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两相法分离地被菊叶片质膜的研究_cropped.doc

两相法分离地被菊叶片质膜的研究_cropped

xiang周立
2018-04-04 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《两相法分离地被菊叶片质膜的研究_croppeddoc》,可适用于综合领域

两相法分离地被菊叶片质膜的研究cropped植物学通报,():~ChineseBulletinofBotany两相法分离地被菊叶片质膜的研究沈漫(北京农学院植物科学技术系北京)摘要以地被菊(Dendranthema×grandiflorumKitamura)叶片为材料通过水溶性聚合物DextranT和PEG所构成的两相分配体系制备质膜。在一定盐浓度(mmolLNaCl)下选用种不同的聚合物浓度(、、、、WW)研究了地被菊叶片质膜在两相体系中的分配情况在此基础上进一步研究了不同盐浓度(、、、、mmolLNaCl)对地被菊叶片质膜的纯度及蛋白产率的影响。标志酶鉴定及磷钨酸染色电镜检测的结果表明地被菊叶片选用(WW)聚合物浓度和mmolLNaCl组成的两相分配体系可获得较高纯度的密实正向型质膜囊泡。关键词两相分配法质膜地被菊标志酶磷钨酸染色PreparationofPlasmaMembranefromLeavesofGrandcoverChrysanthemumbyAqueousPolymerTwophasPartitioneSHENMan(DepartmentofPlantScienceTechnology,BeijingAgricultureCollege,Beijing)AbstractPlasmamembraneswerepreparedfromgrandcoverchrysanthmum(Dendranthema×grandiflorumKitamura)leavesbyaqueouspolymertwophasepartitioningsystemwhichwascomposedofDextranTandPEGTheeffectoftheconcentrationofpolymerandsaltonpartitionofplasmamembraneinaqueouspolymersystemwasstudiedTheresultsfromtheelectronmicrographstainingwithphosphotungsticacidandthemarkenzymeactivityanalysesshowedthatthepreparationoftherightsideoutplasmamembranevesiclesfromgrandcoverchrysanthmumleaveshadobtainedhighpurityandyieldbythesystemwhichconsistedof(WW)DextranTandPEG,mmolLNaClKeywordsAqueoustwophasepartition,Plasmamembrane,Grandcoverchrysanthmum,Markenzyme,Phosphotungsticacidstaining植物细胞质膜是细胞进行细胞间内外物质交换、能量转换及信息传递等重要生命活动的关键部位现已成为细胞生物学、植物生理学和生物化学的重要研究领域。近年来质膜及其HATP酶在环境胁迫中的作用问题受到广泛关注。然而要进行这些研究工作必须首先分离出高纯度的质膜。由于植物细胞存在着细胞壁、各种次生代谢物以及液泡中各种水解酶类使北京市科委“科技新星计划”资助项目(项目编号No)。作者简介:沈漫女副教授。主要从事植物逆境生理方面的研究工作。年毕业于南京林业大学林木遗传育种专业获农学博士学位同年进入北京林业大学博士后流动站。年至今任教于北京农学院植物科学技术系。Email:shenmanvipsinacom得对植物细胞质膜的研究落后于其他材料质膜的研究。两相法是近年来较为常用的分离质膜的方法到目前为止已从数十种植物组织中分离出了高纯度的质膜(SandeliusandMorré胡章立等王建华等)与传统的蔗糖密度梯度离心法相比具有明显的优越性但在质膜分离过程还有待完善两相体系的组分、分配条件和操作步骤等不同制备条件以及不同的植物材料对质膜的分离效果都会有较大的影响。地被菊(Dendranthema×grandiflorumKitamura)是一类具有许多优良观赏性状、抗逆性强的新品种群主要由早菊和~种野菊经过年杂交培育而成。根据露地栽培情况发现地被菊十几个品种可在严寒地区(哈尔滨)和干旱地区(兰州)露地越冬并正常开花。这对于气候恶劣、土地贫瘠地区的大规模绿化无疑具有重要的实用价值。目前对地被菊抗逆性与生物膜的相关性研究尚未见报道。为此本文以地被菊叶片为材料研究了聚合物和盐浓度对质膜制备纯度及产率的影响并通过标志酶检测和磷钨酸染色电镜观察对分离纯化的质膜纯度和产率进行了检测这将为下一步深入研究地被菊抗逆性与质膜结构和功能的相关性奠定基础。材料与方法化学试剂葡聚糖(Dextran)TPharmacia产品聚乙二醇(polyethyleneglycolPEG)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfateSDS)、(N吗啡啉)乙磺酸((Nmoropholino)ethanesulfonicacidMES)Sigma产品二硫苏糖醇(dithiothreitolDTT)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoridePMSF)、N'羟乙基哌嗪N'乙磺酸(N(hydroxyethyl)piperazineN'(ethanesulfonicacid)HEPES)和ATPNaBoehringer产品TritonXFluka产品。其他试剂均为国产分析纯。植物材料地被菊(Dendranthema×grandiflorumKitamura)幼叶采自北京农学院园艺实验苗圃。差速离心法制备微粒体参照Palmgren等()、Leonard等()及Lester和Stein()等的方法加以改动。叶片鲜重(g)与匀浆液(mL)以的比例混合。匀浆液的成分为:mmolL蔗糖、mmolL乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacidEDTA)、mmolLTrisMES(pH)、mmolLHEPES(pH)、(VV)甘油、(WV)牛血清白蛋白(bovineserumalbuminBSA)、mmolLPMSF、mmolLDTT、(WV)聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidonePVP)、mmolL维生素(CscorbutaninVc)。叶片在匀浆液中真空浸提min后DS型高速组织匀浆器中速打磨,次每次,s。用四层纱布过滤滤液×g离心min收集上清液。合并两次上清液×g离心h沉淀即为微粒体用少量悬浮液悬浮。悬浮液成分为:mmolL蔗糖、mmolL磷酸缓冲液(pH)。液氮速冻后保存备用。两相法分离纯化质膜参照Sandelius和Morré()的方法及Larsson等()的方法进行。整个操作过程均在进行。微粒体用等浓度DextranT和PEG两相体系进行纯化。取g微粒体悬(浮液加到两相混合液中形成g两相体系。两相混合液包括一定浓度的DextranT和PEG、一定浓度NaCl、mmolL磷酸缓冲液(pH)、mmolL蔗糖以及重蒸水。本实验选用种聚合物浓度(、、、和WW)和种NaCl浓度(、、和mmolL)。经过比较最后选用(WW)聚合物浓度和mmolLNaCl的两相体系。取微粒体g形成g两相体系。将两相充分混匀(颠翻~次)后×g离心min分相将上清液转移至含有新鲜下相的离心管中混匀后再离心分相如此重复次。收集上清液用倍体积悬浮液稀释后×g离心h。收集沉淀用少量悬浮液悬浮即得富含质膜的组分。液氮速冻后保存。标志酶活性测定以pH下对钒酸钠(NaVO)敏感的ATP酶(VOATPase)作为质膜标志酶以pH下对硝酸钾(KNO)敏感的ATP酶(NOATPase)作为液泡膜标志酶以pH下对叠氮钠(NaN)敏感的ATP酶(NaNATPase)作为线粒体膜标志酶。抑制剂NaVO、KNO、NaN的浓度分别为mmolL、mmolL、mmolL。ATP酶活性测定参考Gallagher和Leonard()、Sandstrom等()和Briskin等()方法。测定酶活的体系由mmolLTrisMES(pH或pH)、mmolLKCl、mmolLMgSO、μmolLNaMoO、mmolLATPNa、各种抑制剂、TritonX(视条件加或不加)及适量的膜制剂组成。ATP酶水解反应在恒温振荡水浴中进行min后加入(WV)SDS终止反应。显色反应参照王建华等()进行在各反应试管中加入显色剂后在恒温振荡水浴min冰浴min终止反应。用UVMC型分光光度计测定反应液在nm处的光吸收值。磷钨酸染色质膜纯度检测参考Roland等()的低pH值磷钨酸染色方法并稍作修改。将质膜囊泡组分在(WV)戊二醛中固定h磷酸缓冲液(pH)冲洗次每次min。然后(WV)锇酸固定h缓冲液冲洗同前。系列浓度的酒精脱水丙酮浸泡过夜。环氧树脂包埋聚合h。在LKD型超薄切片机(瑞典)上切片用带有支持膜的镍网收集并对其进行常规的铅铀染色和低pH值磷钨酸染色。染色切片在日立H型透射电镜(日本)下观察并照相。常规的铅铀染色能使所有的膜囊泡着色而低pH值磷钨酸染色只能使质膜囊泡专一着色因此通过两种染色方法的比较可以计算质膜囊泡所占的百分比。蛋白质含量的测定按Bradford()方法进行。以BSA为标准蛋白。结果与分析两相体系中聚合物和盐浓度的选择实验材料经组织匀浆和差速离心后得到的微粒体(粗膜)在主要由Dextran和PEG组成的水聚合物两相系统中进行分配。两相法主要是利用不同膜囊泡在两相体系中分配系数不同而达到分离纯化质膜的目的影响膜在两相系统中分配系数的因素很多如聚合物或盐浓度、上下相的体积比、离子浓度以及微粒体的加入量其中以聚合物和盐浓度影响最大。在两相体系中聚合物浓度不同质膜在上相的分配情况有明显差异。在NaCl浓度为mmolL的两相体系中使聚合物浓度从逐渐增加到质膜在两相体系中的分配如图所示。随着聚合物浓度的提高上相中蛋白产率迅速下降而质膜标志酶VOATPase的活性逐渐升高。图表明选用(WW)聚合物浓度较为合适。在选用(WW)聚合物浓度的蛋白产率PMharvest两相体系中改变盐浓度使NaCl浓度相对酶活VOATPaserelativeactivity从mmolL增加到mmolL。图显图不同聚合物浓度对质膜组分在两相体系中分配的示不同盐浓度对质膜组分在上相中分配的影响影响。由图可见分离纯化地被菊叶片FigEffectofpolymerconcentrationonpartitionof质膜选用(WW)聚合物和plasmamembraneintwophasesystemg两相体系的NaCl浓度为mmolL。以每mgmmolLNaCl的两相体系既可以得到微粒体所得上相中蛋白质微克数表示质膜蛋白产率较高纯度的质膜又能保证较高的质膜产以(WW)两相体系的VOATP酶特异性酶率。活为求得相对酶活。质膜纯度的鉴定gtwophasesystemcontainedmmolLNaClUsg微粒体经过(WW)聚合物和proteinpermgmicrosomestandforPMharvestVOATPasespecificactivityofUin(WW)twophasemmolLNaCl两相体系次分配后得systemas到的U组分即为纯化的质膜。从表可见微粒体经过次分相纯化膜蛋白只有原来的左右但是质膜的标志酶VOATPase的活性保留了近这说明上相收集了绝大部分质膜。一般可把膜标志酶对各专一性抑制剂的敏感性作为鉴定质膜相对纯度的标准。表所示是U组分对不同抑制剂的不同反应。由表可见经过次纯化两相体系的上相富含质膜组分。分离纯化的质膜组分中仅含少量内膜如液泡膜线粒体而质膜组分的相对纯度在以上比微粒体组分提高了。因此通过两相法分离纯化质膜可以得到大部分质表质膜组分蛋白产率和标记酶活性在两相系统中的分配TableDistributionofproteinandplasmamembranemarkVOATPaseinenrichedPMfractionobtainedbytwophasesystem上相组分项目()微粒体UpperfractionsobtainedbytwophasepartitionItemMicrosomeUUUVOATPase相对酶活VOATPaserelativeactivity相对蛋白产率Relativeproteincontent表中数据以次实验的均值标准差表示。两相体系由(WW)聚合物和mmolLNaCl构成。Thedatastandformeans,n=Twophasesystemtwophasesystemcontained(WW)DextranTPEGandmmolLNaCl(膜去除绝大部分杂膜。由于标志酶法只能给出相对纯度(WidellandLarsson)为了更好地评价质膜组分的质量进一步通过磷钨酸染色法进行质膜纯度检测。由图A可见微粒体组分比较复杂磷钨酸只能使少量的囊泡着色(图A)说明在微粒体组分中质膜囊泡只占较少的部分。图B、B是(WW)聚合物和mmolLNaCl两相体系纯化次后的U组分比较二者可以看出磷钨图不同盐浓度对质膜组分在两相体系中分配的影响酸使绝大部分U组分着色证明U为质FigEffectofNaClconcentrationonpartitionofplasma膜而且囊泡大小较均匀囊泡边缘完membraneintwophasesystem整清晰。g两相体系的聚合物浓度为(WW)。以每mg微粒体所得上相中蛋白质微克数表示质膜蛋白产率以通过测定VOATPase的活性潜势mmolLNaCl两相体系的VOATP酶特异性酶活为大小可鉴定所纯化质膜囊泡的类型。活求得相对酶活。图例参考图。性潜势是指TritonX使ATPasegtwophasesystemcontained(WW)DextranT活性增加的部分与激活后ATPase活性的andPEGUsμgproteinpermgmicrosomestandforPMharvestVOATPasespecificactivityofUin百分比(王建华等)。实验结果mmolLNaCltwophasesystemasMarksaretheATPase的活性潜sameasFig表明U组分的VO势达说明分离纯化的质膜囊泡主要是封闭性较好的正向型囊泡(rigntsideoutvesicles)。讨论分离纯化质膜的方法主要有蔗糖密度梯度离心法、两相分配法和自由流动法(freeflowelectrophoresis)。常见的是前两种方法。用差速离心法制备微粒体后过去常用蔗糖密度梯度离心法分离纯化质膜但由于其原理是依据各种膜囊泡的密度与颗粒大小不同来进行分离因此很难将密度相同而性质不同的膜分开提取的质膜容易受线粒体膜、叶绿体膜等污染而表两相体系纯化后质膜和微粒体的纯度比较TableComparisononpurityofplasmamembranebytwophasesystembetweenmicrosomefraction*标志酶敏感性特异部位微粒体质膜组分MarkenzymesensitivitySpecificfractionMicrosomePlasmamembranefractionVOATPase(pH)质膜PlasmamembraneNOATPase(pH)液泡膜Tonoplast线粒体膜MitochondriaNaNATPase(pH)表中数据以次实验的均值标准差表示。两相体系由(ww)聚合物和mmolLNaCl构成。*敏感性()=被抑制的HATPase活力总HATPase活力×。Thedatastandformeans,n=Twophasesystemtwophasesystemcontained(ww)DextranTPEGandmmolLNaCl*Sensitivity()=HATPasespecificactivityinhibitedtotalATPaseactivity×图地被菊叶片膜组分的电镜图A铅铀染色A微粒体A质膜B磷钨酸染色B微粒体B质膜FigElectronmicrographsofmembranefractionsfromgrandcoverchrysanthemumleavesASectionstainedwithconventionaluranylacetateleadcitrateAMicrosomeAPMfractionBSectionstainedwithphosphotungsticacidatlowpHBMirosomeBPMfraction且这种方法所需时间长获得的质膜产率低。目前主要用两相法从微粒体中制备质膜已在数十种植物组织中获得了成功(王建华等)。两相法的基本原理是在一定浓度范围内两种高分子的亲水聚合物DextranT和PEG(或PEG)不能充分溶合而形成悬浮的两相这样可以利用膜微囊的表面电荷和亲水基团不同使其在两相体系中分配在不同的相质膜倾向于分配在富含PEG的上相而其他内膜主要分配在下相或界面从而达到分离的目的。两相(法需要的设备少操作简便获得的质膜纯度高对绿色植物组织的质膜制备特别实用(SandeliusandMorréLarssonetal)。从植物中制备质膜的一个重要步骤就是在制备微粒体时对组织匀浆液成分的选择。Yoshida等()认为mmolL乙二醇四乙酸(ethyleneglycolbistetraaceticacidEGTA)可以最大限度地减少磷脂酶的毒害作用本研究以mmolLEDTA作为替代。BSA具有抑制磷脂酶及多酚氧化酶、吸附游离脂肪酸和保护膜密实性等多种功能所以匀浆液中高浓度的BSA是必需的。我们选择了的BSA加入到匀浆液中这样可以避免分离时膜中的脂加氧酶(lipoxigenase)促使脂肪酸和过氧化物释放所产生的毒害作用以及防止膜渗漏。为了减少叶片中酚类物质氧化造成的干扰我们在匀浆液中加入了较高浓度的抗氧化剂DTT和Vc以及酚类物质吸附剂PVP。另外用mmolLPMSF来抑制脂加氧酶和蛋白酶的活性。这样尽量保证在制备时膜的酶和蛋白活性不受影响。对分离纯化地被菊叶片质膜来说采用(WW)DextranTPEG和mmolLNaCl两相体系是比较适宜的能够获得较高纯度、均一密实的正向型质膜囊泡这与Larsson等()、Sandstrom等()分离燕麦根(聚合物mmolL、mmolLKCl)、Palmgren等()分离甜菜叶片(聚合物mmolLKCl)、Lester和Stei(n)分离香瓜果实(聚合物mmolLKCl)所采用的体系尽管不同但它们都有一个共同点即可以归为“高浓度聚合物低浓度盐”的两相体系。而在制备有些植物材料的质膜时如桑树树皮(Yoshida)、Dactylisglomerata草种根茎(Yoshidaetal)、Viciafaba(Blumetal)则是由较低浓度聚合物和较高浓度盐组成分离质膜的两相体系(聚合物~mmolLNaCl)。这主要是由于制备质膜的材料来源不同因而其组织膜微囊表面特性不同而需要选择不同的两相分配体系的缘故。因此在制备不同植物或相同植物不同部位的质膜时应首先建立适合的分离体系以保证制备质膜组分的纯度和产率。致谢感谢中国农业大学生物学院张学琴老师提供的帮助。参考文献王建华陈珈吴显荣,玉米细胞两种质膜微囊泡的制备和鉴定植物生理学通讯:~胡章立李琳荆家海焦新之,水分胁迫对玉米幼叶生长区细胞质膜HATPase活性的影响植物生理学报:~BlumWKeyGWeilerEW,ATPaseactivityofplasmalemmarichvesiclesobtainedbyaqueoustwophasepartitioningfromViciafabamesophyllandepidermis:characterizationandinfluenceofabscisicacidandfusicoccinPhysiolPlant,:~BradfordMM,ArapidandsensitivemethodforquantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofproteindyebindingAnalBiochem:~BriskinDPLeonardRTHodgesTK,Isolationofplasmamembrane:membranemarkersandgeneralprinciplesMethodEnzymol:~GallagherSRLeonardRT,Effectofvanadate,molybdateandazideonmembraneassociatedATPaseandsolublephosphataseactivitiesofcornrootsPlantPhysiol:~LarssonCWidellSKjellbomP,PreparationofhighpurityplasmamembranesMethodEnzymol:~LeonardRTHansenDHodgesTK,MembraneboundadenosinetriphosphatasecativitiesofoatrootsPlantPhysiol:~LesterGSteinE,PlasmamembranephysicochemicalchangesduringmaturationandpostharveststorageofmuskmelonfruitJAmerSocHortSci:~PalmgrenMGAskerlundPFredriksonKWidellSSommarinMLarssonC,SealedinsideoutandrightsideoutplasmamembranevesiclesPlantPhysiol:~RolandJCLembiCAMorréDJ,PhosphotungsticacidchromicacidasaselectiveelectrondensestainforplasmamembranesofplantcellsStainTechnol:~SandeliusASMorréDJ,PlasmamembraneisolationIn:LarssonCMфllérIMedsThePlantPlasmaMembraneGermang:SpringerVerlayBerlinHeidelbergPress~SandstromRSDeBoerAHLomaxTLClelandRE,LatencyofplasmamembraneHATPaseinvesiclesisolatedbyaqueousphasepartitioningPlantPhysiol:~WidellSLarssonC,AcriticalevaluationofmarkersusedinplasmamembranepurificationIn:LarssonCMфllérIMedsThePlantPlasmaMembraneGermany:SpringerVerlag,BerlinHeidelberg~YoshidaSUemuraMNikiTSakaiAGustaLV,PartitionofmembraneparticlesinaqueoustwopolymerphasesystemanditspracticaluseforpurificationofplasmamembranesfromplantsPlantPhysiol:~YoshidaS,Chemicalandbiophysicalchangesinplasmamembraneduringcoldacclimationofmulberrybark(MorusbombyciskoidzcvGoroji)PlantPhysiol:~

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