【doc】固体表面特征对脲变α-糜蛋白酶折叠的贡献

【doc】固体表面特征对脲变α-糜蛋白酶折叠的贡献 固体表面特征对脲变α-糜蛋白酶折叠的贡 献 2007年第65卷 第2l期.2411,24l6 化学 ACTACHIMICASINICA Vo1.65,2007 No.21.24ll,24l6 研究论文 固体表面特征对脲变a一糜蛋白酶折叠的贡献 刘振岭柯从玉李建军耿信笃术 (西北大学现代分离科学研究所现代分离科学陕西省重点实验室西安710069) 摘要以脲变6t一糜蛋白酶(6c—Chy)为模型蛋白,用蛋白折叠液相色谱法研究了该蛋白在7种不同固体表面上的折叠及其 在折叠过程中形成的中间体,选用疏水相互作用色谱(HPHIC)固定相为吸附剂,在动态条件下着重研究了疏水色谱固 定相TSK和PEG一600表面对脲变6tChy复性效率的贡献.用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱对3.0mol?L 脲变6tChy,在经HPHIC柱复性并同时分离的收集组分进行确认后,仅有一种稳定的脲变6t—Chy折叠中间体.发现 PEG一600固定相表面较TSK固定相对6c—Chy复性效果好.证实了疏水性强度及固体表面配基的结构对蛋白折叠起着关 键性的作用. 关键词疏水色谱;固体表面;蛋白折叠;6t一糜蛋白酶;折叠中间体 ContributionofSolidSurfacetoUrea.denatured a-ChymotrypsinFolding LIU,Zhen—Ling十KE,Cong—YuLI,Jian—JunGENG,Xin.Du (InstituteofModernSeparationScience,ShaanxiKeyLaboratoryofModernSeparationScience, NorthwestUniversity,Xi'an710069) AbstractThecontributionofthesurfacesofsevenkindsofsolidswhicharethestationaryphaseofhy— drophobicinteractionchromatography(HIC)tothefoldingofurea—denatured,.c— chymotrypsin(.c—Chy)was investigatedunderadynamicconditionandtheformedintermediatewasisolated.ThesurfacesoftheHIC stationaryphaseofPEG一 600andTSKwereselectedasthetypicalsolidsurfacestostudythefoldingefn— ciencyoftheurea—denatured.c—Chyandtheisolatedintermediateof.c— Chy.Theobtainedresultindicatesthat thecharacterofasolidsurfacehasasignificantcontributiontoproteinfolding.ComparedwiththeTSK column.thesurfaceofPEG一600stationaryphaseisefficientfortherenaturationoftheurea—denatured.c—Chy andforitsqualitycontrolduring.c—Chyfolding.Matrix— assistedlaserdesorptionionizationtimeofaflight massspectrometerwasemployedtoidentifythemolecularweightofeachofthecollectionsafterHPHIC separationbythetwokindsofstationaryphasesandtoconfirmthatthereisonlyonestablefoldedinterme— diatefromthemixtureoftheurea—denatured.c— Chy.Withthecomparisonofspecificbioactivityofthere— foldeda-Chy,thesurfaceofHICPEG一 600stationaryphasewasprovedtobebeuerthanthatofTSKagain. Itfurtherdemonstratesthatasuitablehydrophobicsurfacewithgoodhydrophobics~engthandaligand structureplaysakeyroleinproteinfolding. Keywordshydrophobicinteractionchromatography;solidsurface;proteinfolding;a-chym otrypsin; foldedintermediate E—mail:xdgeng@nwu,edu.cn;Te1./Fax:029—88303817. 河南新乡医学院高级访问学者. ReceivedOctober27,2006;revisedApril10,2007;acceptedJuly4,2007 国家自然科学基金(Nos.39880003,20175016)资助项目. 2412化学Vb1.65.2O07 蛋白复性或蛋白折叠研究是目前分子生物学和生 命科学中的前沿课题f',.多年来科学家以多种方式试 图提高蛋白折叠成功率,或活性蛋白复性的回收率,蛋 白折叠液相色谱法(ProteinFoldingLiquidChromatogra— pbY,PFLC)[3]便是其中的一种,即用液相色谱(LC)进行 变性蛋白折叠和复性.作者之一【4】早在1992年就用疏水 相互作用色谱(HPHIC)对变性蛋白进行复性研究,发现 HPHIC固定相对重组人干扰素一1,(rhIFN一1,)复性起重要 作用】,其复性机理与分子伴侣协助蛋白折叠极为相 似【6】.依据HPHIC进行蛋白折叠的分子学机理?6', HP?C固定相对蛋白折叠的贡献可解释为:当一种组 分从溶液中转移到一个固体表面时,就会发生化学势突 跃【lo】,所以变性蛋白被固体吸附时,固体表面能够在分 子水平上给变性蛋白分子提供足够高的能量,以利于变 性蛋白分子克服可能存在的能垒(energybarrier).笔者 之一测定了变性蛋白在HPHIC固定相表面的折叠自由 能】,发现固定相表面能为变性蛋白分子提供比通常蛋 白复性缓冲液中高数十乃至数百倍的能量. 近年来生物质谱在生命科学领域得到了广泛应用 和发展[11,12]尤其是在蛋白质组学领域研究中,质谱已 成为鉴定蛋白质的最重要技术平台之一.在脲变过程 中,一糜蛋白酶(—Chy)存在有肽段,聚集体,变性态和 中间体,如经分离与检测,便能为研究蛋白质复性提供 丰富的信息,故选用一糜蛋白酶(—Chy)为模型蛋白.用 不同HIC固定相为吸附剂对脲变—Chy进行复性并同时 分离,借助用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱 (MALDI.TOF-MS)对分离所得各流分分子量进行确认, 为进一步研究和提高变性蛋白的复性效率提供重要信 息,并取得了满意的结果. 1实验 1.1仪器和材料 LC一10A高效液相色谱仪(Shimadzu),包括主控器 (SCL-10AVP),检测器(SPD.10AVP),泵(TC-10ATVP), 恒温柱箱(CCTO.10ASVP),ClassVP5.03色谱工作站,色 谱柱为150ml/l×4mmI.D.不锈钢管,用匀浆法装填 PEG.200,PEG-400,PEG一600,PEG一1000,苯基和糠醇填 料(陕西西大科林基因药业有限公司,西安),TSK柱 (TSKgelphenyl?5pw,日本进口).AXIMA—CFRplus质 谱仪(Shimadzu),紫外分光光度计为uV一1601PC(Shi— madzu). 1.2主要试剂 . 糜蛋白酶(—Chy,购自美国Sigma公司,纯度为 37units/mg);硅胶基质的不同疏水色谱填料由陕西西 大科林基因药业有限公司赠送.(NH4)2SO4,KH2PO4,脲 (西安化学试剂厂, 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯)和其他试剂均为分析纯,水 为去离子水. 1.3实验方法 1.3.1色谱条件 A液:2.5mol*L一1(NH4)2SO4+0.05mol*L,KH2PO4 (pH=7.0);B液:0.05mol?L-.KH2PO4(pH=7.0),过滤 后使用,30min线性梯度(0%B,100%B)洗脱,流速为 1.0mL?min一,检测波长为280nm. 1.3.2实验过程 (1)称取6mg—Chy若干份,分别配制在1.0mL0, 1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mo1.L1的脲溶液中,在室温下变性 24h.取各个脲浓度的—Chy600g进样于已用100%A 液平衡过的疏水色谱柱上,进行30min线性梯度洗脱, 直至B液为100%;再继续用B液持续洗脱10min使色 谱柱再生,最后用100%A液平衡色谱柱,以构成一个 完整的色谱过程.收集与天然峰相同的流分,测定 5一Chy的质量和活性回收率. (2)分别收集对应3.0mol*L脲变—Chy,且经 PEG一600柱和经TSK柱复性的—Chy色谱峰或折叠中 间体峰流分,再在上述色谱条件下,将所收集的中间体 样品连续进样(样品中蛋白浓度太低)到TSK柱上,另外, 也将经TSK柱后复性的5一Chy流分连续进样到PEG一600 柱上,最后对其收集液进行—Chy的质量及活性回收率 测定. 1.3.3质谱条件 经过HPHIC分离后的收集流分经过冷冻干燥后, 用微量超纯水溶解,与一氰基一4一羟基肉桂酸(CHCA)饱 和溶液以1:1(混合后,取1laL点于靶板上,空气 吹干.在线性正离子模式下进行质谱分析,使用多肽混 合物及蛋白质质谱标准品作为外标对仪器进行校正. 1.3.4.Chy的活性测定 — Chy的活性按文献[131方法测定. 1.3.5蛋白含量的测定 蛋白含量按文献【14】方法测定. 2结果与讨论 2.1脲变a-Chy在7种疏水色谱柱上复性并同时分离 的色谱行为 图I为用3.0mol*L脲变.Chy变性后并以7种疏 水色谱柱进行复性并同时实现分离的色谱图.图中阿拉 伯数字表示色谱柱类型,而带"术,'符号的峰为复性成天 然—Chy的色谱峰(活性峰位置的确定是结合天然一糜 NO.2l刘振岭等:固体表面特征对脲变a一糜蛋白酶折叠的贡献2413 蛋白酶的出峰时间,并对各个峰进行质谱和活性测定而 最终确定的).从图1看出:(1)脲变.Chy在经不同的 HIC柱复性后所得的.Chy保留时间均不相同,其保留 时间次序为TSK>苯基>PEG.600>糠醇>PEG.400> PEG.1000>PEG.200.除PEG.1000柱外,在其他色谱 柱上的保留时间和这几种色谱柱的疏水性强弱完全一 致.(2)在不同HIC柱上所得色谱峰的峰高和峰宽也有明 显的差别,体现出疏水性不同的色谱柱对脲变.Chy的 复性效果也存在着差异.(3)在不同色谱柱上所得色谱峰 的数目也不同.从分离效果看以PEG.600及TSK柱效 果为佳,并以TSK柱为最佳(见后),因此有必要对该两 种柱的复性效果进行进一步的深入研究和比较. g 0 .. t 一 'q 芒 0 兰 《 t/mIll 图17种疏水色谱柱对脲变?一糜蛋白酶的色谱分离图 l—TS2一苯基:3--PEG600;4一糠醇:5--PEG400;6__PEG10oo;7m PEG200;为活性峰 Figure1Theseparationchromatogramsofa—chymo?ypsinby sevenkindsofhydrophobiccolumn l—_Tskcolumn:2~phenylcolumn:3--PEG600column;4一furfuralcolumn; PEG400column;6--PEG1000column;7--PEG200column.istheactivity Deak 图2为3.0mol?L脲变.Chy和天然.Chy分别在 TSK和PEG.600柱上的色谱复性并同时分离的效果比 较图.可以看出,天然.Chy在PEG.600柱上只出现一 个峰,而在TSK柱上却出现了3个峰,这是因为天然 . Chy会发生自降解,形成了小分子多肽,表现出用 TSK柱所得分离效果好于PEG.600柱.然而脲变.Chy 产物在两种色谱柱上都有一个色谱峰的保留时间与天 然.Chy峰的保留时间完全一致,并且在相同进样量条 件下,复性后所得的两个.Chy色谱峰的高度均低于天 然Chy色谱峰,说明只有部分变性蛋白得到了复性. 还能看出,经PEG.600柱后复性所得的7个色谱峰中仅 有一个峰处于天然.Chy色谱峰之后.依据HPHIC分离 的蛋白按疏水性由弱到强的次序的原则.说明在该柱上 【.Chy.总之,虽 只有一种脲变产物的疏水性大于天然0 然二柱所表现出复性及分离的效果差异颇大,但尚无法 对其优劣作出评估. 图2PEG600和TSK柱对天然和3.0mol-L脲变?_糜蛋白 酶的色谱分离图 A:PEG600;B-TSK.1一天然d.Chy,2—3.0mo1.L脲变d-Chy.为活性峰 Figure2Thechromatogramsofnativeand3.0mol~L—urea. denatureda.ChybyPEG600andTSKHICcolumn A:PEG600HICcolumn;B:TSKHICcolumn.1一natufala-Chy;2—3.0mol? L,urea.denaturedd.Chy.istheactivitypeak 2.2MALDI-TOF-MS确认a-Ghy的折叠中间体 对该二柱分离后的所有流分进行MALDI.TOF.MS 检测,结果见图3.图3a是天然.Chy的质谱图(为对照 图,m/z为25424-3),可以看出在图2A中2的7个峰中 只有活性峰和未尾峰的质谱图中有M峰,分别是 25431.2和25428.6(见图3,b和c);而在图2B的8个峰 中只有在活性峰的质谱图中有M峰,25419.8(见图3d), 其它只是一些分子量大小不同的多肽(图中未列出).这 几个M峰的分子量和天然.Chy的m/z有微小出入,这 是由于在质谱分析中,灵敏度及准确性随分子量增大而 一gE0?.E日DJ0?D《一gE0?I1日qJ0?D《 2414化学V_01.65.2O07 ? C 量 '罚 C 三 8 蔓.0…'a 强i254243.IL/IL50— 885?2 20000400006000080000 Mass/Charge 20000400006000080000 Mass/Charge .= C 量 100 80 i 葛60 C 岂40— 20 0 20000400006000080000 Mass/Charge 20000400006000080000 Mass/Charge 图3天然0c—Chy,复性0c—Chy及折叠中间体的质谱图 图a,b,c,d分别代表天然一Chy,PEG一600柱后复性a-Chy,PEG一600柱后尾峰 和TSK柱后复性R—Chy Figure3Massspectraofnatural0c—Chy.folded0c—Chyandfoldedintermediate a,b,c,drepresentthenative-Chy,therefolded-ChybyPEG600colunm,thefractionoflastpea kofPEG一600andtherefolded一ChybyTSKcolunm,respec— tively 显着降低【1,因此误差在所难免.然而从前面的质谱图 中可以看出PEG一600柱后的尾峰和天然a—Chy峰的分子 量却完全相同.说明a—Chy有两种质量完全相同但空间 构型不同的a.Chy,其中有一种应为a—Chy的折叠中间 体.对于脲变a—Chy在经过TSK柱复性与分离后,只得 到一个分子量为25419.8的峰的原因,究竟是存在折叠 中间体,还是折叠中间体与复性蛋白混在一起难以分离 开,须待进一步研究. 2.3不同脲变浓度mChy在不同固定相上的活性回收率 活性回收率的大小是表明蛋白复性质量损失大小 及复性完全程度的一个重要证据.为比较不同固定相对 a—Chy的复性效率,测定了不同浓度脲变a—Chy在经 HPHIC分离后与天然a—Chy蛋白的活性回收率,结果见 表1.将柱前天然a.Chy的活性回收率定为100%,经 PEG_600柱后活性回收率竞高达110.2%.这是因为 a—Chy在储藏或运输途中已有少量的失活,当其经HIC 柱时又得到了复性.然而经TSK柱后a—Chy的活性回收 率仅为94.8%,表明前者复性效果优于后者.从表1还 可看出,虽然随着脲浓度的增加,脲变a—Chy经该两种 色谱柱后,活性回收率均趋于降低,然而在脲浓度较低 时(1.0,3.0mol?L),a—Chy的活性回收率均高于过柱 前的活性,说明低浓度脲可使蛋白质分子的立体结构丧 失的程度不大,当该变性a—Chy随流动相流经HPHIC 色谱柱时,可从固定相表面获取能量使其折叠成天然 a—Chy,从而提高了蛋白的活性回收率,这正体现了 HPHIC法确实能使变性a—Chy达到复性.当脲浓度高于 6.0mol?L时,不仅可使蛋白质分子的立体结构完全丧 失,甚至部分或完全破坏a—Chy分子的一级结构,导致 变性蛋白难以复性或者根本无法复性. 表1不同脲浓度变性的0c—Chy经不同色谱柱后蛋白活性的测 定结果. Table1Theresultofproteinbioactivityof0c—Chywhichdena- turedbydifferentconcentrationofureaandthenrefoldedby differentcolumn 目标蛋白活性回收率/% urea浓度/(m.1.L一)柱前柱后 TSKPEG一60o "连续3次测定结果的平均值. a—Chy经该二色谱柱复性后的活性回收率不同,表 明了固定相表面的配基和疏水性强度不同对蛋白复性 的贡献是不相同的,从本实验结果来看,PEG一600柱对 脲变a—Chy的复性效果优于TSK柱. b_一 ? 一 . 一 ?—?J???,,]?,J?』?踟??加0 NO.2l刘振岭等:固体表面特征对脲变a一糜蛋白酶折叠的贡献2415 2.4不同浓度脲对口一Chy变性后对口一Chy复性比活的 影响 比活是蛋白活性(复性完全程度)与纯度(柱分离能 力)的一个表征指标.为更清楚地比较该二固体表面对 脲变.Chy复性效果,根据柱后.Chy的活性回收率和 质量回收率计算不同浓度脲变.Chy经该两种色谱柱后 蛋白的比活,结果如表2所示.从所得的.Chy比活值 看,PEG.600柱也优于TSK柱.因为在用PEG.600柱复 性过程中色谱固定相已将未复性的.Chy中间体与已复 性的.Chy分离,从而达到对蛋白复性质量控制的目的. 所以复性的蛋白比活能更直观地反映固体表面对变性 蛋白的复性效率.表2再次表明PEG.600固定相对变性 蛋白的复性效率优于TSK固定相,在1.O,3.0mol~L 脲变.Chy时,PEG.600固定相有很好的复性能力,其 比活都大于天然.Chy的比活(51U?mg_1).虽然TSK固 定相对1.O,2.0mol~L脲变.Chy有很好的复性能力, 而且脲浓度范围在2.0~5.0mol~L时,TSK柱后的质 量回收率都高于PEG.600固定相,但其比活值远低于用 PEG一600. 2.5TSK柱后脲变口一Chy折叠中间体的分离 为证实上述观点,将从PEG.600柱上获得的含有 一 Chy折叠中间体的收集液作为样品,二次进样到TSK 柱,得到一个色谱峰,使我们惊讶的是该色谱峰的保留 时间竟然与天然.Chy色谱蜂的保留时间完全一致(见 图4).这里可能因两种情况所致,一是该折叠中间体经 过疏水性较强的TSK柱后进一步折叠成了我们所期望 的天然.Chy,二是我们所不期望的TSK柱根本不能将 . Chy折叠中间体与完全复性的.Chy分离开.为此, 测定该TSK柱后的二次收集液的活性和质量,发现比 活仅为l4U?mg-.,远远低于天然.Chy的柱前比活(51 U~mg),说明经PEG.600柱所得到的.Chy折叠中间 体再经TSK柱后并没有得到复性. E C 0 o0 C 七 0 D 《 图4PEG600柱后iX-Chy折叠中间体及天然iX-Chy经TSK柱 的色谱图 l一天然d—Chy,2--PEG600柱后折叠中间体.为活性峰 Figure4Thechromatogramsofa—Chyintermediaterefolded byPEG600columnandnaturala—ChyelutedbyTSKcolumn l—natural—Chy;2一thefoldedintermediateof—ChyrefoldedbyPEG600 column.istheactivityDeak 相反,将先经TSK柱复性的.Chy收集液第二次进 样到PEG.600柱,发现PEG.600柱后出现两个色谱峰 (见图5),且他们的保留时间分别与脲变.Chy在第一 次经PEG.600柱后所得复性.Chy和中间体的保留时间 完全相同.从所测的该两个峰的比活看,第一个峰的比 活是69U?mg-.,第二个峰的比活是12U~mg-..这就完 全证实了脲变.Chy在第一次经过TSK柱时,仍然存在 折叠中间体,只是在此种情况下TSK柱难以将已复性 的.Chy和未复性的.Chy折叠中间体分离开,从而无 法从色谱图上看出来.由此可知,在图1中所示的经 TSK复性所得的,在天然.Chy峰处出现的复性.Chy 峰高的原因是完全复性的.Chy与稳定的.Chy折叠中 间体二者峰高的加合.在表2中3.0mol~L脲变性后复 性的.Chy在TSK柱上的质量回收率(34.2%)也高于在 PEG.600柱上的质量回收率(28.9%),再次证明了这一点. 表2不同脲浓度变性的a—Chy经不同色谱柱后蛋白的质量回收率和比活 Table2Themassrecoveryandspecificactivityofa—Chywhichdenaturedbydifferentconcentrationofureaandthenrefoldedby differentcolumn .连续3次测定结果的平均值 2416化学,bl|65.20o7 图5TSK柱复性后Or-Chy及脲变a—chy经PEG600柱的色谱 图 J一3.0mo1.L脲变n.Chy;2--PEG600柱后折叠中间体.为活性峰 lqgure5Tllechromatogramsof6t-ChyrefoldedbyTSKcol— tlmnanddenatureda.ChyelutedbyPEG600column 1—_3.0mo1.L_.urea.denaturedn.Chy;2--intermediateof3n.Chyrefolded byPEG600column.istheactivitypeak 3结论 (1)作为固体表面对蛋白折叠贡献的研究,蛋白折 叠色谱法是一种理想的方法,便于更换固相(固定相)和 可连续改变缓冲液组成(用流动相梯度洗脱),亦可选择 多种研究条件. (2)HPHIC固定相是研究变性蛋白折叠中选择固相 表面对蛋白折叠贡献的首选方法,它可使变性蛋白在接 近生理条件下进行复性.不同HPHIC固定相对脲变 a.Chy的复性效率,纯化分离能力有较大的差别. (3)在用HIC对脲变a.Chy折叠过程中仅形成一个 相对稳定的折叠中间体.该折叠中间体难以复性并具有 低的生物活性. (4)PEG一600固定相对脲变a—Chy的复性效率优于 TSK.1.0,3.0mol-L脲变a.Chy经PEG.6O0柱复性后 有很高的活性回收率和比活:TSK柱不能很好地将复性 — Chy与其折叠中间体分离开.从而影响了对脲变 — Chy的复性效率及复性蛋白的纯度, (5)变性蛋白在适当强度疏水表面上的折叠过程 中,固相表面的疏水强度和不同配基共同对蛋白折叠起 着关键性的作用. References lJungbauer,A.;Kaar,W.Biotechno1.20o7,128,587. 2Tan,G.J.S.;Revilla,F.D.;Zauner,K.-P.BioSystems2007, 87,289. 3Geng,X.一D.;Bai,Q.;Wang,C.-Z.ProteinFoMingL~uid Chromatography,SciencePress,Beijing,2006,PP.177, l84(inChinese). (耿信笃,白泉,王超展,蛋白折叠液相色谱法,科学出 版社,北京,2006.PP.177,l84.) 4Geng,X.D.;Chang,X.Q.Chromatrogr.1992,599,l85. 5Geng,X.D.;Bai,Q.;Zhang,Y.J.;Li,X.;Wu,D.Bio- techno1.21104.13(1,3),l37. 6Zhang,Y.一D.;Zhang,L.?H.;Geng,X.一D.Chin.Biotech- no1.1999,15,240(inChinese). (张耀东,张丽华,耿信笃,生物工程,1999,15,240.) 7Geng,X.一D.;BaJ,Q.Sci.China,Ser.B2002,32,460(in Chinese). (耿信笃,白泉,中国科学(B辑),2002,32,460.) 8Bai,Q.;Wei,Y.一M.;Geng,M.一H.:Geng,X.?D.Chem.J. in.Univ.1997.8.129l(inChinese). (白泉,卫引茂,耿明辉,耿信笃,高等学校化学, 1997,18,1291.) 9Geng,X.D.;Zhang,J.;Wei,Y.M.Chin.Sci.Bul1.2000, 45,236. 10Giddings,J.C.UnedSeparationScience,Wiley— Interscience,John&Sons,INC,NewYork,1991,P.144. 11Jia,W.一T.;Lu,H.-J.;Yun,D.;Yang,P.一Y.ActaChim. Sinica200J7,65,177(inChinese). (贾韦韬,陆豪杰,炱栋,杨艽原,化学,2007,65, 177.) l2Qi,W.;Jia,Z.一X.;He,Z.一M.;Qiao,B.ActaChim.Sinica 2O07.65.233(inChinese). (齐崴,贾辰熙,何志敏,乔斌,化学,2007,65,233.) l3Folk,J.E.;Schirmer,E.W.',.Z.Chem.1965,240,181. 14Bradford,M.M.Ana1.Biochem.1976,72,248. 15Chen,J.;Fu,H.;Chen,Y.;Zhao,Y.-F.Chin.J.Org.Chem. 2O02,22,81(inChinese). (陈晶,付华,陈益,赵玉芬,有机化学,2002,22,81.) (A0610273ZHAO,X.J.;LING,J.) I_g=0?—o0I1日qJ0?D《