DMD／BMD基因缺失的检测及其临床分析

DMD／BMD基因缺失的检测及其临床分析 DMD,BMD基因缺失的检测及其临床分 析 216脑与神经疾病杂志2005年第13卷第3期 DMD/BMD基因缺失的检测及其临床分析 董艳红吕佩源魏慈胡爱祥李玲 摘要目的:了解Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)致病基因缺失的分 布及其与临床病情的关系. 方法:应用9对引物多重聚合酶链反应(mPCR)技术对42例DMD/BMD患者进行 致病基因检测.结果:21例患者 (5O.0)被检出外显子缺失,缺失片段长度各异,其中16例(76.2)累及中央缺失热区,5 例(23.8)位于5端缺失热 区,尤以48号外显子缺失频率最高.结论:多重PCR技术是检测DMD/BMD致病基 因缺失的有效方法,该病病情轻重 可能与外显子缺失的数量和长度不呈平行关系,而是与缺失类型有关,并受到个体 差异的影响. 关键词DMDBMD基因缺失多重PeR 中图分类号:R746?2文献标识:A文章编号:1006—351X(2005)03—0216—03 DetectionofDuchenne/BeckerMuscularDystrophy(MDM/BMD)Gene DeletionsanditsClinicalAnalysis DongYanghong.L"Peiyuan,Ci,etal DepartmentofNeurology,HebeiProvincialPepoles'sHospital,Shijiazhuang050051 AbstractObjective:Toanalysisthedeletiondistributionofdystrophingeneandtherelationsh ipbetweengenedele— tionsandclinicalsymptomsinDuchenne/Beckermusculardystrophy(DMD/BMD).Metho ds:Forty-twopatientswith DMD/BMDwerescreenedbyusingmultiplexpolymerasechainreaction(mPCR)with9pair sofprimers.Results:The deletionofoneormoreexonswasfoundin21patients.16cases(76.2%)weredetectedinthece ntralregionand5pa— tients(23.8)inthe5extremeregion,especiallyinexon48(6patients).Conclusion:Multiplex PCRisanefficienttech— niquefordetectinggenedeletions.Itmightbepossiblethatsomecorrelationexistedbetweent hecertaingenedeletionand thedegreeofseverityofthediseasewhichwasals0affectedbyinheritancepattern.Theamoun tandlengthofexondele— tionmaynotaffectthesymptoms. Keywords:DMDBMDgenedeletionmultiplewPCR Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD) 是一种常见的X连锁隐性遗传性肌肉变性疾病,系 RC8DNAXp一Xp一L1.28DNA序列的基因缺陷 导致其编码产物抗肌营养不良蛋白(dystrophin)表达 异常所致.Dystrophin基因是目前已知的人类最大的 基因,长达2400Kb,含79个外显子,约占整个X染色 体长度的1;具有很高的突变率].其中约1/3患 者由新的突变引起,缺失最常见,占55,65,5, 1O为重复,25左右为点突变,其它微小缺失和微小 重复约占8l2],这给基因检测增加了难度.随着 PCR技术的成熟与发展,直接检测致病基因为临床 DMD/BMD的诊断提供了可靠的依据.本研究采用9 对引物多重聚合酶链反应(mPCR)技术对42例 DMD/BMD患者进行了基因缺失检测,并就其缺失分 布与临床病情的关系加以探讨.现 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下: 作者单位:050051石家庄河北省人民医院神经内科 河北省自然科学基金资助课题(编号:3974l5) 通信作者:吕佩源 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 和方法 1.病例选择:42例DMD/BMD均来自我院就诊 病人.临床诊断主要依据典型的症状体征,血清肌酸 激酶水平,肌电图,肌肉活检等检查.全部患者均为男 性,7例有家族史,其中DMD40例,发病年龄2,13 岁,平均8.2岁,BMD2例,发病年龄23,3O岁,平均 26,5岁. 2.试剂来源:DMD/BMD9对引物多重PCR试剂 盒购自北京中国医学科学院基础研究所,5对引物单 一 PCR试剂盒购自湖南医科大学国家重点医学遗传 实验室. 3.方法 (1)人基因组DNA制备:抽取抗凝(2无菌ED— TA)静脉血5ml,按常规蛋白酶K消化及酚一氯仿抽 提,无水乙醇沉淀DNA后用75乙醇洗2遍,干燥后 溶于TEbuffer.用751紫外分光光度计测OD值,计 算浓度与纯度. (2)PCR扩增:9对引物(分别扩增外显子4,8, 脑与神经疾病杂志2005年第13卷第3期 12,17,44,45,48,49,51)分成5对引物和4对引物两 组,在50L反应体系中加入: 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 200,500ng,10× buffber5uL,dNTP(25ITIM,each)4uL,TMAC5uL, BSA(10Ftg/vI),5对/4对引物混合物8.5FtL (25pmol,each),最后加水至50FtL,混合后离心数秒; 至97?预变性7分钟,离心15秒,迅速置冰上,加入 Tag酶2.5U,混匀后加30L液体石蜡,放入PCR仪 中进行扩增,扩增条件为:94?30秒,56?30秒,70?2 分钟30个循环,最后70?延伸5分钟. (3)判断标准:取15L扩增产物加入溴酚蓝载样 缓冲液2"L,电泳60,80V2小时,以正常男性模板扩 增产物为对照,5条/4条扩增带都存在为正常.缺失 任何一条带,经重复扩增后结果相同,诊断为基因缺失 型DMD/BMD. 结果 42例DMD/BMD患者中,共检出21例外显子缺 失(见表1),占总例数的50.0,其中17例(81.09/5) 表121例DMD/BMD患者的 dystrophin基因缺失分布情况 例数发病年龄DMD/BMD外显子缺失片段长度(dp) DMD BMD DMD DMD DMD DMD BMD DMD DMD DMD DMD DMD DMD DMD DMD DMD DMD DMD DMD DMD DMD 表现为单个外显子缺失,4例(19.0)存在两个外显 子缺失.缺失的外显子片段最长者为45号(547dp), 最短者为4号外显子(191dp),但患者病情最为严重. 在这21例外显子缺失的患者中,16例缺失部位集中 于中央缺失热区(44,51号外显子),为76.2%,5例 缺失部位为5'端缺失热区(第2,20号外显子),为 217 23.8.48号外显子缺失频率最高,共6例 (28.6).4,8,17,51号外显子缺失频率最低,均为2 例(9.59/5).(见表2). 表2外显子缺失分布特点 讨论 Dystrophin基因突变分析表明,缺失突变约占全 部突变类型的55,65l2],主要分布于两个热点区 域,即5'端缺失热区,位于2,20号外显子区,约占 30;中央缺失热区,位于44,51号外显子,约占 70l3].本研究共发现21例患者有不同程度的基因 缺失,检出率为50.0,与国内外报道的47,519/5相 似].其中16例(76.29/6)累及中央缺失热区,5例 (23.8)累及5'端缺失热区,与上述缺失热点分布规 律基本符合.48号外显子缺失最多,其次为45号,49 号及44号外显子(分别为19.1,19.1%和14.3), 均为缺失热区中的缺失热点.而5'端4号和8号外 显子缺失较少.以上结果与国内大部分文献报道相 似.据此分析,若在临床应用中酌情首先采用缺失率 较高的几对引物进行筛选,如无缺失再行其它引物检 测,即可节省引物,降低实验难度,减少患者的家庭经 济负担. 统计资料表明,DMD基因缺失范围的个体差异 很大,从一个至数十个外显子不等,有学者认为这是因 为在不同内含子中存在着多个不同的同源顺序,发生 同源重组的顺序的位置 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 了缺失断裂点部位及缺失 范围的大小].本组资料中,17例表现为单个外显 子缺失,4例(例6,11,16,20)存在两个外显子缺失. 从临床病情看,这4例患儿表现并非严重.45号外显 子片段最长(547dp),4号外显子最短(19ldp),但病情 最为严重的是2例仅为外显子4缺失的患儿.这说明 该病的病情轻重可能与基因缺失的数量和片段大小不 呈平行关系,而是与外显子的缺失类型有关.Monaco 等:提出了阅读框架原则,即有外显子移码缺失的病 人是病情严重的DMD,整码缺失突变的病人是BMD. Dystrophn是骨骼肌细胞膜上骨架蛋白的重要组成部 分,有学者发现ll其绞链结构3对维持膜蛋白的弹性 恰与疏水性最强,最集中 和柔韧性方面起着重要作用, 的缺失热区疏水峰重叠,均为50和51号外显子编码, 具有举足轻重的地位,其缺失势必造成dystrophin功 能严重丧失.而本组资料中2例51号外显子缺失的 7991 4337 716015687746816496829 47069,0844,0890,306,3 525318535585315645204 66O6 2253 218 DMD患儿均为7岁发病,病情相对较重,也提示dys— trophin基因缺失类型和临床表型之间是有可能相关 的. 令人感兴趣的是,此次观察结果中4例不同外显 子缺失的患儿临床病情相仿,而6例48号外显子缺 失,临床表型却不相同,5例为DMD,1例为BMD.谭 庆荣等曾报道一对孪生兄弟患儿均缺失8号外显 子,但临床表型不尽相同.其弟2岁半时发病,其兄4 岁半仍无症状,说明致病基因的表达也受到个体差异 的影响.相同基因位点的突变,可引起不同的临床表 型,而不同的基因类型又可引起相似的临床表现,呈高 度的遗传异质性. 参考文献 1KoenigM,HoffmanEP,BertelsonCJ,eta1.Completecloningof theDuchennemusclardystrophycDNAandpreliminarygenomicor— ganizationoftheDMDgeneinnormalandaffectedindividuals.Cell, 1987,50:5O9,517 脑与神经疾病杂志2005年第13卷第3期 2RobertsRG,GardnerRJ,BobroroM.Searchingforthein 2400000:areviewofdystrophingenepointmutations.HumMurat, 1994,4:1,11 3VanEssenAJ,KneppersALT,vanderFloutAH,eta1.Theclin— icalandmoleculargeneticapproachtoDuchenneandBecketmuscu— lardystroply:anupdatedprotocat.JMedGenet,1997,34:805, 812 4潘速跃,张成,盛文利,等.中国人抗肌营养不良蛋白基因缺失的分 布特点.中华神经科杂志,1999,32(1):22,24 5KoenigM,BeggsAH,MogerM,eta1.Themolecularbasisfor DuchenneversusBecketmuculardystrophy:correltionofseverity withtypeofdeletion.AMJHumGenet,1989,45(4):498 6张成,柴建华,刘焯霖,等.抗肌萎缩蛋白基因DNA缺失机制的探 讨.中山医科大学,1996,17(1):5,7 7MonacoAP,BertelsonCJ,Liechti—Gallatis,eta1.Anexplanation forthephenotypicdifferencesbetweenpatientsbearingpartialdele— tionsoftheDMDlocus.Genomics,1988,2:9O 8谭庆荣,吴保仁,王连刚,等.两步多重聚合酶链反应对假肥大型肌 营养不良的基因诊断.中华神经精神科杂志,1994,27(9);223,225 (2004—11—1收稿) 慢性硬膜下血肿误诊为短暂性脑缺血发作1例 周丽 中图分类号:R743?9文献标识码:A文章编号:1006—351X(2005)03—0218一O1 1.病例报告:患者,男,7O岁.因反复发作性右侧肢体无力 12小时入院.既往有高血压病10年,间断服降压药,血压控制 情况不明,否认外伤史.12小时前患者晨起时无何诱因发作性 右侧肢体无力,右手执筷费力,站立不稳,无头晕,头痛,呕吐, 无言语不清,抽搐及精神异常,休息1O分钟后上述症状消失. 于当地医院就诊时查体无阳性体征,未行头颅CT检查,诊断 为短暂性脑缺血发作,予改善脑循环及抗血小板聚集药物治 疗,2小时前上述症状再发,持续半小时缓解,为进一步诊治来 我院.查体无阳性体征,血压150/80mmHg,头颅CT示双侧 额顶部新月形低密度影,考虑慢性硬膜下血肿,行双侧微创锥 颅血肿清除术,术中抽吸出陈旧血30ml,术后予双侧血肿持续 引流,第4日复查头颅CT血肿吸收,受压脑组织膨起复位,患 者未再出现上述症状及其他异常情况,治愈出院. 讨论:慢性硬膜下血肿分婴儿型和成人型两种.成人患本 病多有外伤史;婴幼儿患者除产伤史和一般外伤所致者外,颅 内压低,营养不良,维生素c缺乏,出血性硬脑膜炎亦可为本病 的致病诱因.外伤性硬膜下血肿,是指外伤3周以上始出现症 状者.此类外伤性血肿的外力多较小,甚至有的患者无明确的 作者单位:264400威海市文登中心医院神经内科 头部外伤史.好发于5o岁以上老人,血肿可发生于一侧或双 侧,大多覆盖大脑半球额顶叶突面,形成包膜. 关于出血原因,可能与老年性脑萎缩颅内空间相对增大有 关,遇到轻微慢性力作用时,脑与颅骨产生相对运动,使进入上 矢状窦的桥静脉撕裂出血.其临床表现差异很大,进展缓慢, 病史较长,可达2O年以上,患者较长时间内无症状,逐渐出现 的症状可归纳为三类:?以颅内压增高症状为主者比较多见, 表现为头痛,呕吐,视乳头水肿,常因缺乏定位体征被误诊为颅 内肿瘤.?以智力和精神症状为主者,表现为头晕,耳鸣,记忆 力和理解力减退,精神迟钝或精神异常等,易误诊为神经官能 症或精神病.?以局灶性症状和体征为主者,如局灶性癫痫, 偏瘫,失语等.易与脑血管病意外,颅内肿瘤混淆. 本例患者误诊原因:?患者有高血压病史,而高血压是短 暂性脑缺血发作的危险因素之一.?否认外伤史.?静态起 病,无头痛,呕吐等颅内压增高表现.?未行头颅CT检查. 鉴于慢性硬膜下血肿有上述特点,极易误诊,建议临床医生在 询问病史尤其针对老年人时勿忽视外伤史,应及时行头颅CT 检查以防延误诊治. (2005—1—30收稿)