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基因组DNA- CTAB法.doc

基因组DNA- CTAB法

齐P小裤衩
2017-11-13 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《基因组DNA- CTAB法doc》,可适用于综合领域

基因组DNACTAB法CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性在高离子强度的溶液中(>molLNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来注:CTAB溶液在低于时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于基因组DNACTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方TrisHCl(pH)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏EDTA螯合Mg或Mn离子,抑制DNase活性NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离β巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNACTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染同时它也能和多糖结合,有效去除多糖基因组DNA的提取核酸分离,纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提供相应的缓冲体系采用有机(酚氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔离心分离两相时,应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取核酸分离,纯化蛋白质的去除:酚氯仿抽提使用变性剂变性(SDS,异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯化多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入体积的MNaCl,高盐可溶解多糖用多糖水解酶将多糖降解在提取缓冲液中加一定量的氯苯(体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖用PEG代替乙醇沉淀DNA:在μLDNA液中加入μlPEG(含MNaCl),冰浴min核酸分离,纯化多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β巯基乙醇,抗坏血酸,半胱氨酸,二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除:的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA的目的另一种方式加入体积的NaAc(pH,M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用的乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg或Mn离子,抑制DNasepH值为,可防止DNA发生酸解。基因组DNA提取常见问题DNA中含有蛋白,多糖,多酚类杂质DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子有RNA的存留原因对策重新纯化DNA,过吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等杂质重新沉淀DNA,让酒精充分挥发增加乙醇洗涤的次数(次)加入RNase降解RNA问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应DNA提取常见问题材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融问题二:DNA降解DNA提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料动植物要匀浆研磨充分G菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)增加吸附的时间,或低温沉淀小心操作

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