄龙病病原的亚洲种(登录号:AB038369)、非洲种(登录号:L22533)和美洲种(登录号:AY919312) 的序列进行多重比对。 参考文献 Bove J.M., 2006, Huanglongbing:a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus, Journal of Plant Pathology, 88(1): 7-37 Ding F., Yi G.J., Wang G.P., 2004, Research on the PCR and Nested-PCR detection of citrus 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