酵母准备试剂

酵母转化 (一) 材料、仪器设备及试剂： 1. 0.2% stock solution 的 L-Adenine Hemisulphate：0.2g+100ml的ddH20，分2支 用时灭菌。 2.YPDA培养基： 1L ● 胰蛋白胨      20g/L ● 酵母提取物      10g/L ● 葡萄糖        20g/L ● 腺嘌呤          15ml 0.2% stock solution ● 调节pH =7.5，121°灭菌15min 3.YPDA培养基 （用时再分装灭菌）YPDA Liquid (1 L) Reagent Amount YPD 50 g L-Adenine Hemisulphate 15 ml of 0.2% stock solution Deionized water Up to 1 L Adjust pH to 6.5 if necessary, then autoclave.     3. YPDA Agar培养板(1 L) Reagent Amount YPD agar 70 g L-adenine hemisulphate 15 ml of 0.2% stock solution Deionized water Up to 1 L Adjust pH to 6.5 if necessary, then autoclave.     4.0.9%NaCl（w/v）（科室拿）  1ml:EP管分装 NaCl:        0.9g milipore水  定容到100ml 灭菌121°，20min 5.100%DMSO    从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存 6.  10×TE（pH=7.5）：  （0.1M Tris-HCl，10mM EDTA） ● Tris-HCl      1.211g/100ml    ● EDTA        0.37g/100ml    ● 调节pH=7.5, 121°，20min 7.   10×LiAc（pH=7.5） ● 1M LiAc        10.202g/100ml ● 用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min 1. 1.1×TE/LiAc 1.1ml的10×TE  +  1.1ml的 10×LiAc  加入灭菌水终为10ml 2. 50% PEG3350： ● PEG3350：  50g ● 已灭菌的milipore水： 定容到100m ● （可用50°水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌） 3. PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中 终浓度        10ml PEG3350            40%            8ml  50%PEG3350 TE    buffer        1×            1ml    10×TE LiAc            1×            1ml  10×LiAc 4. 变性的鲱鱼精DNA(10mg/ml)：  100° 5min 变性 5. milipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管架，ep管架 6..x-a-GAL用 DMF（dimethyl formamide） 20mg/ml， Prepare and autoclave 1 L of the appropriate droput agar medium Cool to 55°C    Add 2 ml of X-a-Gal (20 mg/ml) Spreading onto premade agar plates Dilute X-a-Gal to 4 mg/ml in dimethyl formamide Spread 200 μl onto 15 cm plates, or 100 μl onto 10 cm plates using sterile glass beads   (二) 具体方法： Freezing Medium consists of YPD liquid medium + 25% glycerol ◆ A：酵母感受态制备 1. 从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆（10ul+10ul的DDH20），30°培养3天左右。 2. 从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行做3管） 3. 30°，200rpm，培养8-12h （过夜） 4. 取200ul 菌液，测OD600 5. 选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50m新鲜的YPDA培养基中（培养基装在250ml三角瓶中）  ？？？剩下的离心制作甘油菌 6. 30°，200rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.3 7. 将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。 8. 30°，200rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时） 9. 将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30ml 灭菌水重悬。 10. 再次离心，3000g，3min，室温 弃上清，每管用1.5ml 1.1×TE/LiAc重悬。 11. 将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s 12. 弃上清，每管用600ul  1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。 ◆ B：酵母质粒转化  （pGBKT7。pGBKT7/n端和c端。） 小规模转化    大规模转化 1. 加入质粒DNA    （在预冷的EP管中）     100-500ng     3-5ug 鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml)            5ul              20ul 加入感受态细胞, 轻弹混匀                      50ul              600ul 2. 加入PEG/LiAc, 轻弹混匀                    500ul          2.5ml 3. 30°水浴，每10-15min轻弹混匀            30min          45min 4. 加入DMSO, 轻弹混匀                        20ul           160ul 5. 42°水浴，每5-10min轻弹混匀                15min          20min 6. 离心，弃上清                            最大转速      3000g 15s              3min 7. 用液体YPDA培养基重悬                    1ml              3ml 8. 30°，230rpm，培养                      90min           90min 9. 离心，弃上清                            最大转速      3000g 15s              3min 10. 用0.9%NaCl重悬                            1ml              15ml 11. 涂板在相应的筛选培养基上。 (三) 注意事项： 1. 转化效率与很多因素有关，酵母活力是一个重要因素，一般制备酵母感受态的细胞必须是没有经过4°保存的，活化过的，从培养箱中取出的新鲜酵母。 2. 在制备酵母感受态时，不要超过上述的的OD值，要让酵母一直处在生长最旺盛的时期，特别是最后一次培养，OD600的值不要超过0.5 3. 酵母转化过程中，没有抗生素，极易染菌，所有实验都在超净台中进行，超净台需提前一天用70%酒精棉擦拭，将第二天用到的物品（如，试剂，试管，架子等）都放入超净台，灭菌过夜，每次进入超净台操作时，需用70%酒精棉擦手消毒。 4. 由于酵母生长周期较长，平板一般在培养箱中要放3天左右，所以在倒板时，不可吹得太干，小板晾干10min左右，大板晾干15min左右即可 5. 有些筛选培养基需要加入3-AT，必须是在培养基冷却到55°一下才可加入。 铺板（铺板3个一起做，转化后生长、自我激活、毒性对比） 试剂准备：准备SD/-Trp板3*3=9个板  9*20=180ml~~~200ml 1.appropriate SD selection medium（） For pGBKT7, use SD/-Trp              For pGADT7, use SD/-Leu 2. 1/10 稀释：100ul目的载体+900ul YPDA  板3*3=9个板  9*20=180ml~~~200ml 1/100稀释：10ul目的载体+990ul YPDA 1/5稀释：  10ul目的载体+40ul YPDA 二、Spread 100 μl of 1/10 and 1/100 dilution onto a 100 mm plate containing the appropriate SD selection medium 三、Incubate plates upside down at 30°C until colonies appear (3–5 days). 3-5天后，挑取单菌落，5ml的缺陷液体培养基中培养12h（过夜），室温离心，3000g，3min。 甘油菌制备     取500ul的（YPD+25%甘油） 菌落自我激活和毒性 1、自我激活 1） 已准备好的AH109菌株：pGBKT7-cav3和N端， 2） 阳性对照组：pGBKT7-53(AH109菌株)  和pGADT7-T 3） SD/-Trp/ X-a-Gal plates 在1L中，Cool to 55°C,add 2 ml of X-a-Gal (20mg/ml). 4） SD/-Ade/-His/-Trp/X-a-Gal plates 在1L中，Cool to 55°C,add 2 ml of X-a-Gal (20mg/ml) 2、实验过程： 1.Spread 100 μl of a 1/10 dilution and a 1/100 dilution of your transformation mixture onto separate: SD/-Trp/ X-a-Gal plates SD/-Ade/-His/-Trp/X-a-Gal plates 2、Expected results after 3–5 days: 毒性-中毒 1.Materials:AH109 competent cells (Section XII.A) SD/-Trp agar plates (Appendix D) SD/-Trp liquid medium (Appendix D) 2、Transform 100 ng of the following vectors using the small-scale transformation protocol (Section XII.B) pGBKT7 (empty)