激发光谱和发射光谱

激发光谱和发射光谱 荧光和磷光均属于光酸发光，所以都涉用到两种辐射，即激发光(吸收)和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它们是笑光和磷光定性和定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 的基本参数及依据。 1. 激发光谱 通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(即强度)随激发光波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。激发光谱的具体测绘方法，是通过扫描激发单色器，使不同波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。激发光谱的具体测绘方法，是通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光照射激发荧光(磷光)体，发出的荧光(磷光)通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，检测其荧光(磷光)强过，最后通过记录仪记录光强度对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。通过激发光谱，选择最佳激发波长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用λ表示。 ex 2. 发射光谱，也称荧光光谱或磷光光谱 通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(强度)随发射光波长的变化而获得的光谱，称为发射光谱。其测绘方法，是固定激光发光的波长，扫描发射的光的波长，记录发射光强度对发射光波长的关系曲线，即为发射光谱。通过发射光谱选择最佳的发射波长——发射荧光(磷光)强度最大的发射波长，常用λ表示，磷光发射波长比荧光来得长，图14.3为萘的激发em 光谱及荧光和磷光的发射光谱。 3. 荧江激发光谱和发射光谱的特征 ? 斯托克斯位移 在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发波长，λ>λStokesemex于1852年首次发现这种波长位移现象，故称Stokes位移。 斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存大着一定的能量损失。激发态分子由于振动弛豫及内都转移的无辐射跃迁而迅速衰变到S电子态的最低振动能级，这是产生1 其位移的主要原因;其次，荧光发射时，激发态的分子衰变到基态的各振动能级，此时，不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级，也造成能量的损失;第三，溶剂效应和激发态分子可能发生的某些反应，也会加大斯托克斯位移。 ? 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电子激发到种激发态，都将经过司迅速的振动弛豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级，然后发射荧光。因此除了少数特殊情况，如S与S的能级间隔比一般分子大(如 )及可能受溶液性质影12 响的物质外，荧光光谱只有一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关。 ? 荧光激发光谱的形状与发射波长无关 由于在稀溶液中，荧光发射的效率(称为量子产率)与激发光的波长无关，因此用不同发射波长绘制激发光谱时，激发光谱的形状不变，只是发射强度不同而已。 ? 荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似，荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 物质的分子只有对 光有吸收，才会被激发， 所以，从理论上说，某 化合物的荧光激发光谱 的形状，应与它的吸收 光谱的形状完全相同。 然而实际并非如此，由 于存在着测量仪器的因 素或测量环境的某些影 响，使得绝大多数情况 下，“表观”激发光谱 与吸收光谱两者的形状 有所差别。只有在校正 仪器因素后，两者才非 常近似，而如果也校正了环境因素后，两面的形状才相同。 如果把某种物质的荧光发射光谱和它的吸收光谱相比较低，便会发现两者之间存在着“镜像对称”关系。如图14.4分别表示 的苯溶液和硫酸奎宁的稀硫酸溶液的吸收光谱和荧光发射光谱。 为什么两种光谱会互为镜像关系呢,这不难由荧光发射光谱和吸收光谱的成因素解释。吸收光谱中的第一吸收带(波长较长的吸收带)是由于基态分子吸收光能量被激发到第一电子激发态的各不同振动能级，所以，其形状取决于第一电子激发态中各振动能级的分布情况(即能量间隔情况)，而荧光光谱是激发态分子从第一电子激发单重态的最低振动能级跃回基态中的各不同振动能级所致，所以荧光光谱的形状取决于基态中各振动能级的分布情况。一般情况下，基态和第一电了激发单重态中振动能级的分布情况是相同的，所以荧光发射光谱与吸收光谱的形状是类似的。 另一方面，吸收时由基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态的多振动能级，振动能级越高，所吸收的能量越大，即吸收峰的波长越短;而相反，荧光发射是由第 一电子激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的多振动能级，振动能级越大，所释放的能量越小，即发射的荧光峰波长越长。另外，由于电子跃迁的速率非常之快，以致于跃迁过程中分子中原子核的相对位置没有明显发光的变化，其(这里插图)结果是，假如吸收时由S的v=0与第一激发态S的v=2 之间的跃迁机率最大(即强度最大)，那01 末在荧光发射时，由S的v=0跃回S的v=2的机率应该最大，如图14.5所示。基于上10 述原因，荧光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对称关系。跃回S0的v=2的机率必应该最大，如图14.5所示。基于上术原因，荧光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对称关系。 有机物的荧光 有机化合物的荧光——在已知大量的有机化合物当中，仅有一小部分发笛强的荧光，这与有机化合物的结构密切相关。能发射强荧光的有机化合物通常具有以下的结构特征: 1. 具有电子跃迁类型的结构 实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由或跃迁激发，然后经过振动 或跃迁而产生荧光。而其中吸收时跃迁弛豫等无辐射跃迁，再发生 23,7,9的摩尔吸光系数比跃迁的大10,10倍， 跃迁的寿命(10,10)比 ,5,7跃迁的寿命(10,10)短，因此荧光发射的速常数K值较大，荧光发射的效率高。f 因此，跃迁发射荧光的强度大。此外，在跃迁过程中，通过系间跨跃从单重态跃迁至三重态的速率常数K也有到于荧光的发射。总之，跃迁的类型是产生荧ISC 光的最主要跃迁类型。 2. 具有大的共轭π键结构 发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有共键双键(π键)的结构体系。共轭体系越大， 电子的离域性越大，越容易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光(或磷光)峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。例如萃和萘的荧光位于紫外区，蒽位于蓝区，丁省位于绿区，戊省位于红区,见表14.1( )。 同一共轭环数的芳族化合物，线性环结构者的荧光波长比非线性者要长，如蒽和菲，其共轭环数相同，前者为线性环结构，后者为“角”形结构，前者λ为400nm，后者λ为emem350nm。 3. 具在刚性平面结构 实验发现，多数具有性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可为减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能量处部转移的损失，有利于荧光的发射。而且平面平面结构可以增大分子的吸光截面，增大摩尔吸光系数，增强荧光强度。酚酞与荧光黄(亦称荧光素)的结构十分相近(下图所示)，只是由于荧光黄分子中的氧桥使其具有刚性平面结构，因而在溶液中呈现强烈的荧光，在0.1mol/l的NaOH溶液中，荧光效率达0.92，而酚酞却没有荧光。又如芴与联二苯(下图所示)，由于葱中的亚甲基使分子的刚性平面增加;导致两者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产苯接近于1，后者仅为0.18。萘与维生素A都具有5个共轭π键(下图所示)，而前者为平面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光强度为后者的5倍。 4. 取代基的影响 取代基的性质(尤其是发色基因)对荧光体与的荧光特性和强度均有强烈的影响。芳烃及杂环化合物的荧光激发光谱、发射光谱及荧光效率常随取代基的不同而异，由于目前对于激发态分子的性质了解还很不够，尚不能真正从机制上揭开其影响的秘密。其影响规律多出自实验 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 和推测。表14.2列出了部分取代基对苯的荧光特性的影响情况()。 取代基的影响主要有以下几个方面。 ? 给电子取代基使荧光加强 属于这类基团的有,NH，,NHR，,NR，,OH，,OR，,CN等。由于这些基团上的22 n电子云几乎与芳环上的π电子轨道平行，因而实际上它们共享了共轭π电子，形成了p,π共轭，扩大共轭体系。因此，这类化合物的荧光强度增大(比较表14.2中的苯、苯 胺、苯酚、苯基氰)，考察这类取代基对荧光特性的影响时必需注意，这类基团中的n电 , 子容易与极性转化为共盐(共轭碱或共轭酸)，如酚在NaOH中，,OH转化为,O，苯胺 ，在酸中，,NH转化为,NH，它们的荧光均大为减弱。 23 ? 吸电子基团使荧光减弱而磷光增强 属于这类基团的有如羰基(,COOH，,CHO，)，硝基(,NO)及重氮基等。这类2 基团都会发生跃迁，属于禁阻跃迁，所以摩尔吸光系数小，荧光发射也弱，而 的系间跨跃较为强烈，同样使荧光减弱，相应磷光增强。例如二苯甲酮 其的系间跨跃产率接近1，它在非酸性介质中的磷光很强。硝基芳中,NO对荧光体荧光的抑制作用尤为突出，硝基苯不发射荧光，其的产2 率为0.60。但会人荧解的是硝基苯的磷光也很弱，普遍认为可能产生比磷光速率更快的非辐射的系间跨跃，或发生光化学反应。和给电子基团一样，吸电子基团也都存在n电子，所以对极性溶剂及酸，碱介质都较为敏感。 ? 取代基位置的影响 取代基位置对芳烃荧光的影 响通常为:邻位，对位取代者增 荧光，间位取代者抑制荧光(,CN 取代者例外)。取代基的空间阻碍 对荧光也有明显的影响。如下面 ,化合物萘环上的8位引入,SO3 基时，由于空间阻碍使,NR与萘2 这间的键扭转而减弱了平面构 型，影响了情况p,π共轭，导 致荧光的减弱。同样，1,2,二苯 乙烯的反式异构体是强荧光物 质，而顺式异构体不发射荧光。 荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。所谓重原子取代，一般指的是卤素(Cl、Br和I)原子取代，芳烃取代，芳烃取代上卤素原子这后，其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，而磷光通常相应地增强，这种效应称为“重原子效应”。这种效应被解释为，由于重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，使得荧光体中的电子自旋一轨道偶合作用加强，系间跨跃显著增加，结果导致荧强度减弱，磷光强度 增强。表14.3()及图14.6表示卤代萘的荧光及磷光光谱的情 荧光(或磷光)量子产率 激发态分子的去激发包括两种过程，即无辐射跃迁过程和辐射击跃进迁过程，辐射跃迁可发射荧光(延迟荧光)或磷光。而有多少比例的激发分子发射出荧光(或磷光)呢。可以用荧光量子产率Φ--有时也叫也叫荧光效率或荧光产率(或磷光量子产率φ)表示。φ定义为:FPF荧光物质吸光后所发射荧光的光量子数与所吸光的光量子数之比，即: 许多吸光物质并不能发射荧光，这是因为激发态分子的去分子的去激过过程中，除发射荧光(磷光)外，还有无辐射跃迁过程与之竞争。所以，荧光量子产率与其他各种过程的速成率常数有关。表14.4列出分子吸光及去激发的过程及速率常数()。 因此，Φ可以表示为: F 式中，ΣK为无辐射跃迁各种过程的速率常数之和，即ΣK ,K，K，K[Q]。从上式可以iiICISCQ看出，凡是能使K值升高而使其它K值它降低的因素，都可以提高量子产量，增强荧光。fi 对于高荧光分子(如荧光素)来说，Φ接近于1，说明该个子的K较大，ΣK相对于K不可ffif忽略不计。一般荧光物质Φ小于1，不发荧光的物质K为0，Φ,0。一般说来，K主要取ffff决于化学结构(上节已叙述)，K则主要取决于化学环境的因素，同时也与化学结构有关。从i 各种速率常驻数还可以得到荧光寿命τ f: 磷光的量子产率Φ与荧光最子产率相似。 P 荧光强度与荧光物质浓度的关系 荧光强度I正比于吸收的光量(光强)I及荧光量子产率Φ: faf I=IΦ faf 吸收的光量(光强)I应为入射光的光强的光强 I与透射光的光强 I 之差，即: a0t I,I,I a 0t 根据吸收定律(朗伯-比耳定律): 所以: 式中，ε为摩尔吸光系数，b为样品溶液的光程(即液池的厚度)，C为样品的摩尔浓度。 而的展开式为: 当浓度C很稀，吸收光量不超过总光量的2,时， (约为0.02)，则展开式的高次项可忽略，即: 所以: 当I及b一定时:I,KC 0f 上式表明，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分析法是量分析的依据。但是，应该注意的是，此式只适合于荧光物质的稀溶液。当C较大，时，线性关系将受到破坏。其原因是受激后的激发态分子与体系中的其他分子所碰撞，使其以非辐射击跃迁的形式激化，产生荧光猝灭，或者激发态分子所发射的荧光被没受激发的分子所吸收，而又因Φ一般少于1所以发生所谓的“自吸收”现象而使荧光减弱。为了减少碰撞去激发的机会，f 可以用降低温度，增大溶液粘度或把荧光(磷光)物质附着在固体，支撑物测定的方法，以减少猝灭效应。 [特别要指出的是磷光发射，因其平均寿命较长，碰撞去激发的效应更大，所以常采用低微磷光或固体磷光方法。] 影响荧光强度的环境因素 影响荧光强度的因素除了荧光物质的本身结构及其浓度以外，环增也是一个很重要的因 素，主要的溶剂、温度、介质酸度、氢键的形成及其它的因素。 1. 溶剂的影响 ? 一般溶剂效应指的是溶剂的折身率的介电常数的影响。这种影响是普遍存在的。一般 情况下，折射率加大，将使荧光光谱的Stokes位移减少，而介电常数加大，将使Stokes 位移加大，且荧光效应提高。 ? 同一种荧光体系在不同的溶液中，其荧光光谱和荧光强度都可能会有显著的差别，尤 其是那些在芳环上含有极性取代基荧光体，它们更容易受到溶剂的影响。溶剂的影响 一般分为一般分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应。 特殊溶剂效应指的是荧光体与溶剂分子的特别化学作用，如氢键的形成和某些化合作用。特殊溶剂效应对荧光光谱及强度的影响往往的大于一般溶剂效应。对于荧光发射的主要电子跃迁类型跃迁来说，电子激发态比基态具有更大的极性，所以随着溶剂极性的增大，对激发态比对基态产生更大的稳定作用，因此降低了跃迁的能量，荧光光谱发生红移，而且荧光增强。表14.5为8-巯基喹啉在几种不同溶剂中荧光特性()。但应该注意到一些相反的情况，如苯胺萘磺酸类化合物随溶剂极性的增大，光谱发生蓝移，且强度降低。 如果溶液分子与类光物质形成氢键，将使荧光峰明显红移，荧光强度一般增大。如果溶剂分子和荧光物质形成化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态或存在型体发生变化，则荧光峰位置和强度都会发生较大的变化。以外，在含有重原子的溶剂如碘化乙醋、二碘焓、溴化正丙酯等)中，一般也使荧光体的荧光强度降低，而使磷光强度升高，这种现象称为“外重原子效应”。溶剂中重原子的高核电荷引起溶质分子的自旋与轨道之间强烈的偶合作用，结果使 的系间的跨跃，磷光发射及的系间跨跃等过程的几率增大。因此荧光削弱，而磷光增强。 2. 温度的影响 温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低，图14.7为不同温度下邻菲 啉的荧光光谱。 当溶液不存在猝灭剂时，荧光的量子产率与去激化的辐射跃迁过程及非辐射跃迁过程的相对速率有关。一般认为辐射过程速度不随温度变化，因此，荧光量产率的变化反映了非辐射跃迁过程速率的变化。随着溶液温度的升高，介质粘度增大，分子运动速度也变大，从而使荧光分子与溶剂分子或其它分了的碰撞机率增加，个部能量转移速率变化。因此，荧江产率降低。 溶液温度上升而使荧光强度降低的另一个主要原因是分子的内部能量转化作用。多原子分子的基态和激发态的位能曲线可能相交或相切于一点，如图14.8所示。 当激发态分子接受到额外热能而沿激发位能曲线AC移动致交点c时，有可能转换至基态的位能曲线NC，使激发转化为基态的振动能，随后通过振动弛豫而丧失振动能量。 3.介质酸度的影响 带有酸性基团或碱性基团的大多数芳香族化合物，其荧光特性都与溶液的酸度(pH)有关。这是因为在不同酸度介质条件下，荧光体的存在型体不同，不同的型体(分子与其离子)在电子构型上有所不同，而且基态的激发态所表现出来的酸，碱性也有所差别。因此不同酸度下，荧光光谱和荧光强度都可能发生变化。所以在荧光分析中一般都要较严格地控制溶液的pH值。下列为两个实例: 4. 形成氢键的影响 荧光物质与溶剂分子或其他溶质分子所形成的分子间氢键可能有两种情况:一种是在激发之前荧光体的基态所形成的氢键，这种情况一般使摩尔吸光系数 增大，即吸收增强，因此荧光强度增大，同时也可能发生分子极性及共轭程度的变化。因此吸收光谱(荧光激发光谱)及荧光发射光谱都可能发生变化。另一种情况是激发之后荧光体的激发态所形成的氢键，所以吸收光谱(激发光谱)不受影响，而荧光发射光谱会发生变化。 5. 其他方面影响 表面活性剂的存在对荧光光谱及强度都有会产生影响。荧光体在由表面活性剂形成胶束的微环境中，不仅可以减少非辐射去激化过程和猝灭过程的速，提高荧光量子产率，而且由于表面活性剂参与组成更高次和配合物而增大配合物分子的有效吸光截面积，导致摩尔吸光系数的增大因此，在胶束溶液中，荧光强度增强，测定的灵敏度提高。 多元配合物的形成通常也可以平强荧光强度，提高荧光测定的灵敏度。 荧光的猝灭 荧光的猝灭(熄灭)一词，从广义上说，指的是任何可使某给定荧光物质的荧光强度降低的作用，或者任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用。从狭义上说，指的是荧光和质分子与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用，导致荧光强度降低的现象。与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质，称为猝灭剂。荧光猝灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有为下几种类型: 1. 碰撞猝灭 碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。它指的是处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子Q相碰撞，使释放热量给环境以无辐射的形式跃迁回基态，产生猝灭作用(这种猝灭也称动态猝灭。)这一过程可以表示如下: 根据荧光量子产率的定义在无Q时的量子产率φ及Q存在时的量子产率φ 分别为: 0q 则无Q时的荧光强度(I)及Q存在时的荧光强度(I)之比为: f0fq 式中，K称为猝灭速率常数，，可以推得，K与热力学温度T成正比，与溶液的粘度成反比。可见，碰撞猝灭效应随温度的升高而增强，而随粘度的增大而降低。 2. 生成化合物的猝灭 生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，它指的是基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭，可用下式表示: 从上式也容易推导出荧光强度与猝灭剂平衡浓度之间的关系 式中(I)及(I)分别为加入猝灭剂Q之前及之后的荧光强度，C为荧光物质的总浓度。上f0fqM 式与动态猝灭的关系式一样，只是常数K的意义不同。利用上面的关系式可以用于荧光猝灭法的定量分析。 3. 能量转移猝灭 当猝灭剂吸收光谱与荧光体的荧光光谱有重叠时，处于激发单重态的荧光体激发分子的能量就可能转移到猝灭剂分子上或者猝灭剂吸收了荧光体发射的荧光，使荧光猝灭，而猝灭剂被激发，这是俗称 “内滤作用”。可用下式表示 : 4. 氧的猝灭 O可以说是荧光和磷光的最普遍存的猝灭剂。对于溶液磷光来说，氧的猝灭作用是十分2 有效的，通常观察不到溶液的室温磷光现象。而对于溶液荧光来说，不同的荧光物质和同一荧光物质和同一荧光物质在不同的溶剂中，对氧的猝灭作用的敏感性有所不同。 氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。有的认为可能是由于三重态的氧分子和激发单重态的荧光分子相互作用形成激发单重态的荧光分子相互作用形世激发单重态的氧分子和激发三重态的荧光分子所引起的，如下式表示: 也有的认为氧和其它须磁性的物质一样，它们之所以会使荧光猝灭，是由于它们能够促进激发单重态的荧光分子的系间跨跃()以及提高荧光物质基态分子的系间吸收跃迁 ()的几率;还有的认为荧光猝灭是由于荧光物质受到氧化的缘故。 5. 转入三重态的猝灭 s在“重原子效应”段落已经叙述，溴化物和碘化物都能产生“重原子效应”，促使荧 光分子的激发单重态转入激发三重态，导致荧光的猝灭。上面也已提及， 氧的猝灭作用也可能是O促使荧光体分子转入激发三重态所致。 2 6. 荧光物质的自猝灭 当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。自猝灭可能有如下几个原因: ? 荧光物质分子之间的碰撞能量损失，这实际上能量的外部转移形式: ? 荧光物质的自吸收，当荧光物质的吸收光谱与荧光发射光谱重叠时，会发生自吸收现象，处于S激发态的分子发射的荧光被处于基态的分子所吸收，使荧光强度降低。 1 ? 荧光物质分子的缔合。某些荧光体分子处于基态时会形成二聚体或多聚体，或者激发态分子1与基态分子M形成激发态二聚体1(M*M)。这些聚合物与荧光单体一般都会具有不同的荧光特性，有的使荧光强度降低甚至不发射荧光，有的使光谱发生变化。 此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝灭等，不一一叙述。 荧光分析仪 荧光分析仪器与紫外-可见分光光度计的基本组成部件相同，即有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。荧光仪器的单色器有两个，分别用选择激发波长和荧光发射波长。除了基本些部件的性能不同外，荧光仪器与紫外-可见分光光度计的最大不同是，荧光的测量通常在与激发光重直的方向上进行，以消除透射光和散射光对荧光测量的影响。其结构示意图如图14.9所示。 荧光分析仪的各主要部件简要分述如下: 1. 激发光源 ? 高压汞灯 激发光源应具有足够的强度、适用波长范围宽，稳定等特点。常用的光源有高压汞灯 和氙弧灯。 高压汞灯是以汞蒸气放电发光的光源，主要有365、405、436nm 的三条谱线， 尤以365nm谱线最强，一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源。 ? 氙弧灯 氙弧灯通常就叫氙灯，是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是一种短 弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，温度时其压力为5atm，工作时压力为20atm， 具有光强度大，在200,800nm 范围内是连续光源的特点。氙灯的灯内气压高，启动 时的电压高(20,40KV)，因此使用时一定要注意安全。 此外，高动率的可调谐染料 激光器是一种新型的荧光激发光源。这种光源不需单色器和滤光片，具有单色性特， 强度大，脉冲激光时间短而减少光敏物质的分解等伏点。但是仪器设复杂，所以应用 还不广泛。 2. 单色器 荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器，称为荧光分光光度计。光栅有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长，一般是后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些。在比较低档次的荧光计中，采用滤光片作为单色器，多使用干涉滤光片以获得纯度较好的“单色光”。第一滤光片用的分离出所需用的 激发光，第二滤光片用以滤支杂散光，瑞利光，拉曼光和杂质所发射的荧光。 3. 样品池 荧光分析的样品池通常用石英材料做成，它与吸光分析法的液池不同在于，荧光样品池的四面均为磨光透明面，同时一般仅有厚度为1cm的池。 4. 检测器 简易型的荧光计可用目视检测，或用硒光电池，光电管检测。现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的于扰。 在现代的高级仪器中，光导摄象管用来作为光学多道分析器(简称OMA)的检测器。它具有检测效率高、动态范围宽、线性响应好、坚固耐用和寿命长等优点。它的检测灵敏敏显不职光电倍增管，但却能同时接受荧光体的整个发射光谱。 5. 记录，显示装置 荧光仪的读出装置有读字电压表或记录仪。现代仪器都配上计算机，进行自动控制和显示荧光光谱及各种参数。 荧光仪器的校正及灵敏度 1. 仪器的校正 人们总希望仪器能记录荧光物质真实的荧光激发光谱和发射光谱，这种理想化的仪器应该是激发光源、单色器及检测器等各部分在所需要的整个波形中，性能都能一样，如图14.10所示。都是这种理想化的光学部件实际上并不存在，因此，对于一些较特殊的测定(如荧光量子产率的测定计算，动力学的某些研究等)，需对实际测定的"表观光谱"进行校正，以获得真实的光谱。 对荧光激发光谱和发射光谱的校正比较复杂，如有需要可参考有关专著。在现代仪器上，不少已在荧光分光光度计上装配有光谱校正装置。 此外，杂质光对荧光测量也有明显的影响，必须注意加以清除，在不少仪器中也还有杂质光的校正装置。 2. 荧光仪器的灵敏度 荧光分析法的灵敏度包含有两个部分:一是荧光体的本身因素，即荧光体的吸光系数及荧光量子产率;二是荧光仪器因素，它受到光源强度、稳定性、单色器的杂散光水平、光电倍增管的特性、高压电源稳定性及放大器的特性诸因素的影响，与紫外可见分光光度法比较，荧光分析法的灵敏度要高出2,4个数量级，这主要取决于仪器的因素。其一，荧光强度正比于入射光的强度，已知增大光源的强度可以提高灵敏度，降低检测限;其二，荧光的测量是在激发光的垂直方向检测的，即在暗背景中检测，所以只要较好地消除杂散光，采用较灵敏的检测器，很微弱的荧光都可以检测所以检测限较低。而吸光分析法是在亮背景下检测透射光与入射光强度的比值，所以当强度较小时，透射光与入射光强度相差很小，因此不能准确的检测，所以检测限较高。 用检测限来表示荧光法的灵敏度，在实际工作中是比较直观和方便的。荧光分析法的检 ,1测限可以有两种表示方法:一是以喹宁表示，在0.05mol?L硫酸中，喹宁的荧光峰为 ,1450nm，当喹宁溶液很稀(如0.05μg?L)时，溶剂的拉曼峰所造成的对喹宁荧光信号的噪声已相当显著。因此人们常以此时喹宁信号与仪器噪声之比的喹宁浓度定为该仪器的检测 ,1灵敏度。多数仪器的检测灵敏度为0.05μg?L喹宁，有些灵敏度高的仪器可达 ,10.005μg?L喹宁;二是以水的拉曼光信噪比表示，当水分子被激发时，水分子蒙受暂时 ,12,15的畸奇，在极短的时间内(10,10s)，会向各个方向发射出与激发光波长相等的瑞利光和波长略长的拉曼光。通过测量拉曼光的信噪比可以衡量仪器的检测灵敏度。由于纯的水易得，用同一波长的光激发水分子所产生的拉曼光波长一样，便于检测，所以用拉曼光信噪比表示仪器的灵敏度已为较多的产家所采用。 磷光分析仪与荧光分析仪的差别 磷光分析仪器与磷光分析仪器同样由五个基本部件组成，但需要有一些特殊的配件，在 比较好的荧光分析仪器上都配有磷光分析的配件，因此两种方法可以用同一仪器。磷光分析仪器与磷光分析仪器的主要区别有两点。 1. 样品池需配有冷却装置 对于溶液磷光的测定，常采用低温磷光分析法，即试样溶液需要低温冷冻。通常把试液装入内径约1-3mm的石英细管(液池)中，然后将液池插入盛有液氮的石英杜瓦瓶内，如图14.11所示。 激发光通过杜瓦瓶的没有镀银的部位照射到试样上，所产生的磷光经由直角方向上的类似部位投射到发射单色器后加以检测。 2. 磷光镜 有些物质会同时发射荧光和磷光，因此在测定磷光时，必须把荧光分离去。为此目的，可利用磷光寿命比荧光长的特点，在激发单色器和液池之间及在发射单色器和液池之间各装上一个斩波片，并且由一个同步马达带动。这种装置称为磷光镜，它有转角式(以图14.12a)和转盘式(如图14.12b)两种类型，尤以后者更为通用。 这两种类型的工作原理是一样的，现以转角式磷光镜说明之。转角式磷光镜是一个空心圆筒，在其周围面上有两个以上的等向距的狭缝，当马达带动圆筒旋转时，来自激发单色器的入射光断续交替地射到样品池，由试样发射的光也是断续交替(但与入射角异相)地到达发射单 色器的入口狭缝。而在磷光镜从遮断激发光转到磷光镜的出光狭缝对准发射单色器的入口狭缝的瞬间，由于散射光及荧光随着激发光被遮断而消失，检测器上便只检测得磷光的信号。此外，通过调节圆筒的转速，可以测出不同寿命的磷光。 荧光分析法的特点 1. 灵敏度高 前面已述，荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高2,4个数量级，检测不限在0.1, ,10.001μg?ml之间。主要原因有二:一是荧光信号是在暗背景下检测的，噪声小较微弱的信号也能被检测，且可以高倍放大;二是荧光强度和激发光强度成正比关系，可以提高激发光的光强以增大荧光强度。 2. 选择性好 荧光分析法的光谱比较简单，特征性强，而且有激发光谱和发射光谱，选择的余地大。如果某几种物质的激发光谱相似，就可以从它们发射光谱的差异进行鉴别和分析;相反如果发射光谱相似，可以从它们激发光谱的差异进行鉴别和分析、尤其是有机化合物的分析更是如此。 对于金属离子的分析来说，往往选择性不太高，这是由于金属离子的分析往往是通过产生具有荧光特性的配合物或荧光猝灭进行测定。而且荧光特性又往往取决于配位体，不同金属离子经常与同一配位体形成相似的配合物，具有相似的荧光特性，故会互相干扰。 3. 荧光法提供比较多的物理参数 可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。这些参数反映了分子的各种特性，能从不同角度提供研究对象的分子的信息。 荧光分析法的弱点是应用还不够广泛，这是因为本身能发射荧光的物质相对较少，用加入某种试剂使非非荧光物质转化为荧光物质来进行分析，其数量也还不多。此外，荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素较为敏感，干扰因素较多。 荧光分析法新技术简介 荧光技术作为一种分析方法一百多年来，得到很大的发展，特别是近几十年来许多新的 荧光分析技术的出现和应用，这些新技术灵敏度高、选择性好、取样量少方法快速简便等，已成为多种研究领域中进行痕量和超痕量甚至分子水平上分析的一种重要工具。现很扼要的介绍如下几种目前应用较多的方法。 1. 同步荧光沉淀法 常规的荧光激发光谱和发射光谱是分别在固定荧光发射光波长和激发光波长下，扫描荧光激发光波长和发射光波长所得到的光谱。同步荧光法是同时扫描 激发光和发射光波长下绘制的光谱，由测定的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图。根据激发单色器和发射单色器在同时扫描过程中彼此间所应保持的关系，同步荧光测定法还分为三种类型:第一种，在同时扫描过程中使激发波长(λex)和发射波长(λem)保持固定的波长间隔(即λex,λem,常数)，这种方法称为:"固定波长同步扫描荧光测定法"，即习惯上讲的同步荧光测定法，是最早提出的同步扫描技术;第二种，以能量代替波长关系，在两个单色器同时扫描过程中，使激发波长和发射波长之间保持固定的能量差(即频率或波长差)，这种方法称为"固定能量同步扫描荧光测定法";第三种，使激发和发射单色器以不同的速率同时扫描(即λex,λem?常数，而是时间的线性函数)，这种方法称为"可变角同步扫描荧光测定法"。同步荧光测定法具有使光谱简单、光谱窄化、减少光谱重叠、减少散射光影响、提高选择性等优点。图14.13为丁省的同步荧光光谱。 2. 导数荧光测定法 自从二十世纪50年代初期导数光谱技术应用于分光光度测定之后，使分光光电法的选择性得到很大的改善。直到1974年，导数技术才引起荧光分析，在解决荧光测定中的背景干扰和谱带重叠问题上受到良好的效果，已被证明是一种提高荧光分析选择性的有效手段。导数荧光测定法的基本原理与分光光度法类似，这里不再叙述。 3. 三维荧光光谱测定法 普通荧光分析所得的光谱是二维光谱，即荧光强度随波长(激发波长或发射波长)的变化而变化的曲线。如果同时考虑激发波长和发射波长同时对荧光强度的影响，则荧光强度应是激发波长和发射波长两个变数的函数。描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱，称为三维荧光光谱，三维荧光光谱是近一、二十年中发展起来的一种新的荧光分析技术，在文献中使用的名称不一，常见的称为三维荧光光谱，荧光总发光光谱，激发,发射矩阵和等高线光谱等。三维荧光光谱的表现形式有二种:一是等角三维投影图，见图14.14所示，这种表示法比较直观，x,y,z三维坐标轴分别表示发射波长、激发波长和荧光强度;二是等高线光谱图，如图14.15所示，以平面坐标的横轴表示发射波长，纵轴表示激发波长， 平面上的点表示由两波长所决定的样品的荧光强度，将荧光强度相等的各点连接起来，便在λλ构成的平面上显示出一系列等强度线组成的等高光图。 em-ex 4. 荧光免疫检测 免疫学的重要对象是抗原体和抗体的反应问题。免疫检测法通常以未标记的抗原与特定抗体间的竞争性抑制作用为基础的。检测时，抗体(Ab)和已标记的抗原(AgL)两者组成混合物，两者浓度固定，且抗体的浓度受到限制以保证抗原处于过量。未标记的抗原(Ag)加入到一个在一定温度下培育过的混合物中时，已标记的抗原(AgL)被稀释，并发生竞争抑制作用而建立以下的平衡: (AgL-Ab)和(Ag-Ab)分别表示抗体与已标记抗原和抗体与未标记抗原的配合物。由于竞争作用，未标记的抗原对抗体的联接作用使原来可联接于已标记抗原的抗体现场量减少了，因而减少了(AgL-Ab)配合物的形成，从(AgL-Ab)配合物的减少或游离Agl的增加，都可以检测式样中的抗原。荧光免疫检测采用荧光标记物(L)标记抗原，以进行测定。因此荧光标记物或称荧光探针的选择成为方法的关键所在。现在，已有各种各样的荧光探针应用于生物、生化和医学临床检测，其中以荧光类衍生物和罗丹明衍生物应用较为广泛。 此外，还有时间分辨荧光测定法、相分辨荧光测定法、荧光偏振测定法、低温荧光测定法及固体表面荧光测定法等。读者可以参阅有关专著。