超滤膜截留-二氧化钛选择性富集-纳升级液相色谱-串联质谱法检测血清中内源性磷酸化肽

超滤膜截留-二氧化钛选择性富集-纳升级液相色谱-串联质谱法检测血清中内源性磷酸化肽 超滤膜截留-二氧化钛选择性富集-纳升级液相色谱-串联质 谱法检测血清中内源性磷酸化肽 摘 要 采用超滤膜(ultrafiltration membrane)去除血清中的大量高丰度蛋白、dna和rna等大分子量干扰化合物，然后利用tio 2富集超滤膜滤过液中的磷酸化肽，结合纳升级超高压液相色谱 nano uplcqtof)分离和检测技术，提高了内源性磷酸化肽的检测灵敏度;将本方法应用于肺癌患者血清中的内源性磷酸化肽分析，成功检测到18种内源性磷酸化肽。本方法实现了高灵敏度、高选择性血清中内源性磷酸化肽的富集和检测，为肿瘤生物标志物的发现奠定了方法学基础。 关键词 超滤膜;tio2富集;内源性磷酸化肽;nano uplcq tof 1 引 言 蛋白质磷酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰(post translational modifications, ptms)，参与并调控着生命活动的几乎所有过程，包括细胞增殖、分化，神经活动和新陈代谢等[1,2] [3] 于进一步理解生命进程、发现与疾病相关的生物标志物具有重要意义。目前，由于生物样品中磷酸化肽的含量低，并且在质谱检测中大量的非磷酸化肽段严重抑制磷酸化肽的离子信号[4,5] 导致对磷酸化蛋白的鉴定具有挑战性。因此在质谱分析前高选择性地富集磷酸化肽非常重要[6，7] (imac)[8] 如ga3，imac和fe3，imac和金属氧化物亲和色谱(moac)[9]tio2和zro 2等，因其对磷酸化肽的高选择性被广泛应用于磷酸化蛋白组学研究中。 血清中含有来源于几乎所有细胞、组织的蛋白及代谢产物，能够直接反映机体的生理、病理状况，为各种疾病研究提供最有价值的信息[10] 范围，使得血清中内源性磷酸化肽的检测面临很大的困难，相关报道很少。hu等[11] 子亲和色谱(ti4，imac)材料直接从人血清中富集并检测到4种内源性磷酸化肽。本研究组[12]zro2包覆介孔氧化硅材料直接从人血清中富集到12种内源性磷酸化肽。以上两种方法都是利用磷酸化肽中的磷酸根与富集材料中的金属元素相互作用实现了磷酸化肽的选择性富集。但是血清样品中含有大量的脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)及磷酸化蛋白等大分子化合物，这些化合物都含有磷酸根，特别是rna和dna, 它们可能在上样过程中与低丰度的磷酸化肽竞争富集材料上的作用位点，从而降低了血清中磷酸化肽的富集选择性。因此，如何有效去除这些大分子量的干扰化合物，提高血清中低丰度磷酸化肽富集检测方 法至关重要。 本研究采用超滤膜(ultrafiltration membrane)去除血清中的大量高丰度蛋白、dna和rna等大分子量干扰化合物，减少了在上样过程中与磷酸化肽竞争作用位点的干扰物，提高了tio2富集磷酸化肽的选择性，结合纳升级超高压液相色谱 间质谱(nano uplcqtof)分离和检测技术，从肺癌患者血清中共检测到18种内源性磷酸化肽，明显提高了内源性血清磷酸化肽的检测灵敏度。 2 实验部分 2.1 材料与试剂 geloader枪头 (德国eppendorf公司); c18aq材料 (德国sunchrom公司);3 k、10 k超滤膜、tio2材料 (日本gl sciences 公司);α (tfa)、乳酸 (la)、nh4hco3 (美国 sigmαaldrich 公司); 测序级胰蛋白酶 (美国promega公司); 乙腈 (can，德国merck公司);甲酸 (fa，比利时acros公司);超纯水由millq制备 (美国millipore公司);10%氨水溶液 (瑞士fluka公司)。 2.2 酶解 将1 mg 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品α1 ml 50 mmol/l nh4hco3 (ph 8.0) 溶液中，蛋白与胰蛋白酶按照40?1(质量比)充分混合37 ?下酶解12 h后，加入终浓度为0.5%甲酸终止反 应。酶解液分装后，在,70 ?冰箱保存备用。 2.3 标准品的超滤膜过滤 将不同剂量的α50% ch3oh0.5% fa溶剂充分混匀，将混合液移至10 k和/或3 k超滤膜中 式冷冻离心机 (美国fisher公司) 上，以13000 r/min离心60 min。取出滤过液(通过超滤膜)并旋干，再溶于40 ?symbolma@ l 300 mmol/l la/80% acn/0.1 fa的溶液中，待测。 析 化 学39卷 12期: 超滤膜截留 2.4 磷酸化肽段富集与脱盐 称取1 mg tio2放入50% acn/0.1% fa(40 ?symbolma@ l)中，制成匀浆液，装入geloader枪头中， 用惰性材料塞紧。装好的微柱依次用40 ?symbolma@ l的 0.1% fa， 80% acn/0.1% tfa， 40 ?symbolma@ l×2300 mmol/l la/80% acn/0.1% fa的溶液冲洗，将样品注入微柱中，依次用40 ?symbolma@ l×2的300 mmol/l la/80% acn/0.1% fa)， 40 ?symbolma@ l 80% acn/0.1% tfa， 40 ?symbolma@ l h2o洗脱，最后用10 ?symbolma@ l×2的5% nh3h2o收集，并用甲酸调至ph 3。 称取1 mg c18aq材料装柱(同上)，将装好的微柱依次用40 ?symbolma@ l acn，40 ?symbolma@ l×2的50% acn/0.1% fa溶液冲洗40 ?symbolma@ l×2的0.1% fa溶液平衡微柱，将上述富集到的收集液上样，再用40 ?symbolma@ l×2 的0.1% fa溶液脱盐，最后用20 ?symbolma@ l×2的50%acn/0.1%fa 溶液洗脱收集并旋干，再用10 ?symbolma@ l的50% acn/0.1% fa溶解，利用qtof ms进行检测。 2.5 血清样品制备及富集与脱盐 血清样品前处理:1 ml血清样品加入3倍体积20?冷丙酮，将两种液体充分混匀，以15000 g离心15 min。取出上清液并旋干，再溶于3.5 ml的50% ch3oh/0.5% fa溶液中，将其移至10 kda超滤膜，以13000 g离心60 min。取出滤过液并旋干，再溶40 ?symbolma@ l的300 mmol/l la/80% acn/0.1 fa溶液中。 血清中内源性磷酸化肽段富集与脱盐过程同2.4节，其中脱盐得到的收集液旋干再溶于10 ?symbolma@ l 0.1% fa溶液中 2.6 质谱分析 标准品磷酸化肽的鉴定由全扫描质谱在nanoesi qtof ms(美国waters公司) 上进行:进样流速:1 ml/min式(esi，);nanospray 电压:2.0 kv，扫描范围为500,2000 da。人血清中内源性磷酸化肽的鉴定在nano uplcqtof 上进行:将待测液 (流速为15 ?symbolma@ l/min)上样于symmetry c1810 mm×180 ?symbolma@ m i.d., 5 ?symbolma@ mwaters公司)，然后阀切换到beh 130 c 18100 mm×100 ?symbolma@ m, 1.7 ?symbolma@ mwaters公司) 上进行反相液相色谱分离。流动相a: 含有0.1% fa的水溶液; 流动相 b: 含有0.1% fa的乙腈溶液。流速:0.6 ?symbolma@ l /min，梯度条件:0 min，5% b; 5 min，12% b; 105 min，43% b; 106 min95% b; 110 min，95% b; 114 min，5% b; 120 min，5% b。质谱检测采用正离子survey模式，电压为 2.0 kvms设置为m/z 500,2000;ms/ms设置为m/z 100,2000。数据使用proteinlynx处理(美国waters 公司) 3 结果与讨论 3.1 超滤膜截留分子量选择 血清样品中的rna、dna及磷酸化蛋白等大分子化合物干扰了磷酸化肽的富集效率，采用超滤膜净化血清样品。首先对不同规格的超滤膜进行评价，以α对象，经10 kda超滤膜过滤，将滤过液均分为两份，一份直接经tio2富集、质谱检测;另一份移至3 kda超滤膜过滤，将滤过液和浓缩液(截留在膜上)均收集、旋干，3份试液分别经tio2富集、质谱检测。10 kda超滤膜的滤过液(1a与3 kda超滤膜的浓缩液图1b )在肽的检测数量及丰度方面无太大差别;但3 kda超滤膜的滤过液中(1c )仅能检测到少数低信号强度的肽。这表明10 kda超滤膜可以有效地将大分子物质截留在超滤膜进液侧，而将小分子磷酸化肽集中在滤过液中，起到降低样品复杂度的作用;而3 kda超滤膜将10 kda滤过液都截留在膜上量小分子物质可以透过，未起到降低磷酸化肽检测复杂度的作用。本研究选用10 kda超滤膜。 [ts(]图1 α到(a)10 kda的过滤液b)3 kda的浓缩液和c)3 kda的滤过液 3份试液分别经tio2富集后的质谱图 fig(1 mass spectra of tryptic αcasein filtered with different ultrafiltration membranes of a) 10 kda filtrate, (b) 3 kda retentate，(c) 3 kda filtrate and then (enriched with tio2[ts)] 3.2 血清稀释溶剂的选择 血清样品因粘度较大，需稀释后才能用于超滤膜过滤。但超滤膜在使用过程中对常用溶剂的浓度有所限制，根据本实验所用超滤膜的使用说明，配制了两种溶剂(50% ch3oh/0.1% fa和10% acn/ 0.1% fa)，并比较了两种溶剂对样品的稀释及溶解性能。添加有α tio2富集和质谱分析，结果见图2。用50% ch3oh/0.1% fa为稀释溶剂时(2a以?标记)的选择性高于10%acn/0.1% fa为稀释溶剂磷酸化肽的选择性 (2b50% ch3oh/0.1% fa为稀释溶剂所得质谱图中(图2a)基本没有非磷酸化肽的干扰;且50% ch3oh/0.1% fa为稀释溶剂所得磷酸化肽的丰度明显高于10% acn/0.1% fa为稀释溶剂所得磷酸化肽的丰度。因为50% ch3oh/0.1% fa在实验中稀释血清和溶解的磷酸化肽的性能好，使磷酸化肽的损失较小、选择性较高，所以接本实验选用的稀释溶剂是50% ch3oh/0.1% fa。 [ts(]图2 添加有αa)50%ch3oh/0.1% fa和(b)10% acn/0.1% fa稀释后，再经tio2富集后的质谱图 fig(2 mass spectra of serum spiked with tryptic αcasein diluted with (a) 50%ch3oh/0.1% fa and (b) 10% acn/ 0.1% formic acid (fa) and then enriched with tio2 ?:磷酸化肽(phosphopeptides)\.[ts)] 3.3 灵敏度检测 对于复杂、未知的血清样品，无法对其中的磷酸化肽直接进行检测，为检验本方法是否能检测到血清中的内源性磷酸化肽，确定其检出限非常必要。在保证超滤膜过滤和tio2富集过程不变的前提下，取5 ?symbolma@ l serum和125 ?symbolma@ l 50% ch3oh/0.5% fa作为基质，分别加入160、80、20和8 pmol的α解液，将4种混合液分别按本方法进行富集检测。结果显示:当α160 pmol时，磷酸化肽的选择性及丰度都很高(图3a);随着α 量的降低，本方法对磷酸化肽的选择性降低(图3b和3c当α20 pmol时(图3c)，741.2292(1，)为谱图的基峰，但标准品中所含的磷酸化肽仍都可以检测到，如830.9491(2，), 733.3816(2，), 651.1996(3，)和976.5459 (2，) 等。继续降低α8 pmol)时，磷酸化肽检测受到严重抑制，仅能检测到830.9491 (2，)和976.5459 (2 ，) 两个磷酸化肽，其丰度很低，但是信号和噪音的比值大于3(图3d)。所以本实验中磷酸化肽的检出限为8 pmol α酪蛋白酶解液，即浓度为61.6 nmol/l的磷酸化肽。 3.4 血清中内源性磷酸化肽的富集和检测 将本方法应用于肺癌患者血清中内源性磷酸化肽的富集和鉴定。从1 ml肺癌患者血清中共检测到 18种内源性磷酸化肽(表1)。为进行对比，在其它前处理方法相同的前提下，血清样品不经过超滤膜过滤而直接进行tio2富集，经过lcms分析后，在血清中未检测到磷酸化肽。此结果表明，超滤膜过滤可以有效去除生物大分子化合物的干扰，进而提高了tio2富集磷酸化肽的选择性和灵敏度。成功验证了本方法对复杂样品(如血清)的处理及检测的适用性及应用价值。 4 结 论 建立的超滤膜方法可以有效去除血清中大量的蛋白、rna和dna等大分子化合物，提高了tio2对内源性磷酸化肽的富集选择性和灵敏度，结合nano uplcqtof技术进行内源性磷酸化肽的分离检测，从血清中检测并鉴定到18种内源性磷酸化肽。此方法可为疾病生物标志物的鉴定提供方法学的参考。 references 1 mann m, ong s e, gronborg m, steen h, jensen o n, pandey a. trends biotechnol., 2002, 20(6): 261,268 2 hunter t. cell, 2000, 100(1): 113,127 3 jumaa h, hendriks r w, reth m. annu. rev. immunol., 2005, 23: 415,445 4 conrads t p, issaq h j, veenstra t d. biochem. biophys. res. commun., 2002, 290(3): 885,890 5 kalume d e, molina h, pandey a. curr. opin. chem. biol., 2003, 7(1): 64,69 6 wu jianhong, xiao kuang, zhao yong, zhang weiping, guo lin, feng yuqi(吴剑虹， 肖 矿， 赵 勇， 章建平， 郭 林， 冯钰锜). chinese j. anal. chem., 2010, 38(9): 1231,12377 bai zhaofang, wang hongxia (柏兆方, 王红霞). chinese j. anal. chem.(分析化学)， 2009， 37(9): 1382,1389 8 haydon c e, eyers p a, avelinewolf l d, resing k a, maller j l, ahn n g. mol. cell. proteomics, 2003, 2 (10): 1055,1067 9 thingholm t e, jorgensen t j, jensen o n, larsen m r. nat. protoc., 2006, 1(4): 1929,1935 10 qian w j, jacobs j m, liu t, camp d g, smith r d. mol. cell. proteomics, 2006, 5(10): 1727,1744 11 hu l h, zhou h j, li y h, sun s t, guo l h, ye m l, tian x f, gu j r, yang s l, zou h f. anal. chem., 2009, 81 (1): 94,104 12 wan h h, yan j y, yu l, zhang x l, xue x y, li x l, liang x m. talanta， 2010, 82(5): 1701,1707 selective enrichment of endogenous serum phosphopeptides with ultrafiltration membrane intercepttitanium dioxide chromatography coupled with nano ultra high pressure liquid chromatographyquadrupoletime of flight mass spectrometry zou lijuan2, li juan2, wan huihui1, li xiu ling1, liang xinmiao1 1(dalian institute of chemical physics, chinese academy of sciences, dalian 116023) 2(the second affiliated hospitals of dalian medical university, dalian 116044) abstract a novel method coupled ultrafiltration membrane with tio2 was developed to remove large amount highmolecular weight compounds and enrich endogenous phosphopeptides in serum. the enriched endogenous serum phosphopeptides were characterized by nano ultrahigh pressure liquid chromatographyquadrupoletime of flight ms (nano uplcqtof ms). up to 18 endogenous phosphopeptides could be successfully identified from the serum of lung cancer. the sensitivity and efficiency of serum phosphopeptides detection was improved by this established method, which might be contributed to novel tumor biomarker discovery. keywords ultrafiltration membrane; titanium dioxide; enrichment; endogenous serum phosphopeptides; nano ultra high pressure liquid chromatographyquadrupoletime of flight mass spectrometry (received 23 may 2011; accepted 22 june 2011)