血小板激活因子对精子的趋化作用及其机制

血小板激活因子对精子的趋化作用及其机制 血小板激活因子对精子的趋化作用及其机制 1 2 3 3吴翠娇周晓彬 Sto jan ova TO ’Ne ill C () 【摘要】 ?目的 体外观察血小板激活因子 对小鼠附睾精子和人成熟精子的趋化作用以及对受精的 PA F 影响。?方法 在微趋化室下层孔内加入 27新鲜制备的精子悬液, 上层孔内加入不同质量浓度 212519 , ΛL PA F U R () 受体阻断剂, 之间以多聚碳核孔滤网分隔, 37?孵育, 用经特殊处理的玻片封闭, 反转微趋化室, 离心, 相差 PA F 显微镜下计数玻片上的精子数。用 212519 预处理小鼠精子, 通过体外受精技术观察受精率及早期胚胎发育。?U R 结果 随 质量浓度的增加, 聚集于上层孔内的精子逐渐增多, 当 ?1. 0ƒ时, 聚集的精子数量明显增PA F PA F m gL (() ) 多, 与对照组比较, 差异有极显著性 = 3. 82, 4. 81, < 0. 01; 当 212519 质量浓度增加 > 1. 0时, ƒz P U R m gL PA F 吸引精子的作用受抑。体外受精实验显示, 经212519 预处理的精子, 受精率明显低于正常, 早期胚胎发育亦明显U R 受抑。?结论对小鼠附睾精子及人成熟精子有趋化作用, 这种作用能被其受体阻断剂所抑制。212519 对 PA F U R 小鼠精2卵体外受精及其胚胎的早期发育均有抑制作用。 【关键词】 血小板活化因子; 趋化性; 受体; 小鼠; 人 233321R 中国图书馆分类法分类号 -CHEM O TACT IC EFFECT O F EXO GENO US PL A TEL ETACT IVA T ING FACTO R O N SPERM A ND ITS M ECHA N ISM W u , , , , , C u ij iaoZ h ou X iaobin S toj anov a T e t a l D ep a r tm en t o f H isto lo gy and Em b ryo lo gyQ ingdao M ed ica l Co llegeQ ingdao 266021 ( ) 【】 2A BSTRACTO bj ec t ive T o study th e ch em o tac t ic effec t o f exo geno u s p la te le tac t iva t ing fac to r PA F o n h um an and m ice 2722, M e th od s ΛL f re sh ly p rep a red sp e rm su sp en sio n w a s added in th e low e r w e ll o f m ic ro ch em o tax isch am be rand d if2 sp e rm. () 212519 2, , fe ren t co ncen t ra t io n s o f PA F U R PA F recep to r an tago n istw e re p u t in th e upp e r w e lls o f th e ch am be rth e low e r and th e () = 8, 37? 2upp e r w e lls w e re sep a ra ted w ith po lyca rbo na te neo c leopo re f ilte r D Λm incuba ted a t and sea led by a p iece o f p reco a ted . 22100, g la ssT h e m ic ro ch em o tax isch am be r w a s p u t up side dow n and cen t r ifuged a t gth e num be r o f th e sp e rm o n th e g la ss w a s ( ) 222. , co un ted unde r ze iss p h a seco t ra st m ic ro scop eIn th e in v it ro fe r t iliza t io n IV F exp e r im en tp ret rea ted m ice sp e rm w ith U R 12519 . w a s u sedF e r t ilized zygo te and th e deve lopm en t o f ea r ly em b ryo to b la sto cy st w e re inve st iga ted and com p a red w ith tho se o f . , no rm a l m ice sp e rmR esu lts A lo ng w ith th e inc rem en t o f PA F co ncen t ra t io n th e accum u la t io n o f sp e rm in th e upp e r w e lls w a s inc rea sed, w h en th e do se o f PA F ?1. 0m gL , th e num be r o f accum u la ted sp e rm in th e upp e r w e ll w a s sign if ican t ly h igh e r th an ƒ ()= 3. 82- 4. 81, < 0. 01. th a t o f th e co n t ro l g ro up z P T h e a t t rac t ive effec t o f PA F o n sp e rm w a s g radua lly inh ib ited w h en th e do se 212519> 1. 0ƒ. o f U R m gLT h e IV F show ed th a t th e fo rm a t io n o f fe r t ilized zygo te and th e deve lopm en t o f ea r ly em b ryo to b la sto 2 212519 2.C on c lus ion PA F can a t t rac t m a tu re h um an sp e rm and cy st w e re sign if ican t ly p reven ted w ith th e U R p ret rea ted sp e rm 212519, 2212519 . m ice ep idyd im is sp e rm w h ich can be p reven ted by U R a PA F recep to r an tago n istU R a lso p reven ted th e fo rm a t io n .o f fe r t ilized zygo te and th e deve lopm en t o f ea r ly em b ryo to b la sto cy st 【】 ; ; ; ; KEY WO RD Sp la te le t ac t iva t ing fac to rch em o tax isrecep to rra thom in idae 对小鼠及人成熟精子的趋外实验观察外源性 哺乳动物射精后, 精子通常停留于输卵管的峡PA F () 化作用, 以及 受体阻断剂对 在精子趋化 部或子宫颈管 人, 等待排卵的发生。 一旦排卵, 精 PA F PA F 及受精过程的影响, 探讨 在精子获能过程中的子可于几分钟内上行至输卵管壶腹部与卵子结合, PA F 形成受精卵。目前, 对于精子在受精前的运动具有方 作用及其机制。 向性及与排卵同步性的机制尚不清楚。 实验结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1 材料与方法 () 明, 外源性血小板激活因子 能增强精子活力,PA F 〔1〕诱发人精子的顶体反应, 促进受精的发生。但成熟 1. 1 精子的采集 精子是否具有 受体, 是否通过其特异性1. 1. 1 小鼠精子的采集 取 10 周龄成年雄性小鼠PA F PA F ()受体影响精子的获能, 目前尚未见报道。本文通过体 12 只 由悉尼大学动物中心提供。 断颈处死, 取附 (睾, 分 离 脂 肪, 迅 速 放 臵 于 H T FM H um an T u b a l ( 作者单位 1 青 岛 医 学 院 组 织 学 和 胚 胎 学 教 研 室 青 岛 ) F lu id M o d if ied 培养液内, 用无菌针头在附睾上穿) 2660212 青岛医学院预防医学教研室 3 澳大利亚悉尼大学 刺数孔, 放入 37?孵箱内孵育 15, 使精子充分游m in 皇家北岸医院人类生殖研究所 ? 1994-2013 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 出。 在 25?下, 1 000离 心 5, 吸 取 沉 淀注射后 15, 17, 取输卵管, 放入 ƒ卵。 rm in m in H C G h H T FM 0. 2, 将其缓缓放入 1. 8平衡好的 培冲洗液内。用冲洗液将卵子由输卵管冲出, 反复洗涤mL mL H T FM , 37?孵育 2, 仔细吸取 1上层液相, 计3 次。 将数量相同的卵子迅速加入到已平衡好的养液中h mL 9 含 数上游精子, 将精子数调整至 2〓10ƒ. L ( 1. 1. 2 人精子的采集 精液由健康成年男性提供。 1培养液的 管内 实验组含 10mL H T FM F a lco n Λg9 ) 212519, 迅速加入含有 0. 5〓10ƒ精子的精子 (液化精液后用 U R L , BW W B igge r sW h it ten an d W h it2 ) 悬液; 快速将受精管放入 37?, 体积分数为0. 05 的 t in gh am 缓冲液按 1?5 比例充分混匀, 在 25?下, 1 000 ƒ离心 15, 弃上清, 反复洗涤 3 次。 将 培养箱。 孵育 5后, 收集各受精管的卵子。 计 rm in m in CO 2 h 沉淀物 0. 2移至 1. 8已平衡好的 培mL mL H T FM 数具有双原核的受精卵, 计算受精率。 用 冲H T FM 上层液相, 计数上养液中, 37?孵育 3h , 收集 1mL 洗液将受精卵洗 3 次, 然后移入 10ΛL 已平衡好的 9 (游精子, 将精子数调整至 2〓10培 养 液 内 培 养 板, 每 孔 10 个 受 精 ƒ. LH T FM L U X ) 1. 2 趋化实验卵 , 在 37?体 积 分 数 为 0. 05 的 培 养 箱 内 孵 CO 2 ( 工作液配制: 氮气干燥 原液 1ƒ, PA F PA F gL 育, 于受精 12后计数 2 个分裂球期的胚卵, 120h h 2 ) 存于氯仿中100以 1 ?10 倍比稀释, 最终质量 , ΛL 后计数胚泡, 统计学处理采用 ς 检验。浓 度 0. 01, 100. 00ƒ受 体 阻 断 剂 2. m gLPA F U R 2 结果 12519 配 制: 先 配 制 1gL 的 原 液, 倍 比 稀 释 成ƒ 20. 00, 2. 00, 0. 20, 0. 工作液, 分别取以 上02m g ƒL 2. 1 趋化实验 0.与 0.5的 2ƒ各质量浓度的工作液 5mL mL m gL 当在微趋化室上层孔内加入 时, 随 PA F PA F 工作液混匀。 各试管的最终质量浓度: 为 PA F PA F 质量浓度递增, 聚集于上层孔内的精子逐渐增多, 整 (1ƒ; 212519 分别为 10. 00, 1. 00, 0. 10, 0. 01 m gL U R 52. 3945, , 差 异 有 极 显 著 性 = 体 结果比较 表 明H )ƒ.m g L 30. 4045, < 0. 001。当 质量浓度为 0. 01 ƒP PA F m g 将 上 述 精 子 悬 液 27ΛL 加 入 48 孔 微 趋 化 室时, 人精子聚集的数量增多, 与对照组相比差异有L () 22的下层孔内, 以一个 () M ic ro C h em o tax isC h am b e r显著性 = 2. 37, < 0. 05; 当 质量浓度增至z P PA F () 多聚碳核孔滤网 孔直径 8与上层孔分隔。将上 Λm 1. 00, 10. 00, 100. 00ƒ时, 聚集的小鼠及人的精m g L 层孔内分别加入配制好的 212519, , , BW W PA F U R 子 均 明 显 增 多, 与 对 照 组 比 较, 差 异 有 极 显 著 性 臵 37?孵 箱 内 孵 育 10. 然 后 用 一 张 经 0. 1(ƒ) m ingL = 3. 32, 4. 81, < 0. 01。 见表 1.z P 和 5. 0ƒ处理的玻片封闭 Po ly ly sin e gL Sp e rm id in e 表 1 在不同 质量浓度作用下微趋化室上层孔聚 PA F 上层孔。反转, 室温下 1 000 ƒ离心 20. 取下rm in m in θ()集的精子数量 ?x s 玻片, 37?孵箱内干燥, 相差显微镜下肉眼计 Ze iss - 1)( 小鼠附睾精子 人精子 PA F Θƒm g〃L θ 数对应于各孔面积上的精子数。实验结果以 〒表xs 0 1. 28〒 2. 31 13. 50〒23. 12 3示, 整体结果比较采用 , 两组间结果比较采0. 88〒 0. 97 30. 08〒43. 78 检验H 0. 01 3. 08〒 3. 98 35. 42〒40. 19 用 检验。z 0. 10 3 33 34. 20〒 2. 98 38. 13〒25. 97 1. 00 1. 3 体外受精实验3 33 35. 04〒 5. 05 34. 46〒25. 45 10. 00 基本步骤同文献〔1, 2〕, 取 2 只 15 周龄雄鼠, 断 3 3 3 3 100. 00 8. 48〒11. 05 22. 25〒17. 78 颈处死; 取附睾放入 1已平衡好的 培养mL H T FM 整体比较, H = 52. 3945, 30. 4045, P < 0. 001; 与 PA F 浓度为 0 液中。用无菌针头在附睾上穿刺数孔, 将精子轻轻挤 3 3 3 组比较, z = 3. 32, 4. 81, P < 0. 01; z = 2. 37, P < 0. 05 出, 一部分作为实验组, 加入 212519, 其最 终 质 U R 量浓度为 1另一部分用于对照组。 然后放入ƒ; 当 1. 00及不同质量浓度的 受ƒm gL m gL PA F PA F 37?孵箱内孵育 40, 使精子充分离散。用血细胞 体阻断剂 212519 同时存在时, 积聚于上层孔内 m in U R ( 的精子数量随 212519 的剂量的加大而逐渐减少 计数器计数活动精子的数量 精子计数= 所计精子 U R 4 ()) = 34. 5545, 29. 7445, < 0. 001。 当 212519数〓5〓10。ƒH P U R L 10, 12 周龄雌性小鼠, 正常饮食及光照。 腹腔 质量浓度>1. 00时, 明显抑制了 对精子ƒ m gL PA F () 注 射激素 ƒ各 10, 间隔 48诱发排的趋化作用。 见表 2., PM SGH C GU h ? 1994-2013 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 〔5〕2. 2 体外受精实验卵子的透明带。 本文结果显示, 随着 受体阻 PA F 用 10ƒ212519 预 先 处 理 的 精 子, 受 精断剂 212519 质量浓度的增加, 对小鼠附睾 m gL U R U R PA F 2 ( 率 明显低于对照组, 差异有显著性 = 8. 精子及人成熟精子的趋化作用逐渐减小, 直至完全 ς 94, P < 2 )( 0. 01。 受精卵至胚泡期的发育亦明显受 抑 = 消失; 经受体阻断剂 212519 处理的小鼠精子, 受 ς U R ) 7. 41, < 0. 01。 见表 3.精率明显降低。提示精子表面有 受体存在。我 P PA F 们认为, 排卵发生时释放的 可作为精2卵相识PA F θ() 不同质量浓度 UR- 12519 对 PA F 作用影响 x ?s表 2 的一种信号, 促使精子趋向于卵子, 并随之与精子表212519PA F U R 小鼠附睾精子 人精子 - 1 - 1 ( ) ( )ƒ〃ƒ〃 Θm gL Θm gL 面的 受体结合, 引起细胞内蛋白酶 及, , PA F A K C 2+ 〔6〕0 0 5. 93〒 4. 78 47. 17〒23. 87 质量浓度的变化, 导致精子活力的改变及顶 C a 1. 00 0 17. 00〒13. 6373. 94〒28. 32体反应, 从而促进精子获能, 进而促进受精。 1. 00 0. 01 13. 96〒 9. 7170. 61〒31. 01 本文结果同时显示, 经 212519 处理的小鼠 U R 1. 00 0. 10 11. 71〒 8. 5866. 22〒36. 05331. 00 1. 00 5. 93〒 5. 6055. 33〒27. 03精子, 其受精卵至胚泡的发育明显受抑。已有研究表 33 1. 00 10. 00 7. 21〒 9. 3746. 53〒20. 54 明, 早期胚胎能够产生胚源性 并能表达 , PA F PA F整 体 比 较, H = 34. 5545, 29. 7445, P < 0. 001; 与 PA F 为1. 00 〔7〕受体 , 对着床及胚胎的正常发育有促进作 m RN A 3 组, 212519 质 量 浓 度 为 0 组 比 较, = 2. 79, 4. 09, <ƒm gL U R z P 〔8〕用。 本研究中小鼠精子经 受体阻断剂处理PA F 0. 01 后, 其受精卵 受体 的表达受阻, 致使受 PA F m RN A 表 3 不同质量浓度 UR- 12519 对小鼠卵子受精及胚胎 体不能正常合成。 但其确切机制尚待进一步探讨。 () 发育的影响 % 参考文献212519 U R 受精卵 2 卵裂球胚卵 胚泡 - 1( )ƒ〃 Θm gL 21 , , , . K rau sz C Ge rva si GFo r t i Ge t a lE ffec t o f p la te le tac t iva t ing ( )( )( )ƒ92 ƒ59 ƒ59 64 5980 4768 400 . fac to r o n m o t ility and ac ro som e reac t io n o f h um an sp e rm a to zo a( ( ( )))63 60ƒ95 72 43ƒ60 42 25ƒ60 0. 10 H um R ep rod , 1994, 9: 471 ( ) ( ) ( ) 10. 00 42 44ƒ10357 25ƒ4441 18ƒ44 O ’N e ill C. E v idence fo r th e requ irem en t o f au to c r ine g row th 2 fac to r s fo r deve lopm en t o f m o u se p re im p lan ta t io n em b ryo s in 3 讨论 . , 1997, 59: 229v it roB iol R ep rod A m ie l M L , T e sta r t J , B enven iste J. P la te le t2ac t iva t ing fac to r is 3 是一种小分子磷脂, 是组织细胞的一种自PA F . , 1991, 56: 62a com po nen t o f h um an fo llicu la r f lu idF er til S ter il 分泌调节因子, 广泛参与了精子获能、排卵、受精、胚 , , , . R a lt D Go ldenbe rg M F e t te ro lf P e t a lSp e rm a t t rac t io n o f 4 胎着床等生殖生理过程。文献报道, 卵子和卵泡细胞 ( ) .fo llicu la r fac to r s co r re la te s w ith h um an egg fe r t ilizab ility 均可产生 是人卵泡液内 的 一 种 重 要 成 , PA F PA F , 1991, 88: 2840P roc N a tl A cad S ci U S A 〔3〕, , , . 2Sengo k u K T am a te K T ak ao k a Ye t a lE ffec t o f p la te le tac2 5 分, 于排卵前水平逐渐升高; 另有文献报道, 卵泡 〔4〕,. t iva t ing fac to r o n h um an sp e rm func t io n in v it roH um R ep rod 液中含有小分子磷脂, 对人的精子具有趋化作用;1993, 8: 1443 目前, 多数学者认为, 精子在受精前运动的方向性及 , , , . Sengo k u K T am a te K T ak um a N e t a lInvo lvem en t o f p ro 2 6 与排卵的同步性, 是由于排卵时, 卵子、卵泡细胞及 2te in k ina se s in p la te le tac t iva t ing fac to r induced ac ro som e reac2 () 卵泡液产生和 或含有的某种或某些成分对精子的( ) , 1996, 2 6: 401. t io n o f h um an sp e rm a to zo aM ol H um R ep rod . 2. O ’N e ill CP la teletactiv a ting f actor and h um an d iseaseO x2 趋化作用所致。 本文实验结果显示, 外源性 对 7 PA F : , 1989. 282fo rdB lackw e ll Sc ien t if ic 小鼠附睾精子及人成熟精子均具明显的趋化作用, , , , . Ro udebu sh W E L aM a rch e M D L ev inen SA e t a lE v idence 8 提示受精前, 精子于雌性生殖道内的运动时相可能2fo r th e p re sence o f th e p la te le tac t iva t ing fac to r recep to r in th e 与卵子、卵泡细胞和卵泡液释放的 密切相关。 PA F 22. C FW m o u se p re im p lan ta t io n tw o ce llstage em b ryoB iol R e2 体 外 观 察 结 果 表 明, 能 促 进 人 精 子 的 活PA F , 1997, 57: 575p rod 力, 且对活力较弱的精子作用更为明显; 同时, PA F( )1998211227 收稿 1999203228 修回 〔1〕 能诱发人精子的顶体反应, 促使人精子穿过豚鼠 ? 1994-2013 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.