扫描电镜样品制备与观察
实验十一 扫描电镜样品制备 选作 扫描电镜即扫描电子显微镜(Scanning ElectronMicroscope，简称SEM)。主要用于观察样品的
表
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面形貌、割裂面结构、管腔内表面的结构等。 一、扫描电镜工作原理: 主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对物质的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。 主要优点: 景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物样品的各种形貌特征。二、实验用品1. 材料 植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。2. 试剂 丙酮、乙醇、2,戊二醛溶液、1,锇酸、 0.1mol/L PH7.2磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液 体二氧化碳、导电胶等。3. 器材 扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、青 霉素小瓶、培养皿、载玻片、牙签、脱脂棉 等。三、扫描电镜样品的制备 ?1. 取样: 将取下的动植物组织放入预冷的含有2,戊二醛 溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长4mm左 右、高3mm左右的小块。2. 样品的清洁: 把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地逐个 拨入盛有0.1mol/L PH7.2磷酸缓冲液的青霉素小 瓶中漂洗，并反复更换用于清洗的缓冲液，一般 漂洗1小时，换液3-4次。3. 样品的固定 样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂和 方法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描 电镜观察的是样品的表面，主要是要求保持样品 表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脱水过程也 与透射电镜样品处理有不同之处。 一般在4?的条件下完成固定比较好， 戊二 醛、锇酸均可单独固定，也可用“戊二醛-锇酸” 双重固定法。 固定1-3小时(依样品种类和固定剂而已) 后，吸出固定液， 加入0.1mol/L PH7.2磷酸缓冲 液，漂洗1小时，换液3-4次。4. 脱水 从小瓶中吸出缓冲液， 加入乙醇逐级梯度脱 水，脱水剂的乙醇浓度依次为30,50,70 ,80,90,100乙醇(两次)逐级脱水;样 品在每级停留15-30分钟。5. 置换乙醇 吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇1:1的混合 液，浸泡10-20分钟并适当摇动，再吸弃混合液， 加入纯醋酸异戊酯浸泡10-20分钟并适当摇动。6. 样品的干燥 常规临界点干燥法。 临界点干燥法 临界点干燥法是一种消除了物相界面液相,气相，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下: 装样: 将样品从醋酸异戊酯中挑入或倒入样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯高压容器内，盖上盖并拧紧以防漏气。注:在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0?处预冷 10,15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯 中。 注入液体二氧化碳 依次打开二氧化碳钢瓶排气阀和仪器的 进气阀在0,10?下，向样品杯注入液体二氧化碳。 当液体二氧化碳充至样品杯容积的50,通过刻度尺观察， 以液面超过样品笼为度时，关闭仪器进气阀，静置15, 20min，让醋酸异戊酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后， 打开仪器排气流量计阀门和进气阀门，让其边排气边充液 10min左右，让含有醋酸异戊酯的二氧化碳排出和充入新 鲜的液态二氧化碳再关闭排气阀;继续充入液体二氧化碳 加温置换:将温度调节设定在20?处经15,20min后，由 于温度升高，杯内液体二氧化碳逐渐气化，因此，压力也 随之上升至7000Pa左右，样品中的醋酸异戊酯将与二氧 化碳充分置换。 气化:将温度旋钮调至临界温度以上35,40?，此时随 着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳 的临介点，界面也随之消失。当压力达到7134Pa时，经 5min后，即可排气。 排气:在保持温度不变的条件下即不关电源，打开流量 计的排气阀门，以1.0,1.51,min的速度排气速度慢些 更好。约经45,60min后，排气完毕，样品杯的压力下降 到零，将温度调节至室温约5rain
后，即可取出样品装台镀 膜若不能立即装台，应置于干燥器内保存。临界点干燥操作时的注意事项: 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0,10?。 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时 送入样品杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品 仍含有乙酸异戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干 燥而造成样品己变形，再进行临介点干燥也没有意义了。 一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样 品干燥不完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而 达不到临界点。 充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临 界值，起不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容 积的2/3左右。 在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到 充分的临界状态。 开、闭阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对 样品产生突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下 应垫上一层镜头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般 放气时间应在(4Omin以上，有时也可以放气过夜或过中 午。7. 粘贴样品 用牙签将少量导电胶涂到样品台上，胶面应略小于样品 底面。用镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在涂胶 上。粘贴后，待导电胶干透，才能进行真空镀膜和SEM镜 检。8. 样品的导电处理 生物样品和其他非金属样品的表面电阻率很高，在电 镜观察时，往往容易发生荷电现象。另外，生物样品都是 由低原子序数的碳、氢、氧、氮等元素组成，二次电子的 发射率很低，信号弱，难以获得必要的图像反差。因此， 为了消除或减少以上不良现象的产生，生物样品和非导电 的样品在扫描电镜观察前，均需进行表面导电处理。扫描 电镀样品的表面导电处理方法，主要有金属镀膜法和组织 导电处理法两种。其中金属镀膜法又有真空镀膜及离子溅 射镀膜法等方法，本实验采用离子溅射镀膜法进行镀膜。离子溅射镀膜法: 在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分真空泵和溅射部分真空罩组 成，在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装 有用于溅射用的金属靶黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶 等，样品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度 抽到10,1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000,3000V的 直流电压，两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用 下，罩内残余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子 被阴极吸引轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳 极吸引附着在样品表面而形成金属导电膜。离子溅射镀膜法操作注意事项: 样品要充分干燥，否则，金属颗粒不但不能附着，反而会 引起样品损伤，特别是能放出有机气体的样品，有机气体 会因放电而分解，使样品引起碳化污染。 加高压时辉光放电的颜色应为蓝色或紫蓝色，若是红色， 应立即停止加高压，继续抽气。 加高压后，若真空度下降幅度较大，应立即停止镀膜，待 充分抽气后再继续镀膜。 一些电镜图片染色体 染色体 被精子包围的卵子 骨髓细胞 SARS AIDS
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