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HepG2细胞培养方法(学习资料)

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HepG2细胞培养方法(学习资料)HepG2细胞培养方法(学习资料) HepG2细胞培养方法 细胞复苏: 材料:HepG2细胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS(青霉素+链霉素) 35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜 试剂配制: 100ml完全培养基:90mlRPMI-1640 + 10ml胎牛血清+1支PS,4?保存 步骤: 1( 罗口离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3ml.。 2( 从液氮罐中取出细胞冻存管,迅速置37?水浴1min至融化。 3( 打开冻存管,吸取细胞悬液至...

HepG2细胞培养方法(学习资料)
HepG2细胞培养方法(学习资料) HepG2细胞培养方法 细胞复苏: 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 :HepG2细胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS(青霉素+链霉素) 35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜 试剂配制: 100ml完全培养基:90mlRPMI-1640 + 10ml胎牛血清+1支PS,4?保存 步骤: 1( 罗口离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3ml.。 2( 从液氮罐中取出细胞冻存管,迅速置37?水浴1min至融化。 3( 打开冻存管,吸取细胞悬液至离心管,轻轻混匀。 4( 800rpm离心5min,弃上清。 5( 细胞沉淀中加入4ml完全培养基,转入35cm培养瓶37?常规培养,第二天观察细胞生 长情况。 细胞传代与换液: 材料:RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、 35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜 试剂配制: 100ml终止液:90mlRPMI-1640 + 10ml小牛血清+1支PS,4?保存 步骤: 1( 对数增长期汇合度80%—90%的细胞可以传代,4ml PBS清洗两次。 2( 加入0.25%胰酶1ml,37?孵育5min。 3( 加入3ml终止液,吹打细胞使其脱落并单个化,再移至罗口离心管。 4( 离心5min,800rpm,弃上清。 5( 罗口离心管加入完全培养基,混匀后分瓶培养。 6( 细胞隔日可以用PBS清洗后更换培养基。 细胞冻存: 材料:RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、消毒的冻存管、水浴箱、计时器、离心机、过滤器、光学显微镜 试剂的配制: 10ml冻存液:7ml完全培养基+2ml胎牛血清+1ml DMSO,混匀后过滤,4?保存 步骤: 1( 去除培养瓶中旧的培养基,加入4ml PBS清洗两次。 2( 混匀胰酶,每瓶加入1ml,37?孵育5min。 3( 每瓶加入3ml终止液,反复抽打细胞使其脱落并单个化,移至罗口离心管。 4( 800rpm离心5min,弃上清。 5( 每管加入1ml冻存液,混匀细胞,移至冻存管中。将细胞冻存管放于-20?保存2hrs。 6( 细胞冻存管-80?过夜。 7( 第二天转入液氮中保存。 细胞种板: 材料:RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、 35cm细胞培养瓶、六孔板、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜、细胞计数器 步骤: 1( 将汇合度为80%-90%的HepG2细胞加入4ml PBS清洗两次。 ( 加入1ml已混匀好的胰酶消化,37?孵育5min。 2 3( 培养瓶中加入终止液3ml,反复吹打使其脱落并单个化,细胞悬液转移至罗口。 4( 800rpm离心5min,弃上清。 5( 加入6.5ml完全培养基,充分混匀细胞,取15ul细胞悬液进行细胞计数,要求六孔板 6 6 约5*10-1*10/孔。 6( 将6ml细胞悬液转入六孔板,每孔1ml,轻轻摇匀悬液,使其均匀完全覆盖,37?继续 培养。 软脂酸和炎症因子处理HepG2细胞: 材料:RPMI-1640、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、甲醇、PBS、PS、 软脂酸(SIGMA P9767)、TNF-a、BSA 消毒的罗口离心管、消毒的吸管和EP管、过滤器、光学显微镜、测量计、过滤器 试剂配制: 1( BSA培养液: 储存液:称取1g BSA溶于10ml RPMI-1640,混匀后过滤,4?保存 工作液:一瓶RPMI-1640加入2mlBSA储存液和一支PS,即浓度为0.2%,4?保存 2( 软脂酸储存液:称取13.92mg软脂酸(分子量278.41)溶于1ml甲醇,即浓度为 0.05mmol/ml,37?水浴助溶,分为5份分装于EP管,-20?保存 3( TNF-a储存液:称取10ngTNF-a溶解于1mlPBS,及浓度为10ng/ml,分为10份分装于 EP管,-20?保存 步骤: 1( 低倍显微镜观察六孔板里细胞状态,保证无污染,无杂质,汇合度为70%-80%的细胞才 可以进行下一步实验。 2( 六孔板里的细胞加入1mlPBS清洗,每孔加入1ml 0.2% BSA的RPMI-1640,继续无血清 培养24hrs。 3( 不同浓度软脂酸处理细胞24hrs。(每组三个复孔) (1) 对照组:用1mlPBS清洗后, 每孔1ml BSA继续培养。 (2) 0.02mmol/L palmitate: 1.2ul 软脂酸储存液+2998.8ul BSA,每孔1ml。 (3) 0.04mmol/L palmitate: 2.4ul 软脂酸储存液+2997.6ul BSA,每孔1ml。 (4) 0.08mmol/L palmitate: 4.8ul 软脂酸储存液+2995.2ul BSA,每孔1ml。 (5) 0.16mmol/L palmitate: 9.6ul 软脂酸储存液+2990.4ul BSA,每孔1ml。 (6) 0.32mmol/L palmitate: 19.2ul 软脂酸储存液+2980.8ul BSA,每孔1ml。 4( 不同浓度TNF-a处理细胞24hrs。(每组三个复孔) (7) 对照组: 每孔1ml BSA继续培养。 (8) 5ng/ml TNF-a: 1.5ul TNF-a储存液+2998.5ul BSA,每孔1ml。 (9) 10ng/ml TNF-a: 3ul TNF-a储存液+2997ul BSA,每孔1ml。 (10) 20ng/ml TNF-a: 6ul TNF-a储存液+2994ul BSA,每孔1ml。 (11) 40ng/ml TNF-a: 12ul TNF-a储存液+2988ul BSA,每孔1ml。 Trizol法提取细胞总RNA流程 材料: 1. RNAiso Reagent: 购于Taraka(货号:D312),100ml 2. 氯仿、异丙醇、无水乙醇:国产分析纯 3. 0.1%DEPC-HO、PBS、75%乙醇 2 4. DEPC处理的EP管、滴头、50ml离心管,5ml注射器、计算器、低温离心机、冰盒 材料的去RNA酶化: 1( 0.1%DEPC水 配好的DEPC水过夜灭活,高压蒸汽灭菌, 2( EP管、滴头、离心管用0.1%DEPC水浸泡过夜,高压蒸汽灭菌, 3( 75%乙醇:75ml无水乙醇+25ml 0.1%DEPC水。 4( 新购买的异丙醇分装于DEPC处理的50ml离心管,4?保存 步骤: 1. 吸出培养基,PBS清洗一次; 2. 向100ml培养瓶(6孔板中2孔)加入1ml RNAiso Reagent,水平放置片刻,使裂解液 均匀分布于细胞 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面并裂解细胞,然后使用移液枪吹打细胞使其脱落(约30次);将裂 解液转移至1.5ml EP管,移液器反复吹打(推荐用5ml注射器抽打10次); 3. 室温静置5min后加入氯仿200ul(RNAiso Reagent:氯仿,1ml:200ul),用力震荡后, 室温静置5min,待分层后离心,12000g,4?,15min; 4. 取80,无色上清液至另一干净1.5ml EP管(切忌吸出白色中间层),加入400ul异丙醇 (异丙醇应与上清体积比为1:1),充分混匀后,静置10min; 5. 12000g,4?,离心10min,此时管底可见沉淀; 6. 小心弃上清液,缓慢沿管壁加入75,乙醇1ml,轻轻上下颠倒使沉淀飘起,12000g, 4?,离心5min,小心弃乙醇,可离心数秒后将残液吸走; 7. 室温静置2-5min,干燥RNA; 8. 加入DEPC-HO 30或40ul溶解RNA,-80?保存。 2 RNA浓度的标化: 吸取4ul RNA+196ul DEPC水稀释50倍在分光光度计上测算样品的浓度,记好A260、Con(ug/ml)和A260/A280,原始浓度为测量浓度*50(A260和Con换算为Con:A260=40, A260/A280为1.6-2.0,线性范围最好),标化的方法是以最低浓度的一个样品为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 进行标化,标化10ulRNA,计算各个样品加DEPC水量,做RT时RNA加样量为X(0.5ug/原始浓度*1000)ul。 RT-PCR 材料:逆转录试剂盒(TAKARA DRR047A)、PCR试剂盒(TAKARA DRR081A) PCR水(灭菌蒸馏水)、去RNA酶的200ul离心管、PCR 8连管、计时器、水浴箱 逆转录反应体系为20ul (1) 基因组DNA的除去反应。 5*g DNA Eraser Buffer 2ul g DNA Eraser 1ul RNase Free dH2O (10-2-1-X)ul Total RNA Xul 42? 2min 水浴,4?保存 (2) 反转录反应。 5*PrimeScript Buffer2 4ul PrimerScript RT Enzyme MIX 1 1ul RT Primer MIX 4 1ul RNase Free d H2O 4ul 37? 15min??85? 5sec (PCR仪反应,约16min,迅速转入,20?保存) PCR反应体系为25ul SYBR Premix EX Taq ? 12.5ul 上游引物 0.25ul 下游引物 0.25ul PCR水 10ul c DNA 2ul *无论做RT还是PCR应先将按样品数计算每种试剂加入量,配在一管里面混匀后加入每个反应管里面,再加各个管的RNA或c DNA,为了保证每管加量完全,可以多配1-2样品的试剂量,混匀加入每管。 *考虑到做PCR时检测具体基因数不同,反应体系可以以倍数的改变,如P两个基因,RT时可以做6ul体系,即每个试剂加入量均*0.3,混匀后加入每管。 *加入RT后cDNA2ul,注意加样量一致,改好盖子,在盖子一端的边缘做好标记,弹去反应液里面的空气,离心。
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