viia7实时荧光定量pcr仪

viia7实时荧光定量pcr仪 ViiA? 7实时荧光定量PCR仪 2005 1996 2000 Launched Introduced ABI Launched ABI Applied Prism? 7700 Prism? 7900 Biosystems Instruments Instruments 1998 2003 2007 7300/7500 Launched ABI Launched Launched 7500F Prism? 7000 StepOne? and GeneAmp ? Instruments 5700 Instruments StepOnePlus? Instruments Instruments 开启高产率荧光定量PCR新时代 ?速度快，通量高。35分钟完成384个定量PCR反应。 ?操作简便。直观的软件，内置触摸屏电脑，网络远程操控，自动机械臂进样装 置。 ?结果可靠:孔间差异，批间差异，以及仪器间差异降至最低。创新的OptiFlex? 系统的增强型荧光检测提供21种荧光组合，具有更高的多重分析灵活性，更高 的分辨率，能获得更准确的数据。 ?多模块灵活性。可轻松更换 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 96孔，快速96孔，384孔，和TaqMan?微流 体芯片4种模块。。 方便 产率 •在TaqMan Array操作中比原 •与 ReadiApp?功能无缝连 接 先省略60%操作步骤 •快速Block模块更换 •远程网络操控 •内置触摸屏电脑 ?预设置各种不同应用 的标准程序，一键式 触摸选择， ReadiApp? 软件功能 ?轻松上传TaqMan? Assay信息和样品信息 ?方便下载新的试剂操 作程序 ? Name the instrument and create an Avatar ? Create shortcuts to common protocols ? On‐board timer to indicate time to completion 适合中心实验室或多用户 的客户 ?有史以来最好的多重荧光(Multiplex )能力 ? 6个激发光通道和6个检测光通道， 可自由组合，多达 21种光谱 ?可在同一块板同时完成TaqMan?和 SYBR ? 检测 ?灵敏度和均一性 ?读取384‐wells 1uL反应体系 ? (TaqMan Array Cards) ?可分辨1.5被差异 ?重复性可靠:批间差异和仪器间 差异降至最低 ?更换Block只需不到1分钟 ?热盖 (96 vs. 384) ?反应板适配器 (96 vs. 384 vs. TAC) ? 384‐孔Block; TaqMan微流体芯片Block Validated Programmable 5‐20uL 384 1‐30uL TAC 1uL 1uL ?标准96‐孔Block;快速96‐孔Block Validated Programmable 1‐200uL 96 10‐100uL 5‐30uL Fast 96 1‐100uL 温度均一性 +/‐ 0.25?C 升温速度 3.0?C/sec (384‐well) 运行时间 ~35 min for 384‐well 检测灵敏度 Down to 1 copy 线性范围 Up to 9 logs 分辨率 Down to 1.5 fold change for single plex reaction RNaseP copies: ‐ 10,000 ‐ 6,667 ‐ 4,500 ‐ 3,000 ‐ 1,500 ‐ 1,000 TaqMan Gene Expression MMx, 5ul Rxn, 384‐well format, Standard Run conditions Amplification of plasmid DNA (7‐7E10 total copies/rxn) 35分钟快速反应结果，达到9个数 量级线性范围. TaqMan Fast Universal MMx, 5ul Rxn, 384‐well format Multiplex on cDNA with 5 probes + passive reference. Proprietary dyes and master mix in development. Digital PCR (数码PCR)演示地拷 贝检测: Raji gDNA稀释至每孔 70% 1.05拷贝. 71% (260/368)孔PCR 结果阳性. 1.05 泊松分布: 1.05 copy per well will result in ~70% positive reactions. Single molecule detection is possible following Poisson distribution. 384‐孔板(368重复 +16 NTC).快速模式, 5ul反应体系, Fast Universal MMx). Amplification of the RNase P Gene showing 144 replicates of 5,000 and 10,000 copy populations on a 384‐well block using fast run conditions Ct Standard Deviation of 0.092 Amplification of the TGF‐Beta Gene on a TaqMan Array Card with a Full‐Plate of replicates. Gene Expression Master Mix, standard run conditions ?孔间温度差异小 ViiA? 7 TaqMan? Array Block Thermal Uniformity @ 90C 96.00 95.75 95.50 95.25 95.00 94.75 94.50 C-D 94.25 G-H K-L O-P 94.00 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12 13-14 15-16 17-18 19-20 21-22 23-24 重现性非常好 Ct SD Ave Ct TGF‐Beta TGF‐Beta 18s 18s ViiA? 7 Block FAM VIC FAM VIC 27.17 A 384w 0.052 0.027 12.38 A 384w 0.057 0.037 27.13 12.38 A 384w 0.054 0.028 27.16 12.37 B 384w 0.061 0.032 27.25 12.24 B 384w 0.053 0.028 27.24 12.24 B 384w 0.053 0.028 27.24 12.23 A TAC 0.088 0.137 27.11 12.39 A TAC 0.084 0.130 27.15 12.42 A TAC 0.080 0.140 27.14 12.41 B TAC 0.087 0.084 27.24 12.30 B TAC 0.095 0.090 27.22 12.27 B 0.091 0.098 27.21 12.28 TAC “… The Next Generation Instrument in the format of a low‐density array/microfluidic card … are in agreement with results obtained on ABI 7900HT device in a 96‐well format.”—Principal Investigator, Medical University of Vienna “Now I can go home early on Friday” ‐‐Senior Scientist, Genentech “What I really appreciated about the instrument is the immediate easy‐to‐use feeling I had when playing around with the software… and also the comfort with the instrument itself.” ‐ Laboratorio Patologia Molecolare *2009 Demo Sites and Usability Testing Demo Sites will generate over 10 application notes & Your Innovative Research (YIR) in key areas: Multiplexing, Genotyping, ViiA? 7 vs. 7900HT and Roche LC480 ViiA? 7 ‐Twister? II 7900‐ Twister? I iLINK Pro: Scheduling software that SDS Automation Controller: 软件兼容性 can integrate with other compatible with Twister 1 automation 384‐well 384‐well 反应板兼容性 TaqMan Array Cards TaqMan Array Cards 0.2mL 96‐well Plates 0.2mL 96‐well Plates 0.1mL Fast 96‐well Plates 机械臂活动范围 270? (accommodates more plate types with different bar code Fixed locations) 堆栈数量 2 input, 1 output 4 input, 1 output 55 384‐well plates 21 384‐well plates 反应板容量(每个进样 50 TaqMan Array Cards 21 TaqMan Array Cards 板堆栈) 25 Std 96‐well plates 9 Std 96‐well plates 30 Fast 96‐well plates ? Copy/Paste Sample Information within ViiATM7 Software to and from Microsoft Excel ? ?兼容7900设置文件 ?样品名、样品属性在Excel 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 格内设置，直接导入系统 ?可以任意添加样品属性描述 Well Sample Name ID Age Sex Weight HairColor Smoker Sample 1 1 22 Female 25 black Yes 1 2 Sample 2 2 25 Male 26 brown No 3 Sample 3 3 45 Female 50 blonde Yes 4 31 Male 33 red Yes 4 Sample 4 5 29 Female 46 grey No 5 Sample 5 ? Store up to 100 runs on the instrument ? Start run using USB ? Save completed run file onto USB ? Completed run file saved onto network ? Auto‐delete downloaded experiments if there is not enough room on instrument No Need to Stop by the Lab! ? The software’s Instrument Console let’s you monitor up to 15 instruments on the network ? Quickly check the calibration status of your instruments from your desk! ? Watch the amplification plots of up to 4 experiments from your desktop computer Go Home Early on a Friday! ? De‐coupled filter selection lets you run different chemistries ? Explore custom dyes and enhance your research ViiA? 7 Software Filter Selection Features TaqMan Assay w/ SYBR Assay Run ? Flexibility to analyze data from any temperature hold step ? Helps you determine the best housekeeping gene ? Assess overall CT distribution of your genes across samples ? Use Box‐Whisker plots to assess CT distribution of your samples for each target ? Determine which sample may be an outlier ? Mouse over each box plot to view descriptive statistics ? Assess CTcorrelation (r) between samples using Pearson’s Correlation ? Quickly determine non‐ideal samples in your analysis ? Import a standard curve from another experiment ? Save wells on the plate for more reactions Amplification of the TGF‐ beta Gene (FAM dye‐ Red) and 18S Gene (VIC dye ‐ Green) showing 384 replicates. 5ul rxn, Gene Expression Master Mix, Standard conditions. ?Embedded within the ViiA? 7 Software! ?10 User Licenses per purchase ?New HRM Features: ?Specify number of data points per degree ?Analysis settings: user can define number of variant calls ? Manually select the number of variants to be called ? Catch hidden variants! ? MicroRNA作为抑癌基因 ? miR-34家族属于p53抑癌网络的组成部分 (He et al. 2007) ? miR-15a和miR-16-1在CLL中为抑癌基因，在发病个体中通常发生缺失(Cimmino et al. 2005) ? The let-7负调控Ras (Yu et al. 2007) ? MicroRNA作为原癌基因 ? miR-155 ( He et al. 2005; Volinia et al. 2006; Costinean et al. 2006) ? oncomiR-1 (miR-17-92 cluster) ? MicroRNA在肿瘤入侵和转移过程中发挥的作用(Ma et al. 2007; Budhu et al. 2008; Tavazoie et al. 2008) ? MicroRNA的研究价值 ?治疗癌症的靶基因 ?诊断癌症的生物标记物(BioMarker) ? Reveal traces to determine ideal cycle for clustering ? Use the scroll bar to determine the best cycle for optimal clustering ? Benefit: optimize protocols 384‐Well format, GT Master Mix, custom dye probes ? mRNA分析试剂盒(基因表达):TaqMan Gene Expression Assays(超过1,000,000个预设计试剂盒，覆 盖13个物种) ? miRNA分析试剂盒:TaqMan MicroRNA Assays (Sanger v12.0数据库) ? SNP分析试剂盒(基因分型):TaqMan SNP Genotyping Assays(超过4,500,000个人类预设计分析试剂 盒) ? DME(药物代谢酶) SNP分析试剂盒:2600个SNP位点，分布在220个药物代谢酶基因位点上的. ? CNV基因拷贝数分析试剂盒:TaqMan Copy Number Assays(超过1,600,000个人类预设计分析试剂 盒) ?蛋白表达分析试剂盒:TaqMan Protein Expression Assays(4种hESC多功能性标志物蛋白分析试剂盒 ，2个对照蛋白分析试剂盒) ?非编码RNA 分析试剂盒:TaqMan Non-coding RNA Assays(涵盖3个物种，共24,562个已知非编码 RNA) ? Pri-miRNA分析试剂盒:TaqMan Pri-miRNA Assays(涵盖3个物种，共1,291个pri-miRNA) ?所有TaqMan Assays PCR反应条件一致，扩增效率一致 384孔TaqMan微流体芯片 ? 1 to 8 Samples 1 to 8 Samples 12 to 380 Targets (per card) 12 to 380 Targets (per card) 1, 2,3 or 4 Replicates 1, 2,3 or 4 Replicates 每个孔预装有 TaqMan Assays ? TaqMan? Array block 需要ViiA7 或 7900HT加装 TLDA block ?准备上样时间:,5 minutes Format 12 Format 16 Format 96A Format 24 Format 32 Format 96B Format 48 Format 64 Format 384 Format 192 ?定量PCR芯片技术分析mRNA, miRNA, SNP ? mRNA检测芯片(TaqMan Gene Expression Array/Plate)与肿瘤生物标记物分析 ? miRNA检测芯片(TaqMan MicroRNA Array)与肿瘤生物标记物分析 ?药物代谢酶SNP基因分型芯片(TaqMan DME genotyping Array)与药物基因组分析 ?定量PCR方法分析基因拷贝数多态(copy number variation) ? TaqMan CNV分析试剂盒，在癌症易感基因分析应用 ?定量PCR方法分析蛋白表达 ? TaqMan蛋白表达分析试剂盒，在干细胞多功能性鉴定应用 Assays Gene Coverage Human 197,533 99% 98% Mouse 175,297 99% Rat Human 150,0>207,00078 0 Mouse 40,52>184,000Drosophila 95% Rat >150,0002 97,23 Arabidopsis 97% Drosophila >40,000 C.elegans 92,284 97% Arabidopsis >97,000 80% Canine 54,541 C.elegans 60% Bovine NEW 65, 363 >90,000 Canine >6,500 40% Zebrafish NEW 49,826 Rhesus Monkey >8,000 20% Rhesus MonkeyNEW 14,642 Fusion transcript 165 NA Fusion Transcript NEW 165 60 Mitochondria Mitochondria NA 60 Design service available with same guarantee 定制384孔TaqMan Array——TaqMan Custom Array • 用户从>50,000个Inventried Taqman Gene Expression Assays(覆盖人，大鼠，小鼠，线虫，果蝇，拟南芥，犬 等物种)中选择 • 规格有12，16，24，32，48，64，96，192，384形制 • 根据GeneAssist或UMapIt软件输出文件(txt,excel)在线定制 • 10快起订 预制通路384孔TaqMan Array——TaqMan Gene Signature • AB预制，将某个信号通路/疾病关联/生理机制相关基因预制成板那 • 已有22种通路预制384孔TaqMan Array 定制成384孔微流卡芯片 运行定量PCR，分析数据。同时分 从基因通路网络工具 析几十到上百个基因表达 (GeneAssist)搜寻目的基 因表达检测试剂盒 Run and Analyze Custom TaqMan? Array TaqMan? Card/Plate PreAmp Pool 14 Cycles PreAmp Dilute PreAmp Products PreAmp MasterMix Time Parameter Temperature 95C 10 mins Hold 95C 15 secs cDNA x10 or 14 cycles 60C 4 mins ?乳腺癌早期诊断技术瓶颈 ? 548,000死亡(2007年) ?现有早期诊断方法X光片和组织切片，不方便不灵 敏 ?印度10%早期发现(西方发达国家65%)，死亡率 50% ?急需更快速便捷的早期预警技术 ?外周血检测mRNA肿瘤标记物 ?肿瘤的次级反应会诱发某些特定基因表达发生改变 ，在外周血留下痕迹 ?外周血样品采集方便，伤害低，便于推广早期诊断 ? DiaGenic诊断公司联合Applied Biosystems研发外周 血早期诊断乳腺癌定量PCR芯片——BCTest ? BCTest乳腺癌定量PCR检测芯片 ?从>30,000个基因中筛选出几十个标志基因，定制 成384孔定量PCR芯片 ?每张定量PCR芯片检测4份血样 ?统计分析软件自动判定结果 ?定量PCR芯片操作简便，结果准确 ?标准定量PCR操作，只需很少的技术 培训 焊锡培训资料ppt免费下载焊接培训教程 ppt 下载特设培训下载班长管理培训下载培训时间表下载 。每台机器1 年检测量>15,000人份 ?检测金标准Taqman定量PCR，结果准确，重现性好 ? DiaGenic研发其他疾病检测芯片 ?阿尔氏海默症 ?帕金森症 ?定量PCR芯片技术分析mRNA, miRNA, SNP ? mRNA检测芯片(TaqMan Gene Expression Array/Plate)与肿瘤生物标记物分析 ? miRNA检测芯片(TaqMan MicroRNA Array)与肿瘤生物标记物分析 ?药物代谢酶SNP基因分型芯片(TaqMan DME genotyping Array)与药物基因组分析 ?定量PCR方法分析基因拷贝数多态(copy number variation) ? TaqMan CNV分析试剂盒，在癌症易感基因分析应用 ?定量PCR方法分析蛋白表达 ? TaqMan蛋白表达分析试剂盒，在干细胞多功能性鉴定应用 ? MicroRNA作为抑癌基因 ? miR-34家族属于p53抑癌网络的组成部分 (He et al. 2007) ? miR-15a和miR-16-1在CLL中为抑癌基因，在发病个体中通常发生缺失(Cimmino et al. 2005) ? The let-7负调控Ras (Yu et al. 2007) ? MicroRNA作为原癌基因 ? miR-155 ( He et al. 2005; Volinia et al. 2006; Costinean et al. 2006) ? oncomiR-1 (miR-17-92 cluster) ? MicroRNA在肿瘤入侵和转移过程中发挥的作用(Ma et al. 2007; Budhu et al. 2008; Tavazoie et al. 2008) ? MicroRNA的研究价值 ?治疗癌症的靶基因 ?诊断癌症的生物标记物(BioMarker) RT primer miRNA 成分: 1. RT primer Step 1: 2. Forward primer Stem-loop RT 3. Reverse primer 4. TaqMan probe cDNA 优点 Step 2: 高特异性，能区分前体和成 Real-time PCR 熟miRNA。 高灵敏度， 1-10ng样本。 Forward primer 精确度高，动态范围宽，不 同拷贝都能检测。 快速-- 3小时。 Nucleic Acid Res. v33: e179, 2005 Reverse primer TaqMan probe TaqMan? MicroRNA Array 产品编号描述 数量 4400238 TaqMan? Human MicroRNA Array Set v3.0 4×2板 包括2块384孔TLDA(低密度芯片)，共754条人类 microRNA，每块芯片上另含3条对照。配合 Megaplex? RT Primers/Primer Pools使用。 4400239 TaqMan? Rodent MicroRNA Array Set v3.0 4×2板 包括2块384孔TLDA(低密度芯片)，共728条 microRNA，其中518条小鼠microRNA, 303条大鼠 microRNA(有重叠),每块芯片上另含3条对照。配合 Megaplex? RT Primers/Primer Pools使用。 Total RNA ?从少量，甚至是单细胞中进行microRNA表 达谱分析 MegaPlex RT (up to 300+plex) MegaPlex Pre-Amplification cDNAs 12 cycles PCR TaqMan? Real-time PCR Amplified cDNAs ?应用TaqMan microRNA芯片技术 研究白血病相关的microRNA生物标记物 Stanford Institute for Regenerative Medicine and Stem Cell Biology 人类白血病干细胞 (LSC) CMP CLP 特定的miRNA表达类型可 GMP 区分AML(急性骨髓系白血 MEP 病), HSC(造血干细胞)和 HSC 造血前体细胞 LSC Non-LSC ? AML Progenitors HSC ? HSC/Prog ? ? HSC ? Prog miR-106a miR-17-5p miR-20a AML HSC/AML CMP CLP 特定的miRNA表达类型可 GMP 区分 HSC(造血干细胞)和 MEP LSC(白血病干细胞)的异同 HSC LSC HSC LSC Progenitors ? ? miR-155 HSC ? ? HSC/ LSC ? (Stemness) Prog miR-181a LSC HSC/Prog (normal) ?定量PCR芯片技术分析mRNA, miRNA, SNP ? mRNA检测芯片(TaqMan Gene Expression Array/Plate)与肿瘤生物标记物分析 ? miRNA检测芯片(TaqMan MicroRNA Array)与肿瘤生物标记物分析 ?药物代谢酶SNP基因分型芯片(TaqMan DME genotyping Array)与药物基因组分析 ?定量PCR方法分析基因拷贝数多态(copy number variation) ? TaqMan CNV分析试剂盒，在癌症易感基因分析应用 ?定量PCR方法分析蛋白表达 ? TaqMan蛋白表达分析试剂盒，在干细胞多功能性鉴定应用 ? TaqMan SNP基因分型试剂盒 ? 以基因组DNA 或PCR产物为模板 ? 2条引物, 2条MGB探针 Homozygotes ? FAM和VIC标记 ? 终点读板实验 平台期终点的荧光信号的散点图: ? ? VIC (allele 1) on X-axis ? FAM (allele 2) on Y-axis ? 每个数据集代表一种基因型:每种纯合子、杂合子 和无模板对照(VTC) ? 1:1 in VIC cluster Heterozygotes ? 1:2 in VIC + FAM cluster ? 2:2 in FAM cluster NTC • FAM荧光信号本身就高于VIC荧光，FAM信号更强(note difference in X & Y axis scales) • NTC并不位于 (0,0), 即在没有DNA模板的情况下探针具有荧光 ?超过4,500,000个人类SNP基因分型分析试剂盒可供选择，其中包含3,500,000 HapMap SNP，70,000个cSNP ? 3,500,000 HapMap SNP ? 1,600,000个经验证的SNP ? 70,000个cSNP ? 2,600个DME(药物代谢酶)分型试剂盒 > 检测覆盖在220个编码最关键药物代谢酶和转运蛋白的基因上SNP,MNP,插入/缺失位点 > 位点全部位于编码区、基因调控区域或内含子剪切相邻区域(有意义突变) > 经过白人、黑人、黄种人群验证，确保有效 ?另提供代客设计合成服务 ? 384孔TaqMan Array(低密度芯片)规格 ?灵活选择DME SNP分型试剂制制成低密度芯片 ?终点法检测，准确率等同常规微孔板 ?适合相同位点组合的大量样本重复检测，操作简便 ?代客定制TaqMan DME Genotyping Array ?使用TaqMan DME Genotyping Array药物基因学研 究，Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (Ohio) ? Dr Kejian Zhang实验室使用AB的TaqMan SNP分型试剂盒研究多 种疾病(免疫缺陷综合症、先天性耳聋、脂肪酸代谢紊乱)的药物 基因学机理 ?选取28个代表性的DME分型试剂加3个对照，定制成TaqMan DME Genotyping Array，每块芯片一次检测8个样本 ? 1天的实验通量达到94个样本，使用其他常规方法需5~7天 ?定量PCR芯片技术分析mRNA, miRNA, SNP ? mRNA检测芯片(TaqMan Gene Expression Array/Plate)与肿瘤生物标记物分析 ? miRNA检测芯片(TaqMan MicroRNA Array)与肿瘤生物标记物分析 ?药物代谢酶SNP基因分型芯片(TaqMan DME genotyping Array)与药物基因组分析 ?定量PCR方法分析基因拷贝数多态(copy number variation) ? TaqMan CNV分析试剂盒，在癌症易感基因分析应用 ?定量PCR方法分析蛋白表达 ? TaqMan蛋白表达分析试剂盒，在干细胞多功能性鉴定应用 Copy Number Variation (CNV)定义 ?基因组发生DNA片段缺失或重复 ?缺失或重复片段>1 kb，多数CNVs <10 Kb;少量CNVs >1 Mb ?片段复制或低拷贝重复 单倍体染色体上存在的>1kb的DNA片段拷贝数重复( >2);重 复片段序列相似度 > 90% . 常常与大片段序列重复连锁发生 > CNVs分布人类基因组，与多种疾病表型紧密相关: ? HIV/AIDS susceptibility (CCL3L1) ? Rheumatoid Arthritis风湿性关节炎 ? Neuropathies神经系统疾病(PMP22) ? Type I diabetes ? Lupus红斑狼疮-免疫系统疾病(FCGR3B & C4) ? Crohn’s disease节段性回肠炎 (DEFB4) ? Cancer ? Drug Metabolism (e.g. CYP2D6) 1 FAM-labeled TEST ASSAY VIC-labeled 2 CONTROL ASSAY Standard TaqMan protocol (i.e.: RNase P) PCR gDNA 3 1 ng / µL PCR rxn 4 TaqMan 4 replicates Master Mix per gDNA sample ?单纯的SNP分析会丢失CNV信息 ?等位基因上1个位点发生缺失，在SNP分析中会和纯合子混在一起，而实际基因表达产物 减少 ?等位基因上发生重复，在SNP分析中会和杂合子混在一起，而实际基因表达产物增加 ?等位基因2个位点缺失，和SNP扩增失败的样本混在一起 ? CNV分析基因剂量效应，为研究疾病机理提供更多信息 ? CNV蕴含更多基因组多态信息 ?常规 CNVs至少跨越 1/10t人类基因组区域 ?占据1%个体基因组差异。 (SNPs只占据0.1%个体基因组差异) 基因剂量效应——CCL3L1拷贝数与艾滋病易感性关联 •CCL3L1基因是艾滋病共受体——趋化因子受体5(CCR5)的主要配体，是重要的抑制HIV-1 的趋化因子 •研究发现CCL3L1基因在非黑人人群(~3拷贝)中少于黑人人群(~6拷贝) •CCL3L1低拷贝携带者易感染HIV-1，感染后发病速度也较快。ccl3l1低拷贝+CCR治病突 变携带者则HIV-1易感率和发病速度更快。 ? GSTM1和GSTT1谷胱甘肽转移酶 ?是重要的癌症关联基因，与致癌物代谢相关，是重要的 SNP研究基因 ?以前的实验显示相当部分样本GSTM1和GSTT1 SNP扩增 失败，实际上是基因缺失 ?使用TaqMan CNV分析试剂测试GST基因缺失与癌 症风险关联 ?结果显示携带GSTT1和GSTM1缺失的妇女长期使用高温 烧烤肉类易诱发乳腺癌 ?携带GSTM1缺失的人吸烟更易发生肺癌 ? GSTT1，GSTM1基因剂量较少或缺失，致癌物难以代谢 脱毒 ? CYP2E1属于细胞色素P450基因家族，是 一个重要的药物代谢酶 ? CYP2E1可催化致癌物前体活化成为致癌产物 ?使用TaqMan CNV分析试剂对CYP2E1 SNP 分析结果检测 ?杂合子聚类隔离较远的6个样本检测基因拷贝数 ?结果证明，折6个”杂合子“是CYP2E1基因 3拷贝 ?提示携带基因重复的个体容易发生癌症风险 ?定量PCR芯片技术分析mRNA, miRNA, SNP ? mRNA检测芯片(TaqMan Gene Expression Array/Plate)与肿瘤生物标记物分析 ? miRNA检测芯片(TaqMan MicroRNA Array)与肿瘤生物标记物分析 ?药物代谢酶SNP基因分型芯片(TaqMan DME genotyping Array)与药物基因组分析 ?定量PCR方法分析基因拷贝数多态(copy number variation) ? TaqMan CNV分析试剂盒，在癌症易感基因分析应用 ?定量PCR方法分析蛋白表达 ? TaqMan蛋白表达分析试剂盒，在干细胞多功能性鉴定应用 ? PLA邻位连接技术(Proximity Ligation Assay)是一种高灵敏度蛋 白质检测技术。该技术采用核酸适 体(aptamer)或单/多克隆抗体-核酸 复合物作为邻位连接探针(proximity probes)。当一对邻位探针同时识别 同一个目标蛋白分子时，它们将在 空间位置上相互临近，通过连接反 应形成一段可扩增的DNA标签序列， 该标签序列能够反映待测蛋白的种 类及浓度。该技术将对蛋白质的检 测转变为对DNA核酸序列的检测，实 现了特殊蛋白质的检测、定量、定 位和蛋白相互作用的检测。 DNA LIGASE Connector oligo Epitope 2 Epitope 1 抗体-Oligo探针 DNA连接酶连接空 TaqMan?快速定 结合探针到靶蛋白 (2 抗原决定簇) 间位置接近的2段 量PCR检测蛋白表 Oligo(仅当2个抗 达量 + 体结合靶蛋白时) 细胞裂解 ，构成PCR模板 基于双抗体的同源检测试剂,每个抗体上绑定了一段Oligo (通过生物素-链霉亲和素偶联) 当2个偶联了Oligo的抗体结合了靶蛋白事，2段Oligo空间位置接近，从而可以被连接酶连接 ，即可构成定量PCR扩增模板 连接 / TaqMan? Fast 数据分析 细胞裂解 抗体结合 Real-time PCR 灭活 1 2 3 4 5 TaqMan蛋白表达分 TaqMan蛋白表达核 Applied Biosystems 蛋白表达样本制备 数据分析 析试剂 心试剂 试剂 快速Real-Time PCR 仪器 新鲜细 通用TaqMan探 针 +快速反应 胞 试剂 -总蛋白 Plate transfer 30 min. 60 min. 10 min. 5 min. 45 min. 总时间 手工操作时间 ~1.5 hrs ~3.5 hrs 全部所需时间 ?灵敏 ?每个反应只需2uL样本(10~500细胞/uL)，所需样品是其他方法的1/10~1/100，特别适合样 本有限的干细胞研究 ?简单 ?一步法裂解样本，间接地定量PCR流程，从样本到结果只需3.5小时 ?定量准确 ? TaqMan定量金标准，比现有其他方法更准确 ?灵活 ?利用同一个定量PCR仪器可从DNA，RNA扩展到蛋白的应用 ?专用分析软件 ?免费下载TaqMan Protein Expression Assays软件分析工具 ? TaqMan Protein Expression Assays是一种新的鉴定人胚胎干细胞中多能 ? 性标志蛋白的快速有效的方法 ?与Western blot和免疫组化等方法相比具有以下优点: >所需样本量是其他方法的1/10 -1/100 >高灵敏度 >快速得到定量结果 >简单，手工操作少 >定量方法—— TaqMan ? 金标准 TaqMan Western Blotting Protein Expression ? 5 6 7 8 1 2 3 4 7 LIN28 OCT3/4 6 SOX2 OCT3/4 5 1 100 000 cells NANOG LIN28 2 33 000 cells 4 3 11 000 cells 4 3 700 cells 3 5 1 200 cells NANOG 2 6 400 cells 7 137 cells 1 8 46 cells SOX2 0 0 1 10 100 1000 Cell input NTERA2 cells (IHC more qualitative than quantitative) Protein Expression Assay Protein Expression Assay 6.5 6 5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0 0.5 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 -1 -0.5 Cell input Cell input LIN28 NANOG SOX2 OCT3/4 LIN28 NANOG SOX2 OCT3/4 TCam2 embryonal carcinoma FS-1 (negative control) Data from Looijenga et al., Erasmus University ? hESC(人类胚胎干细胞)鉴定是一个新兴的领域 细胞多功能性测试 ?需要微量样本检测技术 ?样本细胞数量有限 多功能细胞: 多功能性丢失: 自我更新 分化 ?现有的蛋白分析技术费时费力 ?流式细胞计数 FACS ?免疫染色 (e.g. IHC) ? Western Blot 分化:Neural Mesenchymal ?最新的TaqMan蛋白表达分析试剂盒能对微量的 Hematopoietic 人胚胎干细胞多种标记物进行快速检测 Others… ?新试剂盒实现将mRNA表达分析与蛋白表达分析 直接关联(都使用定量PCR方法) 维甲酸(Retinoic Acid)诱导的细胞分化 NTERA2:人恶性多发性畸胎瘤细胞系 differentiation to neuronal self renewal RA Induction Markers of interest: protein LIN28, NANOG, OCT3/4, SOX2, NCAM1, ALCAM mRNA 样品制备流程 Starting Sample Crude cell lysate Crude cell lysate Protein PARISTM RNA Expression kit Sample Prep kit TURBO DNA- freeTM DNAse treatment TaqMan? Protein One-step RT-qPCR TaqMan? mRNA Expression Assay Assay Real-time PCR System 诱导分化后核酸与蛋白表达 1.E+02 1.E+02 1.E+01 CSTB 1.E+01 CSTB ICAM1 ICAM1 LIN28 LIN28 NANOG 1.E+00 NANOG 1.E+00 OCT3/4 OCT3/4 SOX2 SOX2 ALCAM ALCAM 1.E-01 NCAM1 1.E-01 NCAM1 1.E-02 1.E-02 1 4 10 14 28 1 4 10 14 28 FINAL Day Day TaqMan? Protein Expression Assay TaqMan? Gene Expression Assay Thank you for attention～