黄芪注射液与白细胞介素2增强树突细胞抗肿瘤转移作用的比较研究

黄芪注射液与白细胞介素2增强树突细胞抗肿瘤转移作用的比较研究 黄芪注射液与白细胞介素2增强树突细胞抗 肿瘤转移作用的比较研究 236?国巾西医结合杂志2005年3月第25鲞笙!1w!!,: 黄芪注射液与白细胞介素2增强树突细胞 抗肿瘤转移作用的比较研究 董竞成董晓辉 摘要目的观察比较黄芪注射液与白细胞介素(IL)一2增强树突细,~g(DCs)的抗肿瘤转移作用.方法 制备C57BL/6小鼠骨髓来源的IX;s,用Lewis肺癌特异性多肽Mutl预激DCs,并联合黄芪注射液或IL一2治 疗转移性肺癌小鼠,通过流式细胞仪分析其脾细胞内T淋巴细胞亚群比例的变化,用Elisa法检测荷瘤小鼠 血清IL,2,IL一4含量.结果肿瘤抗原多肽致敏的DCs与黄芪注射液或IL一2联合治疗后,肺癌结节减少, 小鼠脾脏中T淋巴细胞亚群(c【)4和CD8)升高,血清IL一2/IL一4比值也明显升高.在观察期间,经IX?s联 用IL一2和DCs联用黄芪注射液免疫小鼠成瘤率均低于单用DCs组.结论黄芪注射液和IL一2均能增强 DCs的抗肿瘤转移作用,有效地促进荷瘤宿主的免疫应答,具有显着的体内抑制肺癌转移的效果.对正常动 物免疫保护作用更加明显. 关键词黄芪注射液;白细胞介素一2;树突细胞;肺癌;抗肿瘤转移 ComparativeStudyOilEffectofAstragulusInjectionandInterleukin-2inEnhancingAnti—tumorMetastasis ActionofDendriteCellsDONGJing—cheng,DONGXiao—huiIntegratedT,ditionalandWesternMedica』In— stitute0/'PulmonaryandAtopicDiseases,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai(2 00040) ObjectiveTocomparetheeffectofAstragulusinjection(AGI)andinterleukin一2(IL一 2)inenhancingan— ti— tumormetastasisactionofdendritecells(DCs)basedvaccine.MethodsC57BL/6mice'SmyelogenicDCs werepreparedandpre—sensitizedbyMut1.aMHCclassI— restrictedtumorantigenpolypeptideofLewislung cancer.ThentheDCswereusedtotreatmicewithmetastaticlungcancerincombinationwithAGIorIL一2. ChangeofproportionofT— lymphocytecellsubsetsinspleniccellwasanalyzedbyflowcytometry,andtheserum contentsofIL一2andIL一 4ofthetumorbearingmiceweredetectedbyELISA.ResultsAfterbeingtreatedwith tumorantigenpolypeptidesensitizedIX'splusAGIorIL一 2,thetubercleoflungcancerdecreased,proportionof subsetsCINTandCD8Tinmice'Sspleniccel?ncreased.andserumIL一2/IL一 4ratioalsoincreasedobvious— ly.Duringtheobservedperiod,thetumordevelopingrateintheimmunemicetreatedwithDCScombinedtreat— ment,eitherwithIL一 2orwithAGI.waslowerthanthatinmicetreatedwithDCsalone.ConclusionBoth AGIandIL一2canenhancetheanti— tumormetastasisactionofDCS.effectivelypromotetheimmuneresponseof tumorbearinghost,thereforehaveobviouslyinhibitoryeffectonlungcancermetastasisinvivo.Theirimmune protectivefunctioninnormalanimalsisevenmoreevident. KeywordsAstragulusinjection;interleukin一2;dendritecells;lungcancer;anti— tumormetastasis 树突细胞(dendriticcells,DCs)是目前已知的功能 最强的抗原提呈细胞,运用肿瘤抗原多肽致敏的DCs 治疗肿瘤是DCs研究领域的热门课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 u'.有文献报 道应用Lewis肺癌特异性多肽Mutl致敏的DCs 治疗转移性Lewis肺癌取得了显着疗效,其机理在于 有效诱导了荷瘤小鼠产生了肿瘤抗原特异性细胞毒性 基金项目:E海市百人 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 基金资助(No.065) 作者单位:复旦大学附属华山医院中西医结合肺和特应性疾病研 究室(上海200040) 通讯作者:董竞成,Tel:021—62494664;Email:jcdong2004@126 corn T细胞(CTL).由于许多肺癌宿主体内的DCs数量和 功能都明显受抑,不能有效地递呈肿瘤抗原.因此,设 法活化DCs的抗原递呈功能,保证DCs递呈功能的高 效性,对肿瘤的免疫治疗有重要意义.大量的研究已 经开展,如联用白介素(IL)一2],IL-7,干细胞因子 (Flt3L),环磷酰胺等或通过基因技术将一些细胞因子 的基因转染到DCs,以此来提高DC疫苗的治疗作用, 并取得了一定的成效.本研究尝试对黄芪注射液(As— tragalus,AG)和IL一2对DC疫苗的增强作用作一 比较. 巾同中西医结合杂志20(1515卷第3 材料与方法 (l'l,wM,March2005,v()l2No3 1主要试剂小鼠Lewis肺癌细胞侏的Mud 抗原8肽(FEQNTAQP),由两安美联公司合成纯化, 纯度>95%;重组小鼠GM—CSF和重组小鼠IL一4购自 美国Peprotech公司;注射用人重组IL一2:10万IU/ 支,批号:20030508—6,长春长基因药业股份有限公 司产品.小鼠细胞因子IL一2,IL一4ELISA试剂盒购自 奥地利BenderMedSystems公司产品.荧光标记的抗 CI)86抗体,抗MHC—l类分子(H一2K)抗体,抗MHC一 ?类分子(I—A)抗体试剂盒购自美国CAITAG公司; 荧光标记的抗CD,抗CD4和抗C抗体试剂盒 购自美国CALTAG公司.黄芪注射液:每l0ml含生 药黄芪20g,杭州正大青春宝药业有限公司生产,批 号:0306012. 2动物和细胞株健康C57BL/6小鼠,雌性, 6,8周龄,购自中国科学院上海实验动物中心 Lewis肺癌细胞株:中国科学院上海细胞所提供. 3小鼠骨髓来源DCs的培养和肿瘤抗原多肽的 Mutl致敏获取C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞(1× 10./m1),用含10%FCS,重组小鼠GM—CSF25ng/ml 和重组小鼠IL一41ng/ml的RPMI1640液培养基在 24孔板中培养,培养至第3天,吸弃悬浮细胞,补足新 鲜培养基;培养至第7天,收集:晷=浮细胞,置于另一培 养板(1×10/m1)继续培养2,3天,收集悬浮细胞即 为DCs.将培养至第7天的DCs与GM—CSF,IL一4与 多肽抗原Mutl(1mg/m1)于37?共同孵育24h,收 集细胞,此细胞即为DC—Mud,并离心洗涤3次,用生 理盐水调整至1×10.细胞/ml: 4自发性肺癌模型的建立小鼠足垫注射 Lewis肺癌细胞5×10/只(50/,1).当Lewis肺癌细胞 接种后第13天,荷瘤小鼠足垫部肿瘤直径长至8, 10IIlm时,在0.67%戊巴比妥钠67mg/kg麻醉下,以 2%的碘酒消毒患肢,于膝关节处进行截肢术至截肢 20天后称取小鼠肺重量,观察,计数肺部表面转移结 节数,以确定转移模型成功与否 5Mutl致敏的DCs治疗转移性肺癌将自发 性肺癌小鼠分为4组,每组15只(1)模型组:截肢后 第2,15天肩部皮下注射PBSl(J0l.(2)DC—Mutl 组:截肢后第2天肩部皮下注射DC—Mutl5×l0s/ 100~1,第8,l5天时再分别注射DC—Mutl5×105/ 100#1.(3)DC—Mutl+AG组:截肢后第2,15天每天 腹腔注射AG50g/kg,在截肢后第2,8,15天分别肩部 皮下注射IX;一Mutl5×l0/100f』l.(4)I一Mutl+ IL一2组:截肢后第2,15天分别每天2次腹腔注射 IL一2(10000IU/~.),在截肢后第2,8,l5天分别肩部 皮下注射D—Mud5×10/100~1:在截肢后第20天 时,各组杀死小鼠5只,观察小鼠的肺重量和肺表面结 节数,并观察各组剩余10只小鼠的生存期和存活 情况: 6诱导小鼠抗肿瘤免疫保护实验取24只雌性 6,8周龄C57BL/6小鼠,随机分为4组,每组6只: (1)模型组:截肢后第2,30天肩部皮下注射 PBS100#l.(2)DC—Mutl组:截肢后第2天肩部皮下 注射DC—Mutl5×10/1001~1,以后每隔7天再分别注 射DC—Mutl5×10/100t,1,共6次:(3)DC—Mutl+ AG组:截肢后第2,30天每天腹腔注射AG50g/kg, 在截肢后第2天起每隔7天分别肩部皮下注射IX7一 Mutl5×10/100~1,共6次.(4)D—Mutl+1L一2组: 截肢后第2,30天分别每天2次腹腔注射IL一2 (10000IU做),另在截肢后第2天肩部皮下注射 I)C—Mutl5×10/100#1,以后每隔7天再分别注射 DC—Mutl5×10/100~,1,共6次.第3l天时小鼠足垫 部注射Lewis肺癌细胞5×10/只(501~1),观察3周瘤 体的生长情况. 7荷瘤小鼠脾细胞表型的分析上述荷瘤小鼠 截肢后,于免疫治疗的第10天取各组小鼠脾脏,制备 单细胞悬液,去除红细胞后,用大鼠抗小鼠直接荧光标 记的抗CD3,CD4和C|)8单克隆抗体标记30min 后,经FACS分析各组小鼠脾细胞内T淋巴细胞亚群 (CD,C【)4和CDs)情况. 8血清IL广2和IL一4含量的测定采用ElISA方 法,以标准品的浓度为横坐标,以相应的吸光度值为纵 坐标,先做标准曲线.然后样本吸光值由标准曲线查 得相应浓度值(pg). 9统计学方法采用单因素方差分析和(, 检验 结果 1各组小鼠肺重量和肺转移结节数结果见表 1.模型组小鼠肺重量和肺结节增加,与正常组比较, 差异有显着性(P<0.01).与模型组比较,3个治疗组 肺重量显着下降,肺结节减少(P<0.05或P<0.01) 与DC—Mutl组比较,IX;一Mutl+AG组和I)C—Mutl+ IL一2组的肺重量和肺结节下降更明显(P<0.05):这 些结果表明,DC疫苗对肺癌有一定的治疗效果:AG 和IL一2对DC疫苗治疗肺癌的增强作用同样明显: 国中西医结合杂志2005年3月第25鲞箜塑!!,l:!. 表1各组小鼠肺重量和肺转移结节数比较(?) 注:与正常组比较,P<0.01;与模组比较,P<005,P< 0.叭;与DC—Mutl组比较,P<005 2治疗后各组小鼠生存时间及存活情况见图 1.模型组小鼠35天时已经全部死亡.与模型组比 较,3个治疗组小鼠的生存期及生存数明显升高(P< 0.05).与DC—Mutl比较,DC—Mutl+lL2组和IX;一 Mutl+AG组小鼠的生存期及生存数明显升高(P< 0.01).与DC—Mutl+IL一2组比较,IX;一MUtl+AG组 小鼠生存期更长,生存数更高(P<0.05),到第52天 时还有80%的小鼠存活. 29303132333435363,j39404一,一47"44454c,{4{J505l52(d/ 生存期 图1各组小鼠生存时间及存活情况=10) 注:+模型组DC—Mut1组DCMut1十IL2组_*-I)CMutI+AG~I 3各组小鼠脾脏T淋巴细胞亚群测定结果见 表2.与正常组小鼠比较,模型组CD3,CD4和 细胞降低(P<0.05).与模型组小鼠比较,3个 治疗组CD3,CD4和CD8增高(P<0.05或P< 0.01).与DC—Mutl组比较,DC—MUtl+AG组与 DC-Mutl+IL一2组CD4显着增高(P<0.01). 表2各组小鼠脾脏T淋巴细胞亚群 测定结果比较(%,-f?S) 注:与正常组比较,P<0.05;与模型组比较,P<005,P< 0.叭;与IX;Mutl组比较,Ap<0.叭 4各组小鼠血清lL一2和lL一4的测定结果见 表3.IL一2:与模型组比较,3个治疗组小鼠均显着升 高(P<0.05);与IX;一Mutl组比较,IX;一Mutl+AG组 和DC-Mutl+IL一2组升高更明显(P<0.05).II,4: 与模型组比较,DC—Mut1+AG组和DC—Mutl+IL一2 组明显下降(P<0.05).IL-2/II一4:与模型组比较,3 个治疗组均显着升高(P<0.05);与一Mutl组比 较,DC—Mutl+AG组和IX;一Mutl+IL一2组升高更明 显(P<0.05). 表3各组小鼠血清IL-2和IL一4测定结果比较(j?S) 注:与模型组比较,P<0.05;与IX,一Mut1组比较,P<0.05 5各组小鼠免疫保护实验结果在Lewis肺癌 细胞攻击实验中,模型组小鼠全部成瘤.DC—Mutl组 有4只小鼠成瘤.IX;一Mutl+AG组和DC—Mutl+IL, 2组在观察期内无1只小鼠成瘤,与模型组比较差异 有显着性(P<0.05). 讨论 在机体抗肿瘤免疫过程中,树突细胞在抗原的识 别,加工和处理并递呈给CD4细胞,活化CTL的抗肿 瘤免疫应答及启动机体特异性抗肿瘤免疫中占有重要 地位.通过调节肿瘤抗原的递呈以增强抗肿瘤免疫应 答是目前肿瘤免疫治疗的重要策略之一. AG增强DCs的抗原递呈作用机理可能为:(1) AG本身的抗肿瘤作用:如对体液免疫,细胞免疫功 能,Thl/rh2的免疫反应状态和对自然杀伤细胞 (NK)的影响.(2)AG通过影响DCs作用(DCs的抗 原递呈有赖于其体内与T淋巴细胞的相互作用):DCs 将抗原递呈给CD细胞,由Thl细胞释放的细胞因 子IL-2作用于CTL或靶细胞,从而产生CTL活化的 第二信号;同时DCs的成熟分化也受Thl/]rh2反应状 态的影响,而AG能有效调整荷瘤小鼠Thl/]rh2免 疫反应状态.有文献报道",应用AG后慢性肾衰 患者的外周血中的DCs计数增加,提示AG可活化T 细胞对DCs的作用,还能增强DCs将抗原递呈于T细 胞的能力,进而又增强T细胞转化的能力. IL-2增强DCs的抗原递呈作用机理在于具有促 进CD4细胞增殖和促进CTL功能的作用. 本结果表明,AG联用DC疫苗可以延长小鼠的生 存期,而IL-2联用DC疫苗可以升高CD4细胞以及 抑制肺癌结节和升高外周血IL-2的浓度.需要指出 的是,与IL一2的增强作用相比,虽然疗效相似,但是 AG以其确切的疗效,毒副反应小,成本低和多环节的 抗肿瘤免疫反应,必将在增强DC疫苗治疗肺癌疗效 方面起重要的作用. 西医站合杂志2005年3门25卷中罔 参考文献 25.O3 1PaczesnyS,UenoH,FayJ.Dendriticcellsas,'octorsforim nmnotherapyofcancerSeminCancerBid2003:13(6):439— 47. 2Ardavin(,.,eunigorenaS,ReisC)u铂(,.Dendrhicceils:im munobiologyandcancerinmmnotherapy1nmmnity2004;20 (1):17—23. 何坨,曹雪涛.淋巴细胞趋化予媾因修饰增强肿 3章卫平, 瘤多肽致敏的树突状细胞的抗肿免疫效果中华医学杂志 1999:79(3):l7()一l76. 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