[中学教育]放线菌抑菌圈实验

[中学教育]放线菌抑菌圈实验[中学教育]放线菌抑菌圈实验放线菌主要分布在土壤中(主要是链霉菌)，其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器本项目研究所用主要仪器为:高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，分析天平，电热恒温鼓风干燥箱，微波炉，空气恒温震荡器。 1.1.2 试剂 NaOH，乙醇，10%酚等。 1.1.3 菌种本实验所用指示菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia )。 coli 1...

[中学教育]放线菌抑菌圈实验放线菌主要分布在土壤中(主要是链霉菌)，其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器本项目研究所用主要仪器为:高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，分析天平，电热恒温鼓风干燥箱，微波炉，空气恒温震荡器。 1.1.2 试剂 NaOH，乙醇，10%酚等。 1.1.3 菌种本实验所用指示菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia )。 coli 1.1.4 培养基 [3](1)高氏I号培养基(g/L):可溶性淀粉 20;NaCl 0.5;KNO1;KHPO•3HO 0.5;3 242MgSO•7HO 0,01;FeSO•7HO 0.5;琼脂粉15-25，加去离子水至1L, pH7.4-7.6。121?,灭4242 菌20min。 [3](2)牛肉膏-蛋白胨培养基(g/L):牛肉膏3;蛋白胨10;NaCl5;琼脂粉15-20，加去离子水至1L,pH7.0-7.2。121?,灭菌20min。 [4](3)发酵培养基(g/L):蔗糖45;黄豆粉25;KHPO0.2;NaCl 1;NaSO0.1;FeSO0.01;24 4 4CaCO 3;加去离子水至1L，pH7.2。121?，灭菌 20min。 3 1.2 方法 1.2.1采土样选取有机质丰富、通气性良好的、偏碱性的土壤，(pH 7.0-7.5)。用小产挖取地表下5-25cm 的土壤5g。 1.2.2放线菌的筛选 (1)土壤悬浊液梯度稀释:将5.0g土壤加入到50ml无菌水中，震荡10min制备土壤悬 -3-4液;用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml无菌水中作10倍稀释;按1:10稀释至10、10、-5 [3]10。 -3-4(2)倒平板:取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度(10、10、-510，每个稀释度做两个培养皿)。然后在融化并冷却至50?左右的高氏I号培养基加入10, [3]的酚数滴，混合均匀;在每个培养皿中倒15-20ml左右，待冷凝备用。 -3-4-5(3)涂布: 用1ml无菌吸管分别精确地吸取10、10、10的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒(从浓度小的开始)将加入 [3]平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。 (4)培养: 接种完毕，将平皿放入28?培养箱中培养7天，观察平皿上放线菌菌落生 [3]长情况。 (5)平板划线分离纯化:挑取培养7天后的平皿上的单个放线菌菌落，在淀粉琼脂平皿上进行三区划线法一次分离纯化，28?培养7天。若不纯，则如上方法进一步分离纯化，直 [3,4]至纯培养为止，并观察放线菌菌落特征。 1.2.3 鉴定菌种制作装片，镜检，观察菌落特征，判断是否属于放线菌。 1.2.4产抗生素放线菌的筛选 (1)初筛:配制高氏I号液体培养基，分装于8个250mL的三角烧瓶中，每瓶50ml;鉴定出的菌株接种于高氏I号液体培养基中，于28?，160r/min振荡培养7天。 (2)抑菌实验:配制牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒15ml于12个培养皿中，冷却后作下层平板，将三种指示菌菌悬液和牛肉膏-蛋白胨培养液混匀后倒上层平板，并在其上放入牛津杯，在牛津杯中分别加入经离心(4000rmp，15min) 的供试菌培养液0.1ml，于 28?培 [5.6]养24小时，观察抑菌圈情况，并测量其直径。 (3)复筛:配制发酵培养基，分装于6个250ml三角烧瓶中。将初筛到的放线菌培养液以6%的接种量转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28?，160r/min培【5】养4天，得发酵液。 2 结果与讨论 2.1 结果指示菌菌种号大肠杆菌金黄色葡萄球菌 2.2讨论 2.2.1关于菌种鉴定放线菌可以产生色素，且放线菌代表属也分好几种。其菌落一般为圆形，菌落质地致密表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱、地衣状、表面干燥，可作为鉴别菌种的基本参考依据。孢子丝生长到一定阶段可形成孢子。由于孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表现出特定的颜色，而且在一定条件下比较稳定，故也是鉴定菌种的依据之一(但孢子的形态和大小不能笼统地作为分类鉴定的重要依据)。 2.2.2关于放线菌的分离纯化分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理，或加入某种抑制剂(如加数滴10%酚等)，都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。

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