[应用]阴道上皮细胞转染抗菌肽LL-37和防御素5后对假丝酵母菌的抑制作用的
方法
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阴道上皮细胞转染抗菌肽LL-37和防御素5后对假丝酵母菌的抑制作用的方法
外阴阴道假丝酵母菌病(??C)是一种多发、常见病,而且V?C可反复发作,既影响了生命质量叉增加了医疗费用,一些药物的滥用也增加了耐药的发生。故迫切需要研发更安全而有效的抗真菌药物。抗菌肽因其抗菌谱广,抗菌能力强,对突变菌株有效,成为近年抗感染研究的热门因子。本研究以人阴道上皮细胞为模型,转染抗菌肽LL37和防御素5(human defensin5,HD5)真核重组质粒并与假丝酵母菌共培养,观察阴道上皮细胞分泌的HD5、LL-37及炎症趋化因子白细胞介素8(IL-8)的水平变化。
主要材料
1.菌株及质粒:HD5真核重组质粒―pcDNA3.1(+)/DH5-EGFP和LL-37-EGFP由天津学内分泌研究所惠赠。假丝酵母菌
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
株购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
2.主要试剂:细胞转染用hpokdaminc?00试剂盒购自美国In?itrogen公司,高纯质粒提取试剂盒购自美国Biomiga公司。显色液:包含葡萄糖氧化酶13U/ml、辣根过氧化物酶6U/m1、苯酚30mmol/L、?氨基安替吡啉13mm。l/L、磷酸盐缓冲液(PBS)100mmc,l/L,pH7.0.
人HD5走?置ELISA试剂盒最小可测浓度为0.01ug/ml,人LL-37定量ELISA试剂盒最小可测浓度为0.1411g/ml人IL-8ELISA试剂盒最小可测浓度为15pg/ml此3种试剂盒均购自天津瑞科生物技术有限公司。
方法
1.人阴道上皮细胞的培养和传代:阴道上皮细胞取材于因子宫肌瘤或子宫腺肌病行子宫全切除术的育龄期妇女的阴道壁组织;术前宫颈细胞学检查无异常,感染筛查均为阴性,术后病理检查确诊c本研究获得天津医科大学第二医院伦理委员会批准,组织提供者均签署知情同意
书
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。采用组织块法L2]进行原代细胞培养。将新鲜组织块放入加有抗生素(庆大霉素50ug/L,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml)的4?D?ank溶液无菌小瓶内,经消毒、分离,将组织碎块接种于一次性培养瓶中,加入含抗生素(两性霉素B0.25mg/L,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml)的上皮细胞培养基(M,在37?6%C0孵育箱中培养。组织接2
种后4~6d在小组织块周边可见生长出来的原代阴道上皮细胞,上皮细胞逐渐生长融合,原代培养10d左右细胞融合。当上皮细胞接近90%融合时,用0.1%胰蛋白酶-0.01%乙二胺四乙酸消化液按体积比?2或?3进行传代,当传至第4代进行实验。台盼蓝拒染法检测细胞活力可达90%~95%,显微镜下计数上皮细胞纯度为99%以上。
2,假丝酵母菌的制各:假丝酵母菌标准株转种于37?沙氏葡萄糖琼脂培养基,2d后再转种1次。选取生长良好的单一菌落,PBS洗涤2次,PBS重悬,调整细胞密度为1×104个/ml各用:
3抗菌肽真核重组质粒转染阴道上皮细胞:以o.5×1σ个/ml的密度将细胞接种入?孔培养板,加人500耐无抗生素K-田M培养基至细胞融合率达80%~90%时,分别将质粒lDcDNA31(+ˇEGFP、pcDNA3.1 ( +)/HD5-EGFP 及 pcDNA3 1(+)/LL冖37?GFP与lipokdamine?00
混合后转染细胞,按试剂盒操作说明书进行转染。用空载质粒pcDNA3.1(+)/EGFP设置空白对只黑,每孑L设2个复孔。
4实验分组:将阴道上皮细胞分为无菌组及带菌组,每组各含4个亚组:未转染亚组(未转染任何质粒)、HD5亚组(转染pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP)、LL-37I亚组(自专芗芝pcDNA3?1(十)/LL37-EGFP)、助怠璀等袈枵昶?z组(犁帮染pcDNA3,1(+)/HD5-EGFP及pcDNA3.1(+)/LLs7-EGFP)。 带菌组:效应细胞(即阴道上皮细胞)经计数并将细胞悬液调至4×105个/llll,靶细胞(即假丝酵母菌)用PBS配成1×104个/Illl的菌悬液,效靶细胞按姗?在
岁?6%CO2培养箱中共培养建立假丝酵母菌性阴道炎细胞模型;无菌组:只培养阴道上皮细胞,密度为4×105个/mll。
5抗菌肽质粒转染阴道上皮细胞后ELISA方法检测细胞囚子分泌水平:无菌组:向6孔板每孔加人11111阴道上皮细胞、11?11PBS;带菌组:向6孔板每孑L加入11?11阴道上皮细胞、1ml假丝酵母菌。37?6%C02共孵育6、?、以、48h后,每时段收集各组细胞的培养上清夜，ELISA方法检测HD5、LL-37、IL-8的水平，试验步骤按照实际盒说明书进行。试验重复3次。
结 果
一、转染后阴道上皮细胞HD5、LL-37的分泌水平同一时段各组亚组间LL-37水平比较,差异有统计学意义;无菌组及带菌组中联合转染亚组高于LL-37亚组,LL-37亚组高于未转染亚组,差异均有统计学
意义(P(o.o1)。带菌组中各个亚组LL-37的水平均高于无菌组中相对应各亚组,差异有统计学意义(P
0O~,)。带菌组的LL-37亚组与HD5亚组比较,差异无统计学意义(P)0.ω);带菌组的联合转染亚组A值明显高于组内其余各亚组,差异有统计学意义(P(0.01)。组内不同时间A值差异有统计学意义(F时间=1?.833,P<0.01),但无菌组内各亚组不同时间A值比较,差异无统计学意义(P>0.“),?值呈缓慢下降趋势;带菌组中各亚组各时段组内A值两两比较,差异均有统计学意义(P(0,01),A值呈明显下降趋势,但联合转染亚组?值下降趋势较未转染亚组、LL-37亚组和HD5亚组缓慢。组间和处理时间之间存在交互效应(F交互=19叨?笱5,P<0.01)。
三、阴道上皮细胞转染后IL沼的分泌水平
同一时段各组亚组间IL蔼水平差异有统计学意义(F=25?时间175,P<0.01);无菌组及带菌组中联合转染亚组高于LL~37亚组、HD5亚组,LL-37亚组、HD5亚组高于未转染亚组,差异均有统计学意义(P<0.01)。带菌组中各个亚组IL蔼的分泌水平均高于无菌组中相对应各亚组,差异有统计学意义(P<0.01)。组内不同时间IL沼水平差异均有统计学意义(F=1.43.066,P<0.01),在6h时最低,?h达高峰,然后呈时间
下降趋势;无菌组阴道上皮细胞分泌IL沼处于低水平稳定状态,联合转染质粒后可使IL沼分泌水平增加。组间和处理时间之间存在交互效应(F=3717.862,P<001)。 交互
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