IP免疫沉淀实验

IP免疫沉淀实验 免疫沉淀(IP) 免疫沉淀是根据抗原抗体结合原理、使用特异性的抗体以及protein A/G-coupled agarose beads从细胞或者组织裂解物标本中特异性纯化目的蛋白的方式。因为使用的是物理性性的分离办法，纯化后的蛋白可进一步进行其他实验和研究，如:WB。 免疫沉淀基本步骤: 制备细胞/组织裂解物 预纯化裂解物 免疫沉淀 第一步:制备细胞/组织裂解物 A:制备细胞裂解物 非变性方法: 将培养皿放在冰上，并用预冷的PBS洗涤细胞两次 倒掉PBS，加入预冷的细胞裂解液(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶). 用预冷的细胞刮将细胞轻轻的刮下，然后将细胞悬浮液转移到预冷的离心管中 4?，缓慢晃动20min(EP管插冰上，置水平摇床上) 4?C.离心，一般用12000rpm离心20分钟，但是要根据具体的细胞类型选择合适的离心速度和时间。 轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中(保持冰浴)，弃沉淀 变性方法: 每 0.5-2 x 107 的细胞加入1ml变性裂解液. 用最大速度漩涡混匀细胞2-3s，将细胞悬液转移到新的epdoff管中. (此时由 于DNA的释放，溶液可能很黏稠。) 95?C 加热5分钟 加入0.9ml非变性裂解液，轻轻混匀(非变性裂解液中的1% Triton X-100可以淬灭变性裂解液中的SDS) 用1ml针头注射器反复吸取裂解物5-10次以破碎DNA (重复这一机械破碎操作直到溶液比较清冽不太黏稠。.如果DNA没有被完全消化，会影响离心时上清和 ) 沉淀的分开。 4?C.离心，一般用12000rpm离心20分钟，但是要根据具体的细胞类型选择合适的离心速度和时间。 轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中(保持冰浴)，弃沉淀 B:制备组织裂解物 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80?C以备后用。 每5mg组织加入300ul裂解液，使用电子匀浆器将组织匀浆。 用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4?C缓慢摇动2小时 12000rpm 4?C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中(保持冰浴)，弃沉淀 。 裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量(如果需要的话)。蛋白的合适浓度为 1-5 mg/ml ，最低不能少于0.1 mg/ml。 Note:如果要进行变性操作，则使用变性裂解液进行步骤3和4的操作 第二步:预纯化裂解物 使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。 主要步骤: 每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体(例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG)或者正常血清(常用兔血清)，冰浴1小时 加100 μl Preotein A/G agarose beads， 4?C缓慢摇动10-30分钟 14,000 x g 4?C离心10分钟 取上清，弃沉淀 为提高蛋白回收率，可将Preotein A/G agarose beads(上述沉淀)用裂解液洗涤1-2次，所得上清和前面的合在一起 Note:要确保最大可能将正常血清(或无关Ig)从标本中去除。 第三步:免疫沉淀 取10-500 μg细胞裂解物，加入推荐量的抗体:抗体用量取决于蛋白的量以及抗体的亲和力。可参考 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 推荐的抗体用量，如果说明书没有推荐，也可以参 . 考以下数据: 多抗血清:1-5 μl 亲和纯化的多抗:1 μg 腹水(单抗):0.2-1 μl 培养上清(单抗):20 -100 μl 4?缓慢摇动孵育1hr到过夜，取决于蛋白的量以及抗体的亲和力 同时准备Preotein A/G agarose beads。建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠:根据抗体类型选择合适的beads(参考附 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 2)，如果IP抗体是IgM:不使用protein-A/G beads，直接使用Goat anti Mouse IgM beads。 加入混匀的70-100ul protein-A/G beads，4?缓慢摇动4hr(根据具体实验优化孵育时间) 2500rpm(约1000g) 4?C离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。 用准备蛋白样品时的裂解液洗涤沉淀3-5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤3。 最后一次洗涤后，去除上清，加入25-50ul 2×电泳上样缓冲液，95-100?C煮沸5分钟(将蛋白变性并从protein-A/G beads中分离下来)。离心后取上清，弃沉淀。得到的上清可以即可进行后续WB分析或-80?C保存。 Loading buffer是最强力的洗脱液，所以同时也会将无关的结合抗体或抗体片段洗脱下来，这些在后面电泳时会有所体现。抗原可以使用梯度甘氨酸 溶液(up to 1 M)从抗体上洗脱下来。 附1:免疫沉淀中用到的主要buffer和试剂 裂解buffer中各种成分的推荐浓度范围 Salts: 0-1 M Detergent, non-ionic: 0.1-2% Detergent, ionic: 0.01-0.5% Divalent cations: 0-10 mM EDTA: 0-5 mM pH: 6-9 1. 非变性裂解buffer: 适用于抗原类型:可溶于变性剂并且其天然状态可被抗体识别 20 mM Tris HCl pH 8 137 mM NaCl 10% glycerol 1% Nonidet P-40 (NP-40) 2 mM EDTA 4?C 可保存6个月 使用前加入:Protease inhibitors 上述溶液中NP-40可使用Triton X-100替代 2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer 含有更强的变性剂，特别适用于核蛋白的提取。 50mM Tris HCl pH 8 150 mM NaCl 1% NP-40 0.5% sodium deoxycholate 0.1% SDS 10% sodium deoxycholate橱窗液需要避光保存。 3. 不含去污剂的可溶性蛋白裂解buffer(Detergent-free soluble protein lysis buffer): 一些可溶性蛋白不需要使用去污剂，只要使用该buffer配合机械性的破碎操作 即可:如将细胞反复用带针头的注射器吸取或进行匀浆操作 含有以下成分的PBS: 5 mM EDTA 0.02 % Sodium Azide 4?C 可保存6个月 使用前加入:Protease inhibitors 4. 变性裂解buffer或不溶于变性剂的抗原提取buffer: 有些抗体只能识别变性后蛋白的表位而不识别天然状态的蛋白表位。这样就需要 使用变性裂解buffer，然后煮沸处理即可。该方法同样适用于不能用非离子去 污剂提取的蛋白。在该buffer中加入DNase1将有利于提取染色质蛋白 1% SDS 5 mM EDTA 室温可保存1周 使用前加入:Protease inhibitors、10mM DTT or beta-mercaptoethanol、15 U/ml DNase1 5、其它所需试剂: 蛋白酶抑制剂Protease inhibitors :推荐使用蛋白酶抑制剂cocktail，也可 使用PMSF (50 ug/ml)和aprotinin (1 ug/ml). 无菌PBS pH 7.4 无菌PBS-BSA 1% (过滤处理) TBST缓冲液 WB上样buffer 附2:免疫沉淀所用Beads类型选择指南: Species Immunoglobulin Isotype Protein A Protein G Human IgG1 +++ +++ IgG2 +++ +++ IgG3 - +++ IgG4 +++ +++ IgM Use anti Human IgM IgE - + IgA - + Mouse IgG1 + +++ IgG2a +++ +++ IgG2b ++ ++ IgG3 + + IgM Use anti Human IgM Rat IgG1 - + IgG2a - +++ IgG2b - ++ IgG2c + ++ Chicken All isotypes - ++ Cow All ++ +++ isotypes Goat All isotypes - ++ Guinea Pig All +++ ++ isotypes Hamster All + ++ isotypes Horse All ++ +++ isotypes Pig All + ++ isotypes Rabbit All +++ ++ isotypes Sheep All isotypes - ++ , 免疫沉淀技术 疫沉淀原理: 免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋 白质如“protein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象而开发出来的分离抗原的免疫学方法。 目前多用的“protein A”等预先结合固化在Agarose beads上，使之与含有抗原的溶液几抗体反应后，beads 上的protein A就能吸附抗原达到精制的目的。(如图1) 二、免疫沉淀实验方案(供实验者参考): (一)实验材料 试剂及缓冲液:?细胞裂解产物(样品);?Protein G or Protein A slurry;?一抗; ?细胞裂解缓冲液;?PBS;?SDS-PAGE sample buffer;?蛋白酶抑制剂 设备:?离心机;?摇床或rotator (二)实验方法: A)样品(细胞裂解物)准备 1.收集约107细胞。 (注:1ml体积中所含细胞总数和合适的凝胶上样量取决于不同蛋白以及其抗体的特性) 2.加入约10ml的PBS到锥形管中，并用400×g离心10分钟洗涤细胞。 3.弃去上清液并重复第2步洗涤细胞。 (注:对于细胞培养皿中的单层贴壁细胞，吸除细胞培养液后，用PBS洗涤两次，尽量避免破坏细胞层) 4.完全弃去上清液后，加入1ml预冷的含蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor Cocktail)的细胞裂解液重悬细胞。小心地vortex混匀. (注:为防止蛋白酶的作用，细胞裂解液应当预冷。所有接下来的操作都在低温条件下进行，并且蛋白酶抑制剂预先添加到细胞裂解液中;此步骤对于细胞培养皿中的单层贴壁细胞，可在10cm的培养皿中加入1ml预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解)。 5.把锥形管或培养皿放在冰上孵育30分钟，并间断性地混匀。 6.4?，10000×g离心细胞裂解物15分钟。 7.小心地收集上清液转置干净的管中备用;此样品可冻存于-80?作长期保存。 B)样品的预清洗(可选做) 1.在eppendorf管中加入50ul Protein G bead slurry，并加入450ul预冷的细胞裂解液。10000×g离心30秒后弃去细胞裂解液; 用500ul预冷的细胞裂解液重复洗涤一次，最后用50ul预冷的细胞裂解液重悬微球。 2.把洗涤好的50ul Protein G bead加入到盛有500ul细胞裂解样品的eppendorf管中，于冰上孵育30-60分钟。 3.4?，10000×g离心10分钟后把上清液转移到新的eppendorf管。若转移过来的上清液中仍含有Protein G bead，可以再次离心处理后小心地转移上清到另一新的eppendorf管。 C) 免疫沉淀 1.在盛有预清洗的细胞裂解样品的eppendorf管中加入5-10ug相应抗体。 (注:抗体的浓度是影响免疫沉淀反应的重要因素;建议实验者进行预实验摸索出合适的使用浓度) 2.4?孵育1小时。 3.加入50ul预洗的Protein G bead slurry(微珠处理参考上面样品的预清洗中第一步方法)。 4.于4?旋转混匀孵育1小时。 5.4?，10000×g离心eppendorf管30秒。 6.小心并尽量完全地移除上清液后用500ul的细胞裂解液洗涤微珠3-5次;为减少非特异背景影响，每次洗涤都要尽量小心并完全地移除上清液。 7.最后一次洗涤并弃去上清液后加入50ul的Laemmli sample buffer工作液。旋涡混匀后加热至90-100?十分钟。 8.10000×g离心5分钟，收集上清液。取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20?保存。 9.按照电泳说明进行SDS-PAGE电泳。染胶分析沉淀蛋白。 (注:如果接下来用于免疫印迹(WB)分析，则按相应的WB操作步骤继续实验。推荐用eBioscience的TrueBlotTM可以得到更佳WB的效果;WB的抗体使用浓度和免疫沉淀的浓度不同，需视具体情况而定，这里建议应用不同克隆号的抗体。) 三、附录: (1)缓冲液的制备参考 NP-40 Cell Lysis Buffer: 50mM Tris-Hcl pH8.0 、150mM Nacl 、1% NP-40 ; Protease inhibitor Cocktail: PMSF、 5mg (50ug/ml) Aprotinin、 100ug (1ug/ml) Leupeptin、 100ug (1ug/ml) Pepstatin、100ug (1ug/ml) 100% Ethanol bring up to 1ml，aliquot (2)免疫沉淀(IP)的常见问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 及解答 1.用于一般免染的抗体是否都可以用作免疫沉淀实验, 答:抗体的性质对免疫沉淀实验影响很大。抗体不同，和抗原以及Protein G或Protein A的结合能力也就不同。所以一般免染能结合的抗体未必能用于IP反应。 一般来说，多抗是沉淀反应最好的选择。另外，纯化的单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。 2.为什么溶解抗原的缓冲液中要加入一定量的蛋白酶抑制剂, 答:从活性细胞裂解出来的样品中，往往含有一定量的蛋白酶。为防止预检测蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，并且在低温下进行实验。 3.溶解抗原的缓冲液的配制需要注意什么, 答:多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强表面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱表面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合。 4.免疫沉淀实验应如何把握抗体和缓冲液的比例, 答:每次沉淀实验之前，考虑抗体/缓冲液的比例十分重要。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清;缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。具体比例视具体情况而定。 5.免疫沉淀应该如何配制细胞裂解液, 答:适当的细胞裂解液的选择取决于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和;DOC(sodium de-oxycholate)，SDS是离子性的强活性剂。所以裂解液的配制时所用去污剂的种类和浓度以及盐浓度等条件需实验者进行优化。注意如果忘记加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗体完全失去活性。