【doc】美味牛肝菌深层发酵条件的优化及成分分析

【doc】美味牛肝菌深层发酵条件的优化及成分分析 美味牛肝菌深层发酵条件的优化及成分分 析 第23卷第6期 2004年11月 无锡轻工大学 JournalofWuxiUniversityofLightIndustry Vo1.23No.6 NOV.2004 文章编号:1009—038X(2004)06—0096—04 美味牛肝菌深层发酵条件的优化及成分分析 邓百万,陈文强 (陕西理工学院陕西省资源生物重点实验室,陕西汉中723001) 摘要:对美味牛肝菌(Boletusedulis)深层发酵条件及菌丝体主要营养成分进行了分析研究,结 果表明,最适培养基配方为:葡萄糖30.0g,玉米粉20.0g,酵母膏7.0g,KHPO2.0g, MgS04?7HzO1-0g,VBl0.01mg,CaCO2.0g;最优发酵条件的初始pH值5.2,5.8,振荡 速度180r/min,培养温度27?,100mL三角瓶装液量60mL_并对美味牛肝菌深层培养菌丝体中 蛋白质成分,灰分,脂肪,粗纤维,矿物质及多糖等进行了测定和分析. 关键词:美味牛肝菌;深层发酵;优化;成分分析 中图分类号:TQ920.6文献标识码:A StudyonSubmergedFermentationandAnalysisof MainComponentsofBoletusedulis DENGBai—wan,CHENWen—qiang (ShaanxiKeyLab0rat0ryofBio-res0urs,ShaanxiUniVersityofTechnology,Hanzhong723 001?China) Abstract:Thispaperexp1oresthesuitablefermentationconditionsaffectingthemyceliagrowthof B01Pt"Pd"Zs.ExperimentalresultsindicatedthattheoptimumcompositionOtthefermentation mediumisasfollowing:glueose30.0g,Cornmeal20.0g,yeastextract7.0g,KHzPO42.0g, MgSO4?7H2O1.0g,VBl0.01mgandCaCO32.0g.Thehighestyieldofmyceliawasobtained undertheconditionswhentheshakerrotationspeed,PH,temperatureandmediumloading amountwarecontrolledat180r/min,5.2,5.8,27?,and60mL/100mL,respectively. Keywords:Boletusedulis;submergedfermentation;optimum;componentsanalysis 美味牛肝菌(BoletusedulisBul1.exFr.)俗称 大脚菇,属层菌纲,伞菌目,牛肝菌科,牛肝菌属,分 布于四川,云南,福建,陕西等地.其菌肉厚而细软, 味道鲜美,营养丰富,是人们最喜欢的野生食用菌 之一Ll.].长期食用能增强机体免疫能力,具抗肿 瘤,抗突变,降血脂,抗病毒等作用.该菌提取物对 小白鼠肉瘤180的抑制率为100,对艾氏腹水癌 的抑制率为90[3'.该菌还产生腺嘌呤,胆碱和腐 胺等生物碱,可药用,是"舒筋丸"的成分之一,可治 疗腰腿疼痛,手足麻木,筋骨不舒,四肢抽搐,是一 种食药兼用的山珍品[5].由于美味牛肝菌是菌根 菌,目前不能人工栽培,野生资源不能满足人们的需 要,液体发酵获得营养菌丝取代子实体是解决这一问 题的有效办法.为此,对美味牛肝菌深层发酵条件进 行了优化研究,对菌丝体主要营养成分及质量进行了 分析测定,为开发利用真菌资源提供参考依据. 收稿日期:2004—02—12;修回日期:2004—03—25. 基金项目:陕西省教育厅专项科研基金项目(99JK109)资助课题. 作者简介:邓百万(1963一).男,陕西眉县人,副教授. 第6期邓百万等:美味牛肝茵深层发酵条件的优化及成分分析97 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验材料美味牛肝菌子实体采自陕西省 佛坪县三官庙乡. 1.1.2菌种美味牛肝菌由陕西省资源生物重点 实验室食药用菌菌种保藏中心提供. 1.1.3培养基 1)母种培养基:葡萄糖20.0g,马铃薯200.0 g,麸皮100.0g,KH2PO5.0g,MgSO?7H2O 3.0g,VBl10mg,琼脂20.0g,水1000mE[引. 2)单因子基础培养基:碳源基础培养基:酵母 粉5.0g,KH2PO43.0g,MgSO4?7H2O1.5mg, VBl0.01mg,CaCO.2.0g;氮源基础培养基:葡 萄糖20.0g,玉米粉20.0g,KH2PO3.0g, MgSO4?7H2O1.5mg,VBl0.01mg,CaCO3 2.0g. 1.2方法 1.2.1美味牛肝茵茵丝体液体培养 1)菌种活化:配制CPDA培养基,分装试管, 121.3?30min灭菌,放置斜面,接种美味牛肝菌 母种,在28?培养,待菌丝满管后备用. 2)液体培养:配制液体培养基,100mL三角瓶 装液量60mL,121.3?30min灭菌,接活化菌种. 在初始pH值4.6,5.8,振荡速度180r/min,培养 温度26?条件下,进行液体发酵培养. 3)菌丝生物量的测重:发酵后的菌丝体经离心 过滤并用纯净水冲洗3次,再用滤纸吸至不滴水, 用天平精确称重. 4)成分测定的材料处理:菌丝冲洗干净一烘干 (80?)一粉碎一过40目筛一备用. 1.2.2成分测定 1)灰分测定:采用重量法. 2)粗蛋白含量测定:采用微量凯氏定氮法. 3)粗脂肪含量测定:采用索氏提取法]. 4)粗纤维含量测定:采用重量法. 5)多糖含量测定:采用苯酚一硫酸法]. 6)氨基酸含量测定:采用FDBN柱前衍生高 效液相色谱法(HPLC-1100型).层析柱:Zorbax C18;流动相:磷酸二氢钾和乙腈水溶液Ev(水):V (乙腈)=45:553. 2结果 2.1发酵培养基的筛选 2.1.1碳源对美味牛肝茵营养茵丝生长的影响 以酵母粉5.0g,KH2PO3.0g,MgSO?7H2O 1.50mg,VBl0.01mg,CaCO32.0g为单因子基础 培养基,分别以2O.0g的葡萄糖,蔗糖,乳糖,甘露 醇,果糖,麦芽糖并附加玉米粉2O.0g为碳源,以基 础培养基为对照,接活化菌种1.0cm2,振荡培养, 测定不同碳源对营养菌丝生长的影响(见表1). 表1不同碳源对营养菌丝生长的影响 Tab.1Effectofdifferentcarbon$ourc~onthegrowthof nutrientmycelia 碳源菌丝生物量/(g/L) 葡萄糖 蔗糖 乳糖 甘露醇 麦芽糖 果糖 12O 96 8O 75 112 1O7 表1表明,以葡萄糖,麦芽糖,果糖等作为碳源 时,液体发酵菌丝生物量皆高.在这些碳源中,以葡 萄糖为碳源的培养基中菌丝体生物量最高,为120 g/L,菌丝球体积小,均匀,密度高.以乳糖,甘露醇 等为碳源的培养基中美味牛肝菌菌丝生长较差,说 明这些碳源为非常用糖物质.确定葡萄糖为美味牛 肝菌发酵最适碳源. 2.1.2氮源对美味牛肝茵营养茵丝生长的影响 以葡萄糖2O.0g,玉米粉2O.0g,KH2PO3.0g, MgSO4?7H2O1.5mg,VBl0.01mg,CaCO32.0g 为单因子基础培养基,分别以5.0g的NHNO., KNO,米糠,豆饼粉,酵母浸出膏,牛肉膏,蛋白胨 和水解乳蛋白为氮源,以基础培养基为对照,接活 化菌种1.0cm.,振荡培养,测定不同氮源对营养菌 丝生长的影响,结果见表2. 表2不同氮源对营养菌丝生长的影响 Tab.2Effectofdifferentnitrogen$ourc~onthegrowthof nutrientmycelia 氮源菌丝生物量/(g/L) 酵母浸出膏 牛肉膏 蛋白胨 水解乳蛋白 豆饼粉 米糠 NH4N03 KN03 m们 98无锡轻工大学第23卷 表2表明,在附加不同氮源培养基中,有机氮 源比无机氮源更有利于菌丝生长,以酵母浸出膏为 氮源的培养基中菌丝生物量最高,为140g/L,菌丝 球体积大小适中,均匀.在以米糠,豆饼粉,NH N03,KNO为氮源的培养基中菌丝生长较差,虽然 米糠,豆饼粉为有机氮源,但含氮量要低于其它有 机氮源,说明培养基中含氮量较低的有机氮源不是 美味牛肝菌菌丝生长的最适氮源.因此,确定酵母 浸出膏为美味牛肝菌发酵最适氮源. 2.1.3培养基成分综合实验以葡萄糖和玉米粉 为碳源,酵母浸出膏为氮源,添加KH.PO, MgSO4?7H2O和VBl0.01mg,CaCO32.0g进行 (3)正交试验.根据极差分析结果,影响菌丝体 得率的大小关系分别为A>C>D>B.各因子的最 佳水平组合是A3B3C2D1,因此确定发酵培养基配 方为:葡萄糖3O.0g,玉米粉2O.0g,酵母浸出膏 7.0g,KH2PO42.0g,MgSO4?7H2O1.0g,VBl 0.01mg,CaC032.0g. 2.2发酵条件实验 2.2.1pH值对美味牛肝茵营养茵丝生长的影响 将培养液分别调pH值为4.6,4.8,5.0,5.2, 5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,接斜面菌种1.0cm.,在 26?,200r/min,100mL三角瓶装液量6OmL,振 荡培养6d.测定pH值对美味牛肝菌营养菌丝生长 的影响(见图1). 棚 S 划 l 韫 l23456789 pH 圈1pH值对美味牛肝菌丝生长的影响 Fig.1pHeffectonthegrowthofBoletusedulismyeelia 图1表明,在pH值<4.6,pH>5.8时,菌丝 生物量呈下降趋势.在pH值为5.2,5.8之间,菌 丝体生长速度维持在较高水平,菌丝生物量较高. 因此,美味牛肝菌液体发酵最适pH值范围为pH 值5.2,5.8. 2.2.2振荡速度对美味牛肝茵营养菌丝生长的影 响选择9O,1l0,130,150,17O,19O,210r/min不 同振荡速度,接斜面菌种1.0cm.,在26?,pH值 5.4,100mL三角瓶装液量6OmL,振荡培养6d.测 定振荡速度对美味牛肝菌营养菌丝生长的影响(见 图2).图2表明,不同振荡速度对美味牛肝菌丝生 物量有明显的影响.随着转速的升高,菌丝生物量 升高,在180r/min达到较高,继续增加振荡速度, 菌丝生物量增加不明显.因此,美味牛肝菌液体发 酵最适振荡速度为180r/min. 嘲1 l {疆 图2振荡速度对美味牛肝菌丝生长的影响 Fig.2ThestirredspeedeffectonthegrowthofBoletus edulismycelia 2.2.3培养温度对美味牛肝茵营养茵丝生长的影 响选择16,18,2O,22,24,26,28,3O,32?发酵温 度,接斜面菌种1.0cm.,在pH值5.4,180r/min, 100mL三角瓶装液量6OmL,振荡培养6d;测定培 养温度对美味牛肝菌营养菌丝生长的影响(见 图3). 嘲1 划 l {疆 图3培养温度对美味牛肝菌丝生长的影响 Fig.3Thetemperatureoffermentationeffectonthe growthofBoletusedulismycelia 图3表明,不同温度对菌丝生物量有明显的影 响.菌丝生物量在一定范围内随温度的升高而增 高,28?时菌丝生物量达最高,为102.8g/L,超过 28?菌丝生物量则下降.因此,美味牛肝菌液体发 酵最适培养温度为28?. 2.2.4装液量对美味牛肝菌营养茵丝生长的影响 100mL三角瓶中分别选择3O,4O,5O,6O,7O,8O, 9OmL装液量,接斜面菌种1.0cm.,在pH值5.4, 180r/min,28?条件下,振荡培养6d,测定装液量 对美味牛肝菌营养菌丝生长的影响(见图4). 图4表明,随着装液量的增加菌丝生物量随之 增加,装液量在6OmL以上时,菌丝发酵产生难闻 的气体;低于6OmL时,菌丝生物量较低.因此,美 味牛肝菌液体发酵最适装液量为6OmL. 第6期邓百万等:美味牛肝茵深层发酵条件的优化及成分分析99 删 刊 1 璃 图4装液量对美昧牛肝茵营养茵丝生长的影响 Fig.4ThemediumloadingeffectonthegrowthofBo— letusedulismycelia 2.3美昧牛肝菌菌丝体主要营养成分测定分析 2.3.1美味牛肝茵茵丝体主要营养成分表3结 果表明,菌丝体含有丰富的蛋白质,多糖和适量的 脂肪,纤维和灰分.菌丝体中的粗蛋白和粗脂肪质 量高于野生子实体.特别是粗多糖质量显着高于 担子菌纲8种真菌中的粗多糖L1. 表3美昧牛肝茵茵丝中主要营养成分及质量 Tab.3Themineralelementsandcontentsofnutrientmycelia 0fBoletusedulis 营养成分质量分数/% 灰分 粗蛋白 粗脂肪 粗纤维 粗多糖 碳水化合物 5.26 26.46 6.48 8.23 1O.62 42.95 2.3.2美味牛肝茵茵丝体中氨基酸种类及质量 表4结果表明,美味牛肝菌菌丝体因方法所限未检 出色氨酸,在所测定的17种氨基酸中,必需氨基酸 和非必需氨基酸种类齐全.1O0g美味牛肝菌丝体 中必需氨基酸质量是5732.25mg,必需氨基酸占 氨基酸总量的37.08.美味牛肝菌丝体中必需氨 基酸的质量普遍高于子实体中必需氨基酸的 质量n]. 3结论 美味牛肝菌对供试碳源都有不同程度的利用, 说明该菌对单糖,双糖,多糖和糖醇都能利用,但以 葡萄糖的利用率较高.美味牛肝菌的菌丝体对铵态 表4100g美昧牛肝茵丝体氨基酸种类及质量 Tab.4Thetypesandcontentsofaminoacidinmyceliaof Boletusedulis 氮很难利用,而对有机氮的利用率高,其中以使用 酵母浸出膏和牛肉膏等时其菌丝生长速度较快.尤 其是酵母浸出膏,可促进菌丝大量生长,且菌丝球 均匀,密度高.培养基中加入CaCO对培养基pH值 起调节作用,Ca对菌丝生物量的转化有促进作 用.无机盐KH2PO和MgSO?7H2O,质量比以 2:1的比例添加时其菌丝生物量较高. 正交试验的最适培养基是:葡萄糖30.0g,玉 米粉2O.0g,酵母浸出膏7.0g,KH2PO2.0g, MgSO4?7H2O1.0g,VB10.01mg,CaCO32.0g. 美味牛肝菌深层培养的最适发酵条件的初始 pH值5.2,5.8,振荡速度180r/min,培养温度28 ?,100mL三角瓶装液量60mL. 美味牛肝菌深层培养的菌丝体主要营养成分 质量普遍高于野生子实体[1,其中粗蛋白,粗脂肪 和粗多糖质量明显高于子实体.从对食品高蛋白含 量要求的角度分析,美味牛肝菌菌丝体的营养价值 优于子实体.按干重计,菌丝体含有17种氨基酸, 100g美味牛肝菌丝体中氨基酸总量是15458.17 mg,必需氨基酸占氨基酸总量的37.O87/6,以缬氨 酸质量最高.美味牛肝菌深层培养的菌丝体富含氨 基酸这一特性证实,可通过深层发酵解决美味牛肝 菌野生资源不足的矛盾来满足人们对蛋白食品和 营养保健品日益增长的需求. (下转第102页) 1O2无锡轻工大学第23卷 2.3渗透稳定剂的影响 分别用0.6mol/L的蔗糖甘露醇,山梨醇和 NaCI来配制高渗缓冲液和高渗再生培养基,以研究 不同的渗透稳定剂对原生质体形成和再生的影响. 原始菌液为7.0×10CFU,缓冲液pH值为5.8, 工具酶为Celluclast1.5L,结果见表3. 表3渗透稳定剂的影响 Tab.3Effectofosmoticstabilizers 从表3可见,本实验结果与其他研究者报道的 结果"在真菌原生质体形成和再生中有机稳定剂的 效果好于无机稳定剂,有机稳定剂中蔗糖的效果最 好,甘露醇的效果次之"是一致的. 2.4pH值的影响 为研究不同的PH值对酵母菌原生质体形成和 再生的影响,作者用0.6mol/L的蔗糖配制高渗缓 冲液和高渗再生培养基,研究缓冲液pH值分别为 5.8,6.8,7.2时酵母菌原生质体的产生率和再生 率,原始菌液为5.6×10CFU.工具酶用Celluclast 1.5L,酶处理时间为1h,结果见表4. 参考文献: 表4pH值的影响 Tab.4EffectofpH 以Celluclast1.5L为工具酶时,在酸性条件 下,原生质体的产生率和形成率均比较高,其中pH 5.8和pH6.8原生质体产生率几乎无差异,但是原 生质体的再生率还是有一定差异的,pH值为5.8 时的再生率明显高于pH值为6.8时的再生率.在 pH值超过7.0后,无论是原生质体的产生率还是 原生质体的再生率均大幅度降低,这种情况与酵母 菌喜好在偏酸性的环境中生长是一致的. 3结论 纤维素酶Celluclast1.5L可以作为酵母菌原 生质体的形成和再生中使用的工具酶,最佳条件 是:以pH5.8的磷酸缓冲液配制的0.6mol/L蔗 糖液为高渗稳定剂,质量分数8%的酶液处理lh, 菌龄6h,酶处理后在加0.6mol/L蔗糖的完全培 养基上再生24h.在这样的条件下,原生质体产生 率与再生率与用蜗牛酶做工具酶类似. r1]LinLF,LevinRE.RelativeeffectivenessofyeastcellwalldigestingenzymesonYarrrowia lipolytica[J].Microbios, 1990,63(255):109—115. 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