HepG2细胞培养方法(学习资料)
HepG2细胞培养方法
细胞复苏:
材料
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:HepG2细胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS(青霉素+链霉素)
35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜
试剂配制:
100ml完全培养基:90mlRPMI-1640 + 10ml胎牛血清+1支PS,4?保存 步骤:
1( 罗口离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3ml.。
2( 从液氮罐中取出细胞冻存管,迅速置37?水浴1min至融化。 3( 打开冻存管,吸取细胞悬液至离心管,轻轻混匀。
4( 800rpm离心5min,弃上清。
5( 细胞沉淀中加入4ml完全培养基,转入35cm培养瓶37?常规培养,第二天观察细胞生
长情况。
细胞传代与换液:
材料:RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、
35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜
试剂配制:
100ml终止液:90mlRPMI-1640 + 10ml小牛血清+1支PS,4?保存 步骤:
1( 对数增长期汇合度80%—90%的细胞可以传代,4ml PBS清洗两次。 2( 加入0.25%胰酶1ml,37?孵育5min。
3( 加入3ml终止液,吹打细胞使其脱落并单个化,再移至罗口离心管。 4( 离心5min,800rpm,弃上清。
5( 罗口离心管加入完全培养基,混匀后分瓶培养。
6( 细胞隔日可以用PBS清洗后更换培养基。
细胞冻存:
材料:RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、消毒的冻存管、水浴箱、计时器、离心机、过滤器、光学显微镜
试剂的配制:
10ml冻存液:7ml完全培养基+2ml胎牛血清+1ml DMSO,混匀后过滤,4?保存 步骤:
1( 去除培养瓶中旧的培养基,加入4ml PBS清洗两次。
2( 混匀胰酶,每瓶加入1ml,37?孵育5min。
3( 每瓶加入3ml终止液,反复抽打细胞使其脱落并单个化,移至罗口离心管。 4( 800rpm离心5min,弃上清。
5( 每管加入1ml冻存液,混匀细胞,移至冻存管中。将细胞冻存管放于-20?保存2hrs。 6( 细胞冻存管-80?过夜。
7( 第二天转入液氮中保存。
细胞种板:
材料:RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、
35cm细胞培养瓶、六孔板、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜、细胞计数器
步骤:
1( 将汇合度为80%-90%的HepG2细胞加入4ml PBS清洗两次。
( 加入1ml已混匀好的胰酶消化,37?孵育5min。 2
3( 培养瓶中加入终止液3ml,反复吹打使其脱落并单个化,细胞悬液转移至罗口。 4( 800rpm离心5min,弃上清。
5( 加入6.5ml完全培养基,充分混匀细胞,取15ul细胞悬液进行细胞计数,要求六孔板
6 6 约5*10-1*10/孔。
6( 将6ml细胞悬液转入六孔板,每孔1ml,轻轻摇匀悬液,使其均匀完全覆盖,37?继续
培养。
软脂酸和炎症因子处理HepG2细胞:
材料:RPMI-1640、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、甲醇、PBS、PS、
软脂酸(SIGMA P9767)、TNF-a、BSA
消毒的罗口离心管、消毒的吸管和EP管、过滤器、光学显微镜、测量计、过滤器 试剂配制:
1( BSA培养液:
储存液:称取1g BSA溶于10ml RPMI-1640,混匀后过滤,4?保存
工作液:一瓶RPMI-1640加入2mlBSA储存液和一支PS,即浓度为0.2%,4?保存 2( 软脂酸储存液:称取13.92mg软脂酸(分子量278.41)溶于1ml甲醇,即浓度为
0.05mmol/ml,37?水浴助溶,分为5份分装于EP管,-20?保存 3( TNF-a储存液:称取10ngTNF-a溶解于1mlPBS,及浓度为10ng/ml,分为10份分装于
EP管,-20?保存
步骤:
1( 低倍显微镜观察六孔板里细胞状态,保证无污染,无杂质,汇合度为70%-80%的细胞才
可以进行下一步实验。
2( 六孔板里的细胞加入1mlPBS清洗,每孔加入1ml 0.2% BSA的RPMI-1640,继续无血清
培养24hrs。
3( 不同浓度软脂酸处理细胞24hrs。(每组三个复孔)
(1) 对照组:用1mlPBS清洗后, 每孔1ml BSA继续培养。
(2) 0.02mmol/L palmitate: 1.2ul 软脂酸储存液+2998.8ul BSA,每孔1ml。
(3) 0.04mmol/L palmitate: 2.4ul 软脂酸储存液+2997.6ul BSA,每孔1ml。
(4) 0.08mmol/L palmitate: 4.8ul 软脂酸储存液+2995.2ul BSA,每孔1ml。
(5) 0.16mmol/L palmitate: 9.6ul 软脂酸储存液+2990.4ul BSA,每孔1ml。
(6) 0.32mmol/L palmitate: 19.2ul 软脂酸储存液+2980.8ul BSA,每孔1ml。 4( 不同浓度TNF-a处理细胞24hrs。(每组三个复孔)
(7) 对照组: 每孔1ml BSA继续培养。
(8) 5ng/ml TNF-a: 1.5ul TNF-a储存液+2998.5ul BSA,每孔1ml。
(9) 10ng/ml TNF-a: 3ul TNF-a储存液+2997ul BSA,每孔1ml。
(10) 20ng/ml TNF-a: 6ul TNF-a储存液+2994ul BSA,每孔1ml。
(11) 40ng/ml TNF-a: 12ul TNF-a储存液+2988ul BSA,每孔1ml。
Trizol法提取细胞总RNA流程
材料:
1. RNAiso Reagent: 购于Taraka(货号:D312),100ml
2. 氯仿、异丙醇、无水乙醇:国产分析纯
3. 0.1%DEPC-HO、PBS、75%乙醇 2
4. DEPC处理的EP管、滴头、50ml离心管,5ml注射器、计算器、低温离心机、冰盒 材料的去RNA酶化:
1( 0.1%DEPC水 配好的DEPC水过夜灭活,高压蒸汽灭菌,
2( EP管、滴头、离心管用0.1%DEPC水浸泡过夜,高压蒸汽灭菌,
3( 75%乙醇:75ml无水乙醇+25ml 0.1%DEPC水。
4( 新购买的异丙醇分装于DEPC处理的50ml离心管,4?保存
步骤:
1. 吸出培养基,PBS清洗一次;
2. 向100ml培养瓶(6孔板中2孔)加入1ml RNAiso Reagent,水平放置片刻,使裂解液
均匀分布于细胞
表
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面并裂解细胞,然后使用移液枪吹打细胞使其脱落(约30次);将裂
解液转移至1.5ml EP管,移液器反复吹打(推荐用5ml注射器抽打10次); 3. 室温静置5min后加入氯仿200ul(RNAiso Reagent:氯仿,1ml:200ul),用力震荡后,
室温静置5min,待分层后离心,12000g,4?,15min;
4. 取80,无色上清液至另一干净1.5ml EP管(切忌吸出白色中间层),加入400ul异丙醇
(异丙醇应与上清体积比为1:1),充分混匀后,静置10min;
5. 12000g,4?,离心10min,此时管底可见沉淀;
6. 小心弃上清液,缓慢沿管壁加入75,乙醇1ml,轻轻上下颠倒使沉淀飘起,12000g, 4?,离心5min,小心弃乙醇,可离心数秒后将残液吸走;
7. 室温静置2-5min,干燥RNA;
8. 加入DEPC-HO 30或40ul溶解RNA,-80?保存。 2
RNA浓度的标化:
吸取4ul RNA+196ul DEPC水稀释50倍在分光光度计上测算样品的浓度,记好A260、Con(ug/ml)和A260/A280,原始浓度为测量浓度*50(A260和Con换算为Con:A260=40, A260/A280为1.6-2.0,线性范围最好),标化的方法是以最低浓度的一个样品为
标准
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进行标化,标化10ulRNA,计算各个样品加DEPC水量,做RT时RNA加样量为X(0.5ug/原始浓度*1000)ul。
RT-PCR 材料:逆转录试剂盒(TAKARA DRR047A)、PCR试剂盒(TAKARA DRR081A)
PCR水(灭菌蒸馏水)、去RNA酶的200ul离心管、PCR 8连管、计时器、水浴箱 逆转录反应体系为20ul
(1) 基因组DNA的除去反应。
5*g DNA Eraser Buffer 2ul
g DNA Eraser 1ul
RNase Free dH2O (10-2-1-X)ul
Total RNA Xul
42? 2min 水浴,4?保存
(2) 反转录反应。
5*PrimeScript Buffer2 4ul
PrimerScript RT Enzyme MIX 1 1ul
RT Primer MIX 4 1ul
RNase Free d H2O 4ul
37? 15min??85? 5sec (PCR仪反应,约16min,迅速转入,20?保存)
PCR反应体系为25ul
SYBR Premix EX Taq ? 12.5ul
上游引物 0.25ul
下游引物 0.25ul
PCR水 10ul
c DNA 2ul
*无论做RT还是PCR应先将按样品数计算每种试剂加入量,配在一管里面混匀后加入每个反应管里面,再加各个管的RNA或c DNA,为了保证每管加量完全,可以多配1-2样品的试剂量,混匀加入每管。
*考虑到做PCR时检测具体基因数不同,反应体系可以以倍数的改变,如P两个基因,RT时可以做6ul体系,即每个试剂加入量均*0.3,混匀后加入每管。
*加入RT后cDNA2ul,注意加样量一致,改好盖子,在盖子一端的边缘做好标记,弹去反应液里面的空气,离心。