REM睡眠剥夺及恢复睡眠后大鼠海马BDNF及TrkB的表达

REM睡眠剥夺及恢复睡眠后大鼠海马BDNF及TrkB的表达 REM 12 叶晨静 赵忠新 [摘要] 研究不同时间的持续快速眼动睡眠剥夺（RSD）及恢复睡眠（RS）对大鼠海马脑源性神经营养因子（BDNF）及特异性受体TrkB表达的影响。 将所有大鼠分为空白对照组、环境对照组、RSD1d组、RSD3d组、RSD5d组、RSD7d组、RSD7d后RS6h、RS12h组。用改良多平台法建立REM睡眠剥夺模型，用实时定量聚合酶链反应（Realtime -PCR）和免疫组化 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 正常睡眠、不同剥夺睡眠时间、恢复睡眠时间大鼠海马区 BDNF及其受体TrkB 的mRNA及蛋白水平。 RSD1d组海马的BDNF和TrkB mRNA 增多（p<0.05），RSD3d组表达达到高峰， RSD5d组BDNF表达下降，RSD7d组降至基线水平，恢复睡眠组、环境对照组和空白对照组相比差异不显著；蛋白变化显示相同的趋势。 相对较短时间的睡眠剥夺后BDNF及TrkB的表达增加反映了机体的某种代偿保护机 制，然而随着睡眠剥夺时间的延长，这种代偿机制也被打破了。 ：睡眠剥夺；脑源性神经营养因子；酪氨酸激酶受体B Expressions of BDNF and TrkB in the rat hippocampus after sleep deprivation and sleep recovery [Abstract] Objective: To investigate the effects of various degrees of sleep deprivation and sleep recovery on expressions of BDNF and TrkB in the rat hippocampus. Methods: All the male SD rats were divided into 8 groups: control group (normal sleep group and circumstance control group), REM sleep deprivation (RSD) 1d (group 3), RSD 3d (group 4), RSD 5d (group 5), RSD 7d (group 6), recover sleep 6h after RSD (RS) 7d (group 7), recover sleep 12h after RSD 7d (group 8). The modified multiple platform method (MMPM) was used to establish sleep deprivation model. Hippocampal BDNF, TrkB mRNA level was detected by real time PCR. Their protein levels were detected and located by immunohistochemistry. Results: BDNF and TrkB mRNA were significantly increased in RSD 1d, 3d groups compared with the control groups. There were no statistically significant differences 1．叶晨静 现单位：上海第二医科大学附属瑞金医院 2．赵忠新 第二军医大学附属长征医院神经内科主任医师、博士生导师 1 between the control group and RS groups (P>0.05). The levels of proteins displayed the same tendency. Conclusion: Short-time sleep deprivation increased expressions of BDNF and TrkB in the rat hippocampal tissue, which reflected the defence mechanism of body .Which with prolonging of RSD time, the compensation became invalid. Key words: sleep deprivation; BDNF；TrkB 随着社会上各种压力的增大，越来越多的人陷入失眠的困扰之中。而慢性的 睡眠限制可以对人的认知功能造成严重危害，并不象通常认为的：人会逐渐适应， 不产生任何后果。睡眠剥夺导致认知障碍的机制目前还不十分清楚。我们通过建 立REM期睡眠剥夺（RSD）模型，检测睡眠剥夺及恢复睡眠对BDNF表达变化，探讨REM期睡眠剥夺引起认知功能障碍的机制。 1．实验动物和分组：选取健康雄性SD大鼠，体重200-250g。实验前将各组大鼠放在平台上适应一周，每天适应1天。并在实验前对大鼠进行认知功能测 定，选择出活跃、对电击反应敏感、逃避反应迅速的大鼠，淘汰反应过于迟钝或 特别敏感的大鼠。随机分为RT-PCR和免疫组化两个大组。每个大组都分为空白 对照组（正常睡眠）、环境对照组、RSD1天、RSD3天、RSD5天、RSD7天、RS6h 、RS12h组等8个小组，每小组6只大鼠。 2．大鼠的睡眠剥夺：用改良多平台剥夺大鼠的睡眠，剥夺期间给予大鼠正 常进食和饮水。实验大鼠在人工光照下饲养7天后作睡眠剥夺，每天光照时间 12h（8：00~20：00）。在睡眠剥夺相应的时间后处死大鼠。 3．动物断头取脑，取出海马组织，液氮冷冻，在置于-80?的深低温保存，用于RT-PCR法检测BDNF的mRNA水平。 4．总RNA的提取：采用Trizol法抽提总RNA。取海马组织5mg，加入100µl的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆。匀浆后于15到30?C孵育5分钟，再加入20 µl的氯仿，盖紧管盖，手动剧烈振荡管体15秒后，15到30?C孵育3分钟，4?C下12,000 ×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿 相，中间层核上层的无色的水相，将水相转移到新离心管中，加50µl的异丙醇， 2 混匀后15到30?C孵育10分钟后，于4?C 12,000 ×g离心10分钟，移去上清液， 加入至少100µl的75%乙醇，振荡后，4?C 7,500 ×g离心5分钟，去除乙醇溶液， 空气中干燥RNA沉淀5 - 10分钟，加入无RNA酶的水溶解RNA，然后55到60?C孵育10分钟，保存于- 70?C。RNA在紫外线分光光度仪下检测吸光光度值 A260和A280以计算提取的RNA浓度，判断纯度。 5．BDNF、TrkB和β-actin引物：根据基因库核苷酸序列资料，由Primer Premier 5.0软件 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 了下列引物，由上海康成生物工程公司合成。BDNF上游引物：5'-TTAGCGAGTGGGTCACAGCG- 3'；下游引物：5'-ATTGGGTAGTTCGGCATTGC- 3'，扩增产物长度为207bp。TrkB上游引物：5'-GGTTCTACAACGGAGCCATAC -3'；下游引物5'-TCTTCATAGAGGACTTCAGGGTA -3'，扩增产物长度为247bp。以β-actin作为内标，上游引物：5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'；下游引物：5’ –ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’，扩增产物长度为211bp。 6．cDNA合成：取RNA5 µg加入3.5 µM oligo（dT）引物1µl，再加入无RNA酶的HO至总体积10 µl，混合液在混合液在70?水浴3分钟,降到37?放2 置10分钟；配制RT反应液，5 × RT缓冲液4 µl、2.5 mM dNTP混合液4 µl、RNA酶抑制剂1 µl、MMLV反转录酶1 µl，混合后37?恒温1分钟；加10 µl的RT反应液到10 µl退火混合物中，37?水浴60分钟，加热到95?维持5 min。得RT终溶液即为cDNA溶液，置冰浴待用。 7．实时定量PCR（Realtime PCR）：取10 × PCR缓冲液2.5µl，加入MgCl2 溶液3 µl，dNTP混合液3 µl，Taq聚合酶3 unit，Sybergreen终浓度6.25µl，加入BDNF特异性引物1µl，cDNA1 µl，加水至总体积为25µl，轻弹管底将溶液混 合，5000 rpm短暂离心，然后将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪（Rotor-Gene 3000 Realtime PCR 仪 Corbett Research公司）上进行PCR反应，得出实时定量测定值。PCR反应条件：94?预变性1分钟，94?变性40S，57?退火1分钟，72?延伸1分钟，35个PCR循环，反应终末72ºC延伸5分钟。 8．PCR产物与100 bp DNA Ladder（marker）在2%琼脂糖凝胶电泳，溴 化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 9．每小组6只大鼠麻醉后，经4%多聚甲醛灌注2小时，断头取脑，后固 定48小时。脱水透明，浸蜡，包埋，切片，片厚4µm。免疫组化：SP法，羊 3 抗鼠（Santa Cruz，C-19）。常规脱蜡至水，PBS洗3 min×3次，加0.3%HO 2220 min，PBS洗3 min×3次，98? 20 min 进行抗原修复，室温冷却，PBS洗3 min×3次，加一抗syt?(1:50）羊抗鼠，4?过夜。PBS冼3 min×3次，加b-兔抗羊(1:200) 37? 30 min，PBS洗3 min×3次，加streptavidin-HRP(1:200) 37? 30 min，PBS洗3 min×3次。0.04%二氨基联苯胺镍法(DAB)+0.03%过氧化氢(HO)显色8～12 min，水洗。苏木精衬染 1 22 min，水洗。常规树脂封片，观察。 10．统计学方法：所有结果均用SAS统计软件进行完全随机方差 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 和最 小显著差法比较。显著性水准为0.05。 1．BDNF mRNA 水平测定：环境对照组和空白对照组之间相比无明显差异。 在REM期睡眠剥夺（RSD）1d组海马的BDNF mRNA 增多（p<0.05），RSD3d组表达达到高峰（p<0.01）， RSD5d组BDNF表达下降，RSD7d组降至基线水平；恢复6h小时组和恢复12小时组表达有所上升，但与对照组相较未见明显差 异。 TrkB mRNA水平测定：环境对照组和空白对照组之间相比无明显差异。在 REM期睡眠剥夺1d、3d、5d组表达增多， REM睡眠剥夺7d组降至基线水平，在恢复6h及12h的睡眠组与对照组相比无明显差异。在不同时段的REM期BDNF及TrkB mRNA水平数据处理具体见表1，BDNF 及TrkB PCR电泳凝胶图见图1。 4 表1 不同时段的睡眠剥夺及恢复睡眠后BDNF、TrkB实时定量测量值 分组 只数 BDNF（×10-4） TrkB（×10-2） CC 6 4.91?0.19 1.14?0.17 TC 6 4.88?0.11 1.05?0.11 ??SD1d 6 6.88?0.14 2.84?0.52 ????SD3d 6 7.32?0.53 3.31?0.51 SD5d 6 5.22?0.20 1.24?0.19 SD7d 6 4.99?0.24 0.92?0.09 RS6h 6 5.26?0.64 1.16?0.16 RS12h 6 4.94?0.53 1.21?0.19 ???注：与对照组比较p<0.05，与对照组比较p<0.01 图1 BDNF及TrkB PCR凝胶电泳图 5 2．免疫组织化学染色：BDNF及TrkB免疫反应阳性产物为胞浆内褐色沉淀 物,海马各区均有分布。BDNF空白对照组和环境对照组之间相比无明显差异， 在RSD1d、3d组海马BDNF表达显著增多（p<0.05）；REM睡眠剥夺5d、7d组表达与对照组相比无明显差异，具体结果见表2。TrkB在REM睡眠剥夺1d、3d后表达增多，具体结果见表3。图像见图A-D，a-d。 表3 不同时段的睡眠剥夺及恢复睡眠后海马BDNF阳性信号密度（%） ?分组 只数 CA1 CA3 齿状回 CC 6 9.83?1.17 10.00?2.00 9.67?1.51 TC 6 10.00?1.41 9.67?1.86 9.83?1.60 SD1d 6 13.50?1.52? 13.83?1.33? 13.83?1.33? SD3d 6 16.83?1.32? 16.67?2.16? 17.00?0.89? SD5d 6 11.67?2.25 12.17?2.48 12.00?2.61? SD7d 6 10.00?1.79 10.17?2.23 10.33?1.51 RS6h 6 11.67?1.51 12.00?2.37 11.83?1.60? RS12h 6 11.00?1.55 11.17?1.47 11.50?1.37 注：?与对照组比较p<0.05 表4 不同时段的睡眠剥夺及恢复睡眠后海马TrkB阳性信号密度（%） ?分组 只数 CA1 CA3 齿状回 CC 6 9.50?1.87 10.00?1.79 9.83?1.17 TC 6 9.83?1.17 9.67?1.86 9.67?1.03 SD1d 6 12.50?2.43? 12.67?2.16? 12.17?1.17? SD3d 6 13.00?2.00? 13.17?2.04? 12.83?2.04? SD5d 6 10.67?1.86 12.50?2.43? 10.17?1.47 SD7d 6 10.17?2.14 10.50?2.43 10.00?0.89 RS6h 6 10.33?1.63 12.17?1.72 10.33?1.63 RS12h 6 10.50?1.05 10.33?1.37 10.17?2.32 注：?与对照组比较p<0.05 6 图A 对照组海马BDNF阳性神经元（*100） 图a 对照组海马BDNF阳性神经元（*200） 图B RSD3d齿状回BDNF阳性神经元（*100） 图b RSD3d齿状回BDNF阳性神经元 （*200） 图C 对照组海马TrkB阳性神经元（*100） 图c 对照组海马TrkB阳性神经元（*200） 图D RSD3d海马TrkB阳性神经元（*100） 图d RSD3d齿状回TrkB阳性神经元（*200） 7 睡眠是机体的正常生理需要。睡眠一旦被剥夺，则会对机体产生相应的生理 和心理影响。睡眠会增强大鼠的学习能力，对于学习复杂事物的巩固化也是非常 必要的。研究发现，在整个睡眠阶段中，REM睡眠对学习和记忆的影响更大。 我们认为睡眠与记忆关系十分密切，睡眠障碍可以引起记忆功能的损害，而严重 睡眠剥夺引起的记忆损害在恢复睡眠之后是可以改善的，但是能否完全恢复还有 待进一步的研究。 随着分子生物学、神经影响学和神经病理学的迅猛发展，睡眠剥夺得临床和 基础研究得到了深入研究。睡眠剥夺引起的中枢神经系统广泛病理生理变化主要 集中表现为脑细胞能量代谢异常、细胞形态结构的改变、神经元内多种基因表达 的变化和对神经可塑性的影响，后者直接表现为睡眠剥夺对学习、记忆功能的损 、[12]害。神经营养因子是指机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、分化的一 类蛋白质分子。过去一直认为神经生长因子主要在发育过程中调节神经元存活， 而对成年神经元不产生作用。近十五年来发现神经营养因子不仅在成年神经系统 存在，而且能够阻止成年神经元损伤后神经元的死亡以及调节包括突触可塑性和 神经递质传递等许多神经系统功能。脑源性神经营养因子为神经营养因子家族的 一员，是1982年Barde及其同事由猪脑提取液中获得的分子量12.3KD的碱性 蛋白质，由119个氨基酸组成，主要在海马、皮质、下丘脑、脑干和小脑中表达。 BDNF被认为参与调节活动依赖的可塑性，它的表达严格受神经元活动调节（不 论在mRNA还是蛋白水平），对突触的传递和神经元信号的转导可产生确切的作 用，能够改变树突形态。BDNF介导突起生长，改变神经系统递质表型，调节突触功能。BDNF对神经元的大多数效应是由酪氨酸激酶受体TrkB介导的，TrkB 由三部分组成，一个细胞外结合部位的识别区域，一个信号跨膜传递的区域和一 个含有酪氨酸激酶的胞浆尾部区域，以触发信号传递的级联反应，在海马、皮质、 基底前脑、中脑腹侧和脊髓中表达。 我们的实验发现大鼠海马的BDNF在RSD1d组表达升高，RSD3d组达到 8 高峰，RSD5d、7d组逐渐趋于基线水平，在恢复睡眠后表达有上调趋势；BDNF受体TrkB有着相同的变化趋势。相对较短时间的睡眠剥夺后BDNF及TrkB的表达增加反映了机体的某种代偿保护机制，然而随着睡眠剥夺时间的延长，这种 代偿机制也被打破了，导致认知功能损害进一步加重。Cirelli C, 和Tononi G.发现8小时完全睡眠剥夺会导致大鼠皮质的脑源性神经营养因子（BDNF）在自然觉醒和/或睡眠剥夺后mRNA水平相对于睡眠状态下表达上调。BDNF特异性酪氨酸 [3]激酶受体（TrkB），同样是在觉醒状态下上调。根据目前的实验结果可以推测 出睡眠剥夺可以影响BDNF的表达，而包括BDNF在内的可塑性相关基因表达 异常可能是引起睡眠剥夺后大鼠认知障碍的重要机制之一。BDNF调节突触功能的机制目前仍不十分清楚，但是研究发现BDNF能在突触前使囊泡蛋白相互作 [4]用，促进突触囊泡移动，调节高频率传递；Kovalchuk等人发现外源性的BDNF [5]激活突触后的BDNF特异性受体TrkB，进而激活谷氨酸NMDA受体；NMDA [6]受体活化又能诱导AMPA受体的重新分布，从细胞内插入突触后膜位点 ，由兴奋性神经递质谷氨酸所介导的生化反应引起突触效能的改变是一个关键部分， NMDA受体是突触可塑性的关键分子开关。NMDA受体和AMPA受体的早期活化对于各种记忆来说都是必须的。长时程增强电位——LTP，目前被普遍认为是学习记忆的重要物质基础，能诱导形成新的突触联系或促经原有突触连接和生 长，是突触可塑性的客观指标之一。BDNF既能作用于突触前膜产生LTP，也可 [7]与突触后膜的受体TrkB结合诱导产生LTP。BDNF基因敲除小鼠表现出海马 的长时程增强电位（LTP）受损，并可以用外源性BDNF来重建，出生后前脑 [8]TrkB基因敲除的小鼠LTP出现减少并损害了学习行为。而且，当外源性的 [7]BDNF被受体TrkB与免疫球蛋白G的融合蛋白清除后LTP可被阻断。BDNF-TrkB通路对于突触可塑性的调节是十分重要。正常小鼠的LTP会诱导BDNF、TrkB的表达，这支持神经营养素和突触机制之间的相互关联。神经营养 素从神经元中的释放可能是神经元集合活动的结果，而神经营养素反过来影响突 [8]触间的联系。 9 综上所述，短时间睡眠剥夺诱导大鼠海马区BDNFmRNA的表达增加，表 达后的产物可能通过参与调节突触可塑性，实现对突触传递和认知功能的保护作 用，长时间的睡眠剥夺后BDNF及受体TrkB mRNA表达减少。Kipianova等人 研究发现脑缺血后脑室内注射BDNF可以明显改善工作记忆和对照记忆，这说 [9]明BDNF对突触传递和认知功能产生保护效应。这就提示我们BDNF应用于 临床的可能性。但是BDNF不能通过血脑屏障，增加神经营养因子方法的应用， 是亟待解决的问题。 [1] Durmer JS, Dinges DF. 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