【doc】微生物产生的细胞分裂素

【doc】微生物产生的细胞分裂素 微生物产生的细胞分裂素 l凌4 230?儆牛物学通报 1986.322:481,483 6]RuizhenC.JamesEBBiotechnolProg,t994,10360 , 364 7lKKosraviM,DaleAWBena吡enCSPlasraiot 199024:19O一194 81吴变中国科技首届学术击文集;肆:l商 科技出版社,1992196,199 9】光琳.马志力,萤文玲等微慢l物,199I,3113):198 , 205 I10]MagnoloSKLeenutaphongDL,DemodenaJA, ?Bio/Technology,1991,9473,476 【11lDemo6eR~JA,Gutle~rezS,VelascoJ,ef"f Bio/Technology.199311:926,929 【12】WilfredC,EallasEH,.1amesEBBiotechnolProg. 1994,10308,3l3 o/微生物产生的细胞分裂素 要二!鹭 {浙江农业大学环保系,杭州3【0029 细胞分裂素(cytokinin)是一类直要的植 物激素.它的主要生理功能是刺激细胞分裂, 促进侧芽发育,维持蛋白质和核酸的合成,延缓 离体叶片衰老等作用.细胞分裂素可用于蔬菜 保鲜,防衰和延长贮藏期以及花卉保绿和延长 开花期等在组织培养工作中,细胞分裂素也 是分化培养基中不可缺少的常用化合物 天然细胞分裂素广泛存在于高等植物中, 电是许多微生物的代谢产物"J植物体内细胞 兮裂素含量很低,一般为l0一,10g鲜重,并 且含量极不稳定,随植物生育期,生长季节和植 侏部位的不同而变化.目前商品细胞分裂 索12]主要来源于有机化学多步合成,因其产率 低,价格昂贵,生产规模仅能满足试剂级水平, 诈且有些种类我国目前尚不能合成,依赖进口, 严重影响了人们在农业生产和生活上J的需要. 而微生物具有生长速率快生产周期短培养条 件易控制不受季节限制等特点,故崩微生物生 物合成,发酵生产细胞分裂素已引起各国学者 的兴趣和重视,并开展了微生物源细胞分裂素 的研究J.本文着重介绍微生物源细胞分裂 索的研究概况. 1微生物源细胞分裂素的种类及其化学结构 细胞分裂素是植物激素中较年青的一员. l955年,Miller和Skoog等人在培养烟草髓部 纰织时,发现在培养基中加人酵母汁,可促进烟 草髓部的细胞分裂,将这种能诱导细胞分裂的 ; 物质分离,提纯后命名为激动素(kinetin,缩写 KT),即N一呋喃腺瞟呤(6一fitrfuryladenine). 激动素是DNA的降解产物,并不是天然的植 物生长调节物质.第一个天然存在的细胞分裂 索为玉米素(zeatin,缩写Z)是Letham于 1963年首次从甜玉米粒中提取并结晶出来 的.Letham于l964年确立了玉米素的结构 式为6-(4-羟基-3-甲基一2一反式一丁烯氨基) 嘌呤,其生物活性大约是激动素的l0倍.此 后,Letham等人又相继发现了几种玉米素的 衍生物.为了使用名称方便和减少混乱, Skoo~6J等建议把具有与激动素相同的促进细 胞分裂和其他生理功能,在第六位置取代的氨 基嘌呤类物质命名为细胞分裂素(cytokinin, 简称CTK).1966年,KlambtD[71等人从带化 病棒杆菌(Corynebacteriumfascians)的培养液 中分离到CTK,这是首次有关微生物源细胞分 裂素的报道.迄今在微生物中发现的CTK已 有十余种,其中以反式玉米素活性最高.反式 玉米素分子式为c10H.N0,Mw=2192,熔 点206208?,摩尔吸光系数为l6.5× 10270nmpH7.2.各种CTK的生物活性与其 N-6位上侧链长度,侧链上是否存在双键,双 键位置以及侧链的构型等有很大关系'….一 般认为侧链的最适长度为5,6个碳,需有双键 199,_o15收稿 ,,/ Z q/ , 1/ 1f%9Z 1996年23(4)微生物学通报 存在,双键位置在3-4位上,反式构型则活性 大.图1是在微生物中发现的几种CTK的化 学结构. 2产细胞分裂素的微生物 2.1带化病棒杆菌(Corynebacterium fi~scians) 最早检测到的能分泌CTK的微生物是 带化病棒杆菌最初推测带化病棒杆菌能产 生CTK是基于这样一个事实,即带化病棒杆 菌引起的植物病症与用激动素或玉米素处理 豌豆种子或浇淋健康幼苗得到的结果相似. Thimann和Sachslt0]首先证实了这一推测. 他们采用两种生物测定法(豌豆芽法和燕麦 叶绿素保持法)鉴定培养在无嘌呤基质上的 带化病棒杆菌,证实其发酵液的氯仿萃取液 具有CTK活性.而同样培养的另一株白喉 棒杆菌(C.diphtheriae)的氯仿萃取液则无 CTK活性.此后人们又结合用质谱,uv等理 化方法测定带化病棒杆菌产生的CTK,共检 测到7种,即异戊烯基腺嘌呤(2iP),异戊烯基 腺嘌呤核苷(2iPA),核糖基玉米素,顺式玉米 素,反式玉米素,顺式一甲硫基一玉米素和6一 甲基氨基嘌呤(meAde)而具生物活性的 cTK主要是2iP和玉米素. … - c:-i,~ NH c 一 HH 腰一棱糖基玉米素 朋 cHc\c NHeCH,.. /CH,OHNH— c . ,cH ".CH~O!p--O--CH~.0I r璐.棱糖基玉米素 一 H00H 反一棱糖基玉米素 /CH . 反-接仔酸玉米素 圈1几种主要的微生物源细胞分裂索的化学结构 H00H ~2t0A ? N』, 《 (#m?料器一一 lI 卑己甲己蠢一葶?巴手 微生物学通报 Murai…等人比较了五株带化病棒杆菌的 毒性与CTK产量的关系.这五株菌株是:强 毒性菌株Mw,含两个质粒,其中一个大的质 粒分子量>10u中等毒性的菌株Cfl和Cf2 各含三个质粒,其中一个是小分子量的质粒 低毒性菌株Cfl5有一个小分子量的质粒.无 毒株Cfl6无质粒.结果发现:l缘去MW2 和Cfl菌株中较小的质粒,菌株未丧失致病 力?强毒性菌株培养基中CTK活性比中等 毒性株CTK活性大20-50倍,中等毒性株 CTK活性叉比弱毒性和无毒性株的CTK活 性大lO倍.这表明菌株的毒性程度与分泌的 CTK产量有关. 2.2根癌农杆菌(AgrobacteriumtumeJaciens) 1967年,;Klambt报道了另一植物病原菌一 根癌农杆菌菌株培养滤液具CTK活性.用 纸层析和iiv光谱鉴定为2iP根癌农杆菌是许 多双子叶植物的病原菌,它能在宿主植物的感染 部位引起冠瘿瘤(grownga?tumor),伴随着肿瘤 的生长,能大量合成细胞分裂素和生长素. Kaiss-Chapman和Morris14t报道他们的实验菌 株C静止期的培养液中有7种CTK,主要是 2iP,反式一乇米素和甲硫基一核糖基玉米素,此 外,还有少量的2iPA,顺玉米索,反式核糖基 玉米素和ms-2iPA其中玉米素的顺反异构体 之比为15.85这表明培养液中的核糖核苷可 能是tRNA代谢产物,因为后四种在tRNA的水 解物中都能检测到. 关于根癌农杆菌分泌CTK的机理,Re. gier和MorrislJ2]的研究表明只有那些带有冠 瘿碱(nopaline)Ti质粒菌株才能分泌反式玉米 素,其产量大约为200--800ng/L发酵液.消 除了冠瘿碱Ti质粒的菌株和带有章鱼碱 (octopine)或农杆碱(agropine)质粒的菌株不 产生玉米素,但消除冠瘿碱质粒的菌株重新 获得冠瘿碱质粒能恢复产玉米素特性. 2.3萨氏假单胞菌(eudomonas$avastanoi) 1975年Surico[t31报道了萨氏假单胞菌的培 养滤液中含有2iP和2iPA,而且还鉴定出在其 滤液中还含有l一甲基一反式玉米素. MacDonldt5定了萨氏假单胞菌PB2132菌株 的产苗为玉米索和核糖基:I米素各80ng/ml 发酵液.而萨氏假单胞菌Ewl0o6菌株含瑶米 索400ng/ml发酵液和反式一l_甲基米素 180ng/ml发酵液,其产量比根癌农杆菌c株 大1000倍与根癌农杆菌相同,这两株萨氏假 单胞菌也携带CTK合成基因的质粒. P.savastanoiEW1006菌株含有2个质 粒,分别具105和81个碱基对,能分泌=臣米素, 核糖基玉米素和卜甲基反式玉米素核苷. 丢失含105个碱基对的质粒则丧失产CTK的 能力 P口mPB213-2有5个质特{分别 含64,5648,42,38个碱基对).主要分泌玉米 素和核糖基玉米素.如丧失42个碱基对的质 粒即丧失分泌玉米素和核糖基玉米素的能力. 将萨氏假单胞菌EW1006株质粒上大约105 个碱基对的基因克隆到大肠杆菌中能够表达出 具二甲丙烯基转移酶井分泌米素. MacDonld(1986)通过 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ,发现萨氏假单胞 菌中的CTK合成基因和根癌农杆菌中的细胞 分裂素合成基因的核苷酸顺序有很高的同源 性.农杆菌中控制CTK生物合成的异戊烯基 转移酶基因被称作ipt和tzs,而在萨氏假单咆 菌中则称ptz.tzs和ptz之间同源性为48%, 而ipt和ptz之间同源性约为44% 2.4根瘤菌(Rhizobium) 关于根瘤菌产生CTK的研究远不如根癌 农杆菌或萨氏假单胞菌那样详尽.Phillips和 Torreyll'J用纸层析分析根瘤菌培养物,结果 表明大豆根瘤菌对数生长期分泌玉米素和核糖 基玉米素类化合物.豌豆根瘤菌分泌2iP类化 合物由于这些化台物含量甚微,尚未能结晶 提纯出来根据生物法(大豆愈伤组织)测定, 大豆根瘤菌分泌的CTK相当于I~gKE/L培 养基,豌豆根瘤菌分泌的CTK总活性为 O.3gKE/L培养基. 根瘤菌也载有质粒,f}j这质粒缺乏显性 的遗传标志,因此无法证实根瘤菌的感染性与 它的质粒有关,也未能阐明质粒与根瘤菌产生 qZ日Z,!dl{ 微生枕学_擅报 CTK的关系. 2.s弗兰克氏菌(F,ankia) Stevens"报道了一种分枝丝状的放线菌 能引起木本植物(赤杨)根瘤并进行生固氯的 弗兰克氏菌培养液中存在cTK,经高效液相和 气一质色谱确定弗兰克氏菌HFPArI菌株培 养液中约含iPAlng/ml. 此外,愿核生物中能分泌CTK的微生物 还有从热带植物叶瘤中分离到的蓝黑色杆菌 (romobacteritazalMdum);从山毛榉(beech) 根表分离到的浅黄链霉菌(Streptomyces fhtveotus);油菜根系的节杆菌(rthro bactersp):植物根表的维氏固氮菌 (Azotobactervinetandii)等都能分泌具CTK 活性的物质,但这些信息都是基于生物测定的 结果,而不是来自于理化性质的鉴定 2,6真菌 Miller…(1967)晟先报道j菌根真菌玫红 根颓膜菌(Rh~opogonroseolus)产E的反式 米素和反式棱糖基玉米素据报道能产生 CTK的真菌还有瘿外囊菌(Taphrinacerasi)牛 肝菌(Bolefedu如)和蓝根肿菌 (Ptasmodiopherabrassicae】等病原真菌.对这 些真菌分泌CTK的机理和遗传背景(是由核 基因,还是由细胞器基因编码)尚不清楚 表l归纳了已检知的产细胞分裂素的微生 物,从这些不完仝的信息中可以看出能分泌 CTK的微生物主要是那些能感染植物的微生 物,而且大部分是植物病原菌或j植物共生以 及存植物根际,根表,根系或叶表等处生艮的微 生物这为我们分离产CTK的微生物提供了 重要信息 表I已检测到分泌细胞分裂素的微生物 微物细胞分裂素的种类微生物绷帕丹裂书的种赘 带化病捧杆苗(Coo,aeballerium[ascian)2iP凡根捐苗l)aponieum~l,撒豢 2iPA棱枯基米索 棱糍基米素蓝黑色杆t~(C&omob"c埘"r删J上知 顺式一玉米索节杆蔺(Arthroba~tersp)束 压式玉米素雏匝咧氨茼(Azotohacter~,inelondii)^l刊 ms一顺式玉米索雀稗固氯菌(paspali)^知 6甲摹氨基嘌呤拜氏同氟(be~ermckiO 根癌农杆菌(Agrobmterlumtumejac,,ns)2iP浅盏链霉甑Is!rtomreesflaveolu,O盂洲 反式一玉米索弗兰克氏菌(Frankiasp)2JPA 2lPA攻瓤根颁膜苗(PO~izopogonro.wlus)反一l求 顺式一术寮厦式按糖基米索 反式核糖基正朱券Sui?luspunelipsi米索 ms-2iPA贼式一核糖基米衰 m梭槠孽l1水求樱外囊(T.phrmacerasi)米泉 萨氏假单胞酋(Pseudomonasavatanoi】核糖丛l,米求 PB2】}{菌株米常#瘿从赤壳{Nectriagal[~ena】知 棱糖基玉米索E.u~baxidiumrtJyrti[[t^知 EW1006菌株梧糖基一1一甲基玉米索Euvae~rM^ 米素Moni~a1r{iea|nt知 豌根瘸茁(Rlffzobium妇uminosarum)2iP 3微生物细胞tRNA中的细胞分裂素CTK还存在于各种生物的tRNA裘 微牛物学通报 2列出了微生物细胞tRNA中的CTK种类. tRNA具携带和输送特定的氨基酸功能. CTK结台在紧靠tRNA反密码子3端处. 但并不是所有的tRNA都结台有CTK.只有 编码氨基酸的密码碱基顺序以U(尿嘧啶)为 起始密鹂于的tRNA才有,而且也不是所有以 u为起始氨基酸编码的tRNA上都带有 CTK.例如大扬杆菌的tRNA在六种以u 为起始的tRNA中都结合着CTK,即苯丙氨 酸,亮氨酸丝氨酸,酪氨酸,半胱氨酸和色氨酸 的tRNA带有CTK,但在酵母菌中,只有亮氨 ,酪氨酸和半胱氨酸的tRNA有 酸,丝氨酸 CTK微生物细胞tRNA中的CTK只有当 细胞裂解,tRNA降解后方能释放表2可见 99623(4) 微生物的tRNA中的CTK主要是2iPA和棱 糖基玉米素以及这两种化台物的甲摹硫衍牛 物.. 关于CTK结合在tRNA上的意义…,有 人认为游离的CTK可能来源于tRNA分=f=的 降船,CTK与tRNA脱离以后,才具有植物激 索活性.但存在于细胞tRNA上的CTK量微 少,呵游离CTK的量相比之下要多得多,这就 无法解释这一推测.亦有人认为游离CTK与 tRNA的CTK无关系,因为已有证据表明 CTK台成途径中并币涉及tRNA.此外还有 人认为游离CTK具有抑制tRNA中CTK降 船的作用.总之,关于CTK与tRNA结合的 意义是有争论的,有待以后的研究来阐明 表2微生物细胞tRNA中的细胞分裂素 微物与IRNA合的细胞分裂索微生物tRNA结台的细胞*襞末 太脑杆闰(E~cherichiacoliJ2iPA节~(Arthrobac,sp)2iPA ms-2iPA铜绿假单胞菌m援糖基乇米采 啭酸乳杆菌(Pseudomonasaeruginosa} "actobactllusacidophilus2iPA枯轩菌(Bacillussu}ffJnms-2iPA 植物乳杆菌鼠伤摩沙门瞳茁ms一2iPA ILncI曲ucmlpIantarum,2iPA(Salmonellat~himwium) 表皮葡萄球菌根癌农杆菌2iPAms一2iPA (Staph~'"c?epidermidix12iPA.ms一2IPA(Agrobacteriumrdc)厦式一枉糖基米索 带化病棒杆菌2iPAms-2iPAm核糖基t米索 (nebacterium/ascians顺式一棱牿基米豢顺式一ms一桉糖基米寰 1_乏式一棱糖基玉米索解淀粉敢史&菌ms-2iPA 咂式1m_棱齄基米索(Erwinklamvlovora) 太豆根癌蘸(RdaponiclmD核糖蕈t米索酿酒酵母2iPA ills一棱糖基K米素(Saccharomyce~cerevisiae) 豌豆根瘤苗tllS2lPA樱外囊~(Taphrmacerasi)核糖基米豢 lRht:r1b?HliegumicosarJtm1婀一m愤耱基米素 4微生物培养物中CTK的分离纯化和鉴定 微生物发酵液一般都要先离心,离心后的 t清液仍不能直接用于CTK的生物法测定, 因其中有许多对植物有毒害的干扰成分,故应 先进行分离纯化. 在微生物源CTK的早期研究中.,人们 往往采用各种纸层析.薄层层析或阳离子交换树 脂进行分离纯化,以后又有用SephadexLH-20 的.一个更为简便的方法是用Water公司的 产品Sep-pakC1筒柱从微生物发酵上清液中 富集提纯CTK,效果较满意此外, cI8/porasilB,C1RBondElut等也有类似作 用.只是须注意随着此类l帏的使用次数增加, CTK的回收率会逐步下降.常规的分离纯化 1996年23(4J微生物学通报 过程还包括聚烯吡咯烷酮【PVP)的应用和正 丁醇的分溶.近年来,也有用免疫亲和层析 法"从微生物发酵上清液中分离纯化CTK 的,但尚不普及. CTK困其有嘌呤核,敞呈特征性的强烈紫 外吸收,这一特征为高教液相色谱(HPLC)进 行CTK定性定嚣溯定提供了基础.目前 HPLC已发展成CTK分析的主要方法之 .. ,其检测灵敏度可达ng级水平甲基化 或j甲基硅烷化的样品也可用气相色谱(GC) 分析.而气相色谱一质谱联用(GC—MS)则是 鉴定未知植物激素撮有力的工具 此外,70年代末发展起来的放射免疫测定 法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)已成 为植物激素研究中大量样品分析定量的一种更 迅速,更灵敏的检测方法. 除了理化分析外,植物激素都需生物法鉴 定.CTK的生物鉴定方法约有20余种,各 有优缺点,本文不一一赘述.一般而言,烟草茎 髓和大豆叶的愈伤组织测定法是Cq-K定性 测定的经典方法,只是需时颇长(2,3J哥).人 们如需快速测定的话,可用萝h子叶和苋属 生物测定法,这对合成化合物或部分提纯的 提取物不失为一个较为理想的测定方法. cTK生物活性常以KE"(kinetinequivalents) 表示.即以激动素为标准,样品中含有相当于若 干单位激动素活力的细胞分裂素 5结语' 微生物源细胞分裂素的研究目前尚处于初 步检测水平,而关于微生物体内CTK的代谢 途径的信息则是零碎的,不完全的.开展微生物 产CTK生理生化,遗传背景的研究必定有益于 CFK高产菌株的获得.微生物细胞较植物细胞 简单,易培养,生长速率快,且微生物产生的植物 激素种类较单一,这为探索弄清CTK在生物体 内的代谢研究提供了新的更为方便的实验材料, 也是微生物发酵生产细胞分裂素的潜力所在. 致谢本文承蒙铵泽澍教授审阅,修改,深表谢 意 参考文献 【【】GreeneEMBotRev19804625,74 【2]成积圻,"【四蛛,马建国,街化学与L物物理进展, 19806.43,45 【3】HelgesonJP,LeonardNJProcNatIAcudSciUSA. 1996,56.60,63 【4】Kalss—chaDRwMorrisROBiochemBioph" ResCommun,1977.76:453,459 【5】MacDonidEMS.PowellGKRegierDA.etaLPlant ph)siol1986,82:742,747 【6】SkoogFStrongFM.MillerC0Science1965.532- 533 【71Kl~mbtD,ThiesG.SkoogFProcNatIAcadSciUSA, 【966,56:52,59 【8】李雄彪,强金忠简明植物牛物化学律:南阡太学出版 社,1992276 f9]陶国清.章一安植物生理牛化进展.1986,474,98 【101ThimannKV,SachsTAmJBot1966,53:73【一739 【I1】MuratN.SkoogF.DoyleMEProcNatlAcadsc1 USA,【98077619,23 【12】RegierDA.MorrisROBiochemBiophysRes Commun1982,104:1560,1566 【13】SuricoGSparapanoLLerarioPExperientia.1975 31929,930 f14】phillipsDATorreyJGPhysiolplant.【970,23:[057 , 【063 【151phiLLipsDA.TorreyJGPlantPhysiol1972491 【5 【161S~vensGAJrBerryAMPlantphysio1.】988,87:15 一 】6. 【】7】MillerCOScience.1967157:】055,【057 【181ArmstrongDJ.BurrowsWJ.SkoogFef?,procNat[ AcadSclUSA.196963834,84_. 【191CamesMG,BrennerML,AndersenCRJ Chromatogr,1975.108:95,106 t201MacsonldEMs,MorrisROMathodsEnzymo1.1985 110:347,358 f2I1MorrisROJamesonPE.LaloueM.?1ptant physiol,【991,951】56,1【61 【221ArtecaRNPoovaiahBW.SmithOEPlantphys~o1. 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