小鼠尾尖成纤维细胞的分离与培养

小鼠尾尖成纤维细胞的分离与培养 梅志强, 刘晓燕,谢华福, 段承刚, 李 娟, 王 丽 ( 泸州医学院医学分子生物学实验室, 四川泸州 646000) 摘 要 目的: 建立一种简单的鼠尾成纤维细胞分离、培养的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。方法: 剪取小鼠尾尖, 采用组织块培养法, 用 DMEM(含 10%), : , 胎牛血清培养基进行培养并通过传代得到纯化的成纤维细胞。结果原代培养的成纤维细胞特征典型并通过传代培养 : 采用组织块培养法成功地培养了成纤维细胞, 方法简单, 为动物细胞核移植、转基因等提供核 得到了纯化的成纤维细胞。结论 供体材料奠定了良好基础。 关键词 成纤维细胞; 小鼠尾尖; 体外培养 中图分类号 Q813.1.1 文献标识码 A 文章编号 1000- 2669( 2007) 5- 0370- 03 ISOLATION AND IN VITRO CULTURE OF MOUSE TAIL- TIP FIBROBLASTS Mei Zhiqiang , et al Laboratory of Molecular Biology, Luzhou Medical College Abstr act Obje ctive : To establish a simple method for isolation and culture of mouse tail - tip fibroblasts . : Me thods The mouse tail- tip tissue was cut into small pieces and cultured in DMEM (10% FBS) at 37? under5% CO;the cells were purified by succeeding generation - to- generation culturing . Re s ults : The cultured cells 2 showed typical shape and features of fibroblast cell ,which were successfully dissociated and purified.Conclus ion: This technique is suitable for culturing the fibroblast cells, which might be expected to provide donor nucleic for future nucleus transplant and transgenic researches. Key wor ds Fibroblasts ; Mouse tail- tip ; Culture in vitro 实验材料随着体细胞克隆技术的发展, 小鼠克隆也取得1.1 成功, 为转基因技术提供了很好的研究手段。因为小 6 周龄的昆明种封闭群小鼠由泸州医学院动物 鼠不仅生殖周期短, 繁殖率高, 而且饲养成本低, 因 2+2+科提供。Hanks 液 、D- Hanks 液、无 Ca、Mg的 PBS 此在实验动物中被广泛应用。1998 年 Wakayama 首 所用的无机盐、二甲基亚砜液 (DMSO)均为 Sigma 产 [1][2]次用卵丘细胞克隆成功后, 接着尾尖细胞, 支持细 品。DMEM (低糖)及胎牛血清( FBS) 均为 GIBCO 公 [3][4]胞, 胚胎干细胞的克隆也取得了成功。成纤维细胞 司产品, 10% 胎牛血清+100 IU/ml 青 霉 素+100 IU/ 不仅提供完整的遗传物质, 而且培养方便, 对动物的 ml 链霉素+DMEM 用于细胞培养; 0.02%EDTA +0.25 生长和繁殖都无影响。本文作者以鼠尾作为材料探 %胰蛋白酶用于消化细胞。 讨一种简单有效的体细胞体外培养方法。本试验是 1.2 鼠尾成纤维细胞组织块培养法 通过对鼠尾成纤维细胞的培养, 建立了鼠尾成纤维 75%的酒精消毒后, 无菌剪取小鼠尾约 4 cm, 然 细胞系, 为动物细胞核移植、转基因等提供核供体材 2+2+后去除皮肤, 再放入无 Ca,MgPBS 中洗 3 遍, 洗去 料。 血液和脂肪组织, 用眼科剪把鼠尾剪成 2 mm 左右 , 即可见成纤维细胞 组织小块。一周后将组织块去除 生长(在这 1 周内尽量勿动培养瓶)。此后每 2 天 换 次培养液, 天就可铺满瓶底, 进行消化传代。1 10,12 1.3 成纤维细胞的收集 当纯化的成纤维细胞在卡氏培养瓶中长成片可 传代时, 吸去旧培养液, 加入 0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA 的消化液, 覆盖所有瓶底细胞, 将培养瓶在倒 置显微镜下观察, 在 37?, 消化 5,8 分钟后, 发现成 图 1 组织块培养第 2 天的成纤维细胞 (10×) 纤维细胞变圆时, 立即加入 Hanks 液约 5ml, 用吸管 轻轻吹打, 吹打结束后, 将细胞悬液移入离心管, 1000 转/分离心 10 分钟, 弃上清液后加血清培养液, 5 吹散混匀按 的浓度接种, 以后每 天传5×10/ml 2,3 1 代。 2 冻存与复苏 , 吸干培养液, 用无 细胞长满融合为细胞单层时 2 + 2 +Ca,MgPBS 中 漂 洗 1 ,3 遍 , 0.25% 的 胰 蛋 白 酶 + 图 2 组织块培养第 6 天的成纤维细胞(10×) 0.02%EDTA 37?消化, 细胞变圆时, 加 DMEM 培养 液终止消化。细胞悬浮于含 10%二甲亚砜 (DMSO)? 20%小牛血清的的 DMEM 培养液中, 细胞密度达到 661×10,5×10/ml。分装于 2 ml 的冻存管中密封。冻存 管 置 于 4?中 15 分 钟 , - 20?中 2 小 时 , 然 后 放 在- 80?冰箱中过夜, 最后放入液氮中冻存。 复苏: 从液氮瓶中取出快速放入 37?中水浴, 融 化后加 入 10 倍 左 右 的 DMEM 培 养 液 , 离 心(1000 转 / 分)10 分钟, 去上清, 加入培养液, 最后稀释使细 6胞浓度为 , 接种在 , 饱和湿度 1×10/ml37?,5%CO 2 图 3 组织块培养第 12 天的成纤维细胞(10×) 的培养箱中, 细胞贴壁后更换培养液。 3 结果 4 讨 论 1,2 天后细胞散在生长, 呈细长梭形成多角形 : 一种是分离单细胞 动物细胞培养方法有两种(见图 1), 周围有少量上皮细胞, 胞核清晰, 除贴壁的 接种培养法, 另一种是组织块贴壁培养法。组织块培 细胞团外, 一般不形成集落。5,7 天可生长成细胞单 养法简单方便, 长出的细胞整齐且便于选择, 培养动 层( 见图 2) , 漩涡状排列或纵横交错, 贴壁的细胞团 物成纤维细胞多用此法。但用蛋白酶消化过程复杂, 呈放射状生长。这时去掉组织块, 10~14 天由组织块 时间长, 适用于消化细胞间质较少的软组织, 如胚胎 移出的单层细胞铺满瓶底( 见图 3) , 可消化传代, 进 组织、上皮组织、肝肾等软组织, 传代细胞也非常好, 行传代培养。刚消化分离下来的细胞呈亮球形。轮廓 清晰, 单个或聚集成细胞团。接种 30 分钟后即有大 2+ 2+ Ca 、Mg 消化纤维性组织和较硬的癌组织则较差, 量细胞贴壁, 其中部分已开始伸展。表现为轮廓渐模 及血清均可对其活性有抑制作用。鼠尾含有软骨, 不糊, 有小的细胞突起。换液时一般可用 PBS 轻柔冲 易剪碎, 也不易消化, 因此采用组织块培养比较简 洗 1,2 次再加 DMEM。1,2 小时后大多数贴壁细胞 单。 已伸展呈梭形。传代后 48,72 小时, 就可铺满。冻存 组织块放入培养皿后, 要吸干其周围的水分,使 复苏后, 细胞繁殖正常, 生长旺盛。 其尽快与培养皿粘在一起,培养液向上蒸发, 使细胞 1. Wakayam T, Perry AC ,zuccotti M , et al.Fullterm devel- 鼠尾应尽量均匀铺平, 否则贴壁难以牢固; 剥离皮肤 时, 尽量把血迹洗干净, 否则会有血细胞的生长; 培 opment of mice from enucleated oocytes injected with cu- 养瓶竖立时间不能过长, 时间过长,会影响组织的活 mulus cell nuclei[J].N ature,1998;394: 369 力; 在培养的最初几天, 尽量不要移动培养瓶, 以免 Wakayam T, Yanagimachi R .Cloning of male mice from 2. 液体晃动使组织块漂浮, 影响培养效果; 加入培养基 adult tail- tip cells[J].N ature Genetics ,1999;22:127 时要轻,防止冲开组织块。由于原代细胞周围都有多 3. O gura,A,Inoue,K,Og uchi N ,et al.Production of male clo- 种类型的细胞, 如上皮细胞等, 得到纯化的成纤维细 ned mice from fresh cultured and cryopreserved immature 胞犹为重要。由于成纤维细胞比上皮细胞对胰蛋白 sertoli cells[J].Biology of R eproduction ,2000;62:1579 酶更敏感性, 在消化过程中用显微镜观察, 当成纤维 4. Wakayam T ,R odriguez I,Perry A,et al.Mice cloned from 细胞变圆且即将离壁时, 立即终止消化, 经 1,3 次传 embryonic stem cells[J].Proceedings of Academic Science 代, 可将上皮细胞去除干净, 从而得到纯化的成纤维 United States of America.1999;96:14984 细胞。成纤维细胞寿命各不相同, 如人胚成纤维细胞 5. 司徒镇强, 吴军正.细胞培养[M].西安: 世界图书出版社, 约可培养 50 代, 恒河猴皮肤成纤维细胞传代超过 1997; 98,100 40 代, 鼠成纤维细胞寿命最短, 多数生长 8 代左右。 长期反复传代, 细胞可逐渐失去二倍体性, 进入衰退 ( 2007- 04- 03 收稿) 青霉素胃肠型过敏反应 1 例 杨晓琼 ( 四川职业技术学院卫生科, 四川遂宁 629000) 均可发生过敏反应。青霉素引起 剂型和剂量, 任何给药途径, 青霉素引起胃肠型过敏反应, 临床上很少见, 现报道 1 例 过敏反应一般属速发型, 即在作皮试或用药后数分钟或十几 并 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 如下。 : 青霉素过敏反应和其它药物 分钟就会发作。其发病机理为王某, 男, 17 岁, 学生, 因“上呼吸道感染”去市人民医院 过敏反应相似, 都是药物半抗原进入人体后与体内组织蛋白 诊治, 于门诊留诊室静脉滴注青霉素。大约 20 分钟后, 王某自 结合成全抗原, 刺激人体产生免疫反应, 导致细胞破裂, 释放 感腹部不适, 恶心、伴心慌、出冷 汗 , 随 后 腹 部 不 适 加 重 而 转 组织胺、缓激肽、5- 羟色胺等血管活性物质。这些物质作用于 , 面色苍白, 表情痛苦, 检查 为腹痛。急唤医护人员前来检查效应器官, 使平滑肌痉挛、微血管扩张、毛细血管通透性增高、 发现血压偏低(11.5/ 7.33kPa), 听诊肠鸣亢进, 考虑为青霉素胃 腺体分泌增多。由于血管活性物质作用的部位不同及个体差 , 给予山莨菪碱肌 肠型过敏反应。立即停止青霉素静脉滴注 异, : ?故临床表现也是多种多样。其过敏一般表现为以喉头 , 约 5 分钟后腹痛缓解, 15 分 肉注射并按“青霉素过敏”治疗 , 胸闷、气短、紫绀等; 钟后其它症状消失, 病人转危为安。改用其它抗菌素治疗, 未 或支气管水肿、痉挛引起的呼吸道症状 , 此前还曾有过一次门诊肌注青霉 出现类似情况。王某回忆?循环系统的症状, 常见四肢冰冷, 面色苍白, 脉细快而弱, 血 素后出现腹痛, 但腹痛没有这次严重, 故未引起重视。 压下降; ?皮肤主要表现为皮疹; ?消化道主要症状为恶心、 青霉素是临床应用最广泛的抗菌素, 具有杀菌力强、毒 呕吐、腹痛。本文所述病例即为青霉素过敏引起的胃肠道平 , 易致过 性低、价格低的特点。但青霉素是人工合成的半抗原 滑肌痉挛。敏反应, 人群中有 5%,6%对青霉素过敏, 而且任何年龄, 任何 ( 2007- 05- 20 收稿)