[doc] 产毒性大肠埃希氏菌质粒特征初步分析

[doc] 产毒性大肠埃希氏菌质粒特征初步分析 产毒性大肠埃希氏菌质粒特征初步分析 !芏塑!查塑塑’儿9. thehigh—frequencyhearingloSSrateforartilleristandfflOn—artilleristwa s 28.3and24.6respectirelyafter2yearsserviceand,vas36.2and 31.3%after3yearsservice.Theincreasedrateofhearinglossfromfirst yeart.secondyearforartil1eristandI10/1一artil1eristwas13.2and10.1 respectieelyandwas10.2%and8.3fromsecondyeart.thirdyear.The hearinglossrateOfspeechfrequencyvc-asverylowinbothartillerist andnon—artillerist.Theresu1tssuggestthatthreeyearSserviceinartil1ery atpeacetimecancauseratherseverehigh—frequencyhearingloss.butno significantspeechfrequancyhearing1OSS. KEYWORDS:hearingsurvey,hearingloss,artillery (收稿:1995-12-17) 6{一f72, 产毒性大肠埃希氏菌质粒 特征初步分析 ;7f-?/竺堡圭堂室墨:陈清陈义忠吴敏 .(第一军医大学流行病学教研室,广州,510505) /, fl摘要本文对来自全军五个军区和第一军医大学附属珠江医院及广州远郊九佛 农村检测的206株埃希氏菌阳性株进行了质粒特征的初步分析.发现质粒携带率为 90.8,携带质粒数量1,7个不等.最大质粒分子量为82.9Md,最小1.1Md,以 大分子量质粒居多且稳定.53Md和45Md质拄为优势质粒.不同地区和时期有相同 质粒的流行株存在,环境流行株和人群流行株质粒特征不同. 关键词.产毒性丈腑埃希氏菌,质桩,质桩特征 感染性腹泻是当今全球性重要公共卫生 问题之一,流行广泛,危害较为严重.而其 中产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)是国 内外公认的引起儿童和成人急性感染性腹泻 的主要病原菌,在腹泻病原谱中占1,3 位,在旅游者腹泻中占首位,1.鉴于ETEC 在感染性腹泻病中所居的重要地位,检测 其存在并弄清其种,群,类的特征,对 临床诊治和流行病学调查研究都有着重要意 义.随着分子生物学和遗传学的长足发展, 细菌分型也由粗浅的表型转入到精细的分子 指纹和基因型.质粒特征分析质粒酶切图 谱分析,限制性内切酶DNA分析等技术, 已被广泛地引入到流行病学的研究领域,并 刀其提供了新的强有力的研究工具.本文对 全军五个军医及珠江医院和广州九佛定点研 ?求自然科:姑金蟠肋项门 ? 17U? 究所检测出的206株ETEC阳性株进行了质 粒特征的初步分析. 1材料和方法 1.1ETEC菌株来源 1.1.1军区ETEC株为1992年6月, 1993年5月对广I州,沈阳,成都,北京和南 京军区1年时间的腹泻病调查中采集的大肠 杆菌样本,共661份,经生化和血清学确认 后,再分别用ETEC:_i~J,基因探针(LT, ST-h,ST-p),按本实验室常规检测方 法.进行DNA—DNA原位杂交检测,得阳 性株129株,冷冻保存. 1.1.2九佛ETEC株1990年4月~1991 年3月对广州市远郊九佛镇ETEC腹泻定点 研究中采集构标奉,共237份,ETEc阳性 检出为54株,冷冻保存. 1.1.5珠江EfEC株为收集的珠江医院儿 科病房1990年8,12月腹泻标本301份, ETEC阳性检出为36株,冷冻保存. 1.2质粒分析 1.2.1质粒提取参照文献【将实验株 接种到5mlLB培养渡中,37?振荡培养15 h.取1.5ml菌液离心弃上清,加入100td溶 液I,冰浴作用20min~然后加入200~t]溶 液I,冰浴作用10min,离心取上清,用氯 仿一异戊醇(24:1)抽提一次,加2倍体积 异丙醇一20”C作用10min,离心弃上清,抽 干,用10:1TE溶解备用. 1.2.2质粒电泳采用稳压稳流DF—C型电 泳仪和水平电泳槠,琼脂糖浓度O.8%,含溴 化乙啶0.5~g/m!,电泳缓冲渡为TBE.电 压60伏,连续电泳3h,在短波紫外灯下观 察结果并照相. 1.2.5质粒分子量计算以E.coilV517菌 为质粒分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 株,分子量分别为35.8, 4.8,3.7,3.4,2.6,2.0,1.8和1.4Md, 将标准株和实验株质粒同时电泳观察.按文 献l,5?r算待测质粒分J量. 解放军预防医学杂志 2结果 2.1质粒携带情况五个军区及珠江医院 和广I州九佛镇的206株ETEC阳性菌株质粒 图谱分析发现,206株ETEC中,187抹含有 质粒,质粒携带率为90.8(187/20s). 质粒携带株携带质粒数量1,7个不等(图 1).其中携带1个质粒的为最多,达40.6 (7s/187)2个的其次,为21.9%(41 /187)7个的最少,为1.1(2/187)(表 1).质粒分子量最大为82.9Md,最小为 1.1Md.以大分子量质粒居多且较为稳定, 分子量太于30Md的质粒携带株占72.7 (136/J87).各检测株中,以45Md和53Md 囝1糖带不同质挺的ETEC~质粒圈谱 l,5.7,8:携带不同条带质粒的ETEC菌株 7t播带最大分子量礁粒的ETEC株 8携带最小分子量质粒的ETEC株 6:V517标准株 表1187株/TEC质被携带个数分布 C C L 订 j, .!生筮查箜塑 质粒占优势,各’占24.1(45/187)和 l6.6%(31/187)其中九佛和沈阳军区以 45Md质粒为优势,珠江医院及成都军区则 以53Md质粒为优势,广卅I军区和北京军区 两种质粒均较多. 2.2质粒酶切一况187株质粒携带株ET- EC中,有26组共62株质粒带谱相同,阻2株 相同的较为多见,也有多迭7株相同的.进 一 步用EcorI作质粒酶切图谱分析,有l8组 共45株酶切图谱也相同(图2),占72.6. 圈2EeorI度植酶切图谱 h3.DNA.HladI切 2,3;酶切后质粒DNA 4.5酶切前质粒DNA 2.5人群ETEC和环境ETEC的关系为 了研究ETEC在ETEC腹泻病流行过程中的 传染源和传播途径,在九佛和广州军区同期 收集了一些环境标本.在九佛定点研究中, 7l份环境标本中ETEc阳性有7株,阳性检 出率为9.8,较人群检出率低(116份人类 标本中ETEC阳性47抹,阳性检出率为 28.3).通过质粒特征分析发现,环境 E1,EC阳性株质粒型与人群ETEC阳性抹不 同.在广州军区EfrEC腹泻调查研究中, 1993年2月采集的标本中,人粪12株阳性, 环境5棣阳性,质粒特征分析结果,两者质 粒特征也不相.挺示环境株可能是独立存 ?l71? 一圈5ETEC菌株的质粒图谱 1t~517标准株 2,8t来自不而地区的ETEC 菌株 在株,与人ETEC腹泻病关系不大. 2.4不同地区不同时期ETEC菌株间的关 系不同地区不同时期的ETEC阳性株中, 我们发现有质粒特征相同的菌株存在(图 3),进一步用EcorI作质粒酶切,酶切图 谱也相同.各地区质粒携带个数情况无显着 性差异(表2)(x=35.6,P>0.05).说明 各地流行的ETEC菌株虽有地区差异,但还 是有相同的流行株,在时间上也有一定的序 贯性. 5讨论 随着分子生物学理论和技术突飞猛进的 发展,8O年代初分子流行病学应运而生它 通过对造成某一疾病流行的病原体在基因水 平上分析其特征.从而更准确地解决传染源, 传播途径和有关流行病学问题.而质粒图 谱分析,便是其中一种较为简单而有效的方 法.自从1981年美国疾病控制中心(CDC) 在针对一起州际肠炎流行的研究中开始应用 这一方法以来_H】,质粒图谱分析在流行病学 中得到了广泛的应用,其方法也不断地得到 改进和拓宽”.本文通过对来自不同地区和 时间的206株ETEC阳性株进行质粒图谱和 质粒酶切图谱分析,发现ETEC不同菌株质 粒携带情况有所差异,质粒携带l,,十不 ?172? 表2不同地区ETEC质粒携带情况 堡墼呈塑堕堡堂盘查 地区 菌株数+ ——了—_-——了一合计’ 沈阳军区 北京军区 南京军区 成都军区 广州军区 璩江医院 九佛镇 l2 5 1 4 27 11 16 32 11 6 13 58 35 5l 横线下O,7数字代表菌株所携带的质粒数 等,但以携带大质粒为多而且较为稳定.在 本研究的地区范围内,45Md和3Md大质粒 为优势质粒.这与姜伟等报道的优势质粒 为8Md和83Md有所不同.是否存在菌株变 迁或地区差异,还有待进一步研究.有研究 表明,编码ETEC毒力因子的基因大多位 于大分子量质粒上,分子量范围为21,97 Md.是否本研究中的太质粒与毒力因子有 关,还有待于进一步作质粒酶切图谱分析和 探针杂交分析.在对不同地区和时期所得的 菌株关联性分析中,发现各地区有多型的菌 株存在,亲缘关系远近不一,但也有同源克 隆株存在.这可能与部队人员的流动性有 关.在问一地区及同一时期内,环境株和人 群株ETEC质粒特征的分析研究中,发现两 者质粒特征不问.以往探针杂交研究结果” 也表明,环境ETEC株以ST—P为主,而人 群ETEC~4以sT为主,提示环境株可能 为独立存在株,与人ETEC腹泻关系不大. 鉴于质粒的相对不稳定性和有些菌株不带有 质粒这一情况,对菌株基因型的分析和同源 克隆的鉴定,还有待于进行染色体DNA的 分析或结合其他方法进行联合分析. 4参考文】皇} 1MainilJG,BexF,DrozeP,eta1. RepIicontypingofvirulencela— smidsofenterotoxigenicEcshetic- hlacoliisolatedfromca儿le.In— fectImmun,1992I6口(8):3376 2陈群,时常仁.产肠毒素大晒埃希氏菌腑 毒素质粒传递的研究.中华流行病学杂志, l990~,1]c3):l75 3俞守义,辕添弥,胨义忠.用三种基因探 针对肠毒性大肠杆菌膜潞的_仞步分子流行 病学研究.中华流行病学杂志,1990s11 (3):l75 4徐建国,刘志奇,刘议明,等.一种政良 的质粒DKA提取方法.中华流行病学杂 志,1989,10(特刊11),257 5Hanse11JB,RonaldHO.Iso1ation oflargebacterialplasmidsand characterizationoftheP2imcom— patlfitygroupplasmidsPMG1and PMG5.JBacterio1,1978’135=227 6TaylotDN,WachsmuthIK,Shahg- kutillY.eta1.SalmonetlosisRS$O— ClatedWithmarijliana:Amutt[state OUtbreaktracedbyPjamidfing— erprinting.NewEng】Med,1982【 那S:l29 7魏征字,王燕,叶寅,等.质粒DKA的 酚一氯仿一步抽提祛.微生物学通报1993j 2口(?:375