雄激素受体基因多态性与多囊卵巢综合的相关性研究（可编辑）

雄激素受体基因多态性与多囊卵巢综合的相关性研究（可编辑） 雄激素受体基因多态性与多囊卵巢综合的相关性研究 天津医科大学 硕士学位论文 雄激素受体基因多态性与多囊卵巢综合的相关性研究 姓名:徐丽爽 申请学位级别:硕士 专业:妇产科学 指导教师:韩玉 20100501 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的:探讨雄激素受体CAG基因多态性在多囊卵巢综合征 polycysficovary syndrome，PCOS 发病中的作用，及其与高雄激素血症、高胰岛素血症的关系。 方法:收集2008年12月"、一2009年8月在天津医科大学总医院妇科内分泌门诊 就诊的PCOS患者97例，选择健康志愿者60例为对照组。所有患者均排除其 他内分泌疾患，近3月内未使用激素类药物。所有PCOS患者行血清性激素水 平及胰岛素释放试验检查，对照组测定血清睾酮水平、空腹血糖及空腹胰岛素 水平。按照是否存在高雄激素血症将PCOS患者分为高雄激素组 I组 和雄激 素水平正常组 II组 ;按照是否存在胰岛素抵抗分为胰岛素抵抗组 A组 和 非胰岛素抵抗组 B组 。从血凝块标本中提取DNA，PCR扩增所有标本的雄激 素受体 AR 基因的CAG微卫星片段，琼脂糖凝胶、变性聚丙烯酰胺凝胶分 别检测目的基因产物，对目的基因测序确定CAG重复次数。 争士甲 三日7氐: 1(PCOS患者临床及内分泌特征 1(1 4(56kg,m2;肥胖发生率为60(82,;高雄激素血症的发生率为60(82,，胰岛素抵 抗的发生率为61(86,;糖代谢异常的整体发生率为27(84,，其中IFG的发生率 已发生糖代谢异常; 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现为月经稀发者为71(13, 69,97 ，继发性闭经者占 多囊性改变，16(49, 16,97 为双卵巢增大，其余未见明显异常。 1(2 于对照组，异具有统计学意义，符合PCOS的临床特征。 1(3不同分组时各组性激素及糖代谢特点 于雄激素正常组，而ISI在高雄激素组组低于雄激素正常组 P 0(05 ;其余各 指标差异无统计学意义 P 0(05 。 天津医科大学硕士学位论文 高于非胰岛素抵抗组，差异具有统计学意义 P 0(05 ;ISI在胰岛素抵抗组低 于非胰岛素抵抗组，差异具有统计学意义;LH、LH,FSH在胰岛素抵抗组低于 非胰岛素抵抗组，尽管差异不具有明显统计学意义。 2(AR CAG 11重复次数与多囊卵巢综合征的相关性研究 2(1 复次数的中位数为23，因此以23为界值，按AR基因所含CAG重复次数，将 30(93,和40(00,，两组在PCOS和对照组间分布相似 P 0(05 。 2(2 VS 雄激素正常组 23(46?2(5622(50?2(24 ，尽管差异不具有明显统计学意 义 P 0(06 ;采用相关 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 显示CAG重复次数与T水平呈明显正相关性。按 AR基因所含CAG重复次数分组，短组CAG在高雄激素组和雄激素正常组分别 为62(71,矛1:I78(95,，长组CAG在高雄激素组和雄激素正常组分别为37(29,和 21(05,，短组CAG在高雄激素组表达较雄激素正常低，长组CAG在高雄激素 组表达较雄激素正常组高，尽管差异无统计学意义 P 0(09 ;AR(CAG重复次 VS 数在多毛、痤疮患者中较不具有多毛、痤疮的患者中明显偏短 22(53?2(22 痤疮的发生率最高 62(16, ，而较长CAG重复次数和较低T水平的患者其多 毛、痤疮的发生率最低 37(50, ，差异具有统计学意义 P 0(05 。 2(3 和非胰岛素抵抗组分布相似，差异无统计学意义 P 0(05 ;按AR基因所含 CAG重复次数分组，短组CAG在胰岛素抵抗组和非胰岛素抵抗组的分布分别为 39(34,和47(22,，长组CAG在胰岛素抵抗组和非胰岛素抵抗组分布分别为 60(66,和52(78,，两组CAG分布相似，差异无统计学意义 尸 0(05 。 11 天沣医科大学硕士学位论文 结论: 1、PCOS患者具有高雄激素血症、肥胖、胰岛素抵抗的内分泌代谢特征，且高 雄激素血症和高胰岛素血症可以相互影响。远期糖耐量异常的发生率较正常人 群增高，发生糖耐量异常的年龄比预期得可能要早。 2、PCOS患者和对照组的雄激素受体微卫星CAG存在多态性，AR(CAG多态性 虽然不是PCOS患者的决定因子，但重复次数较短的妇女发生PCOS的易感性 可能增加。 3、AR(CAG重复次数与T水平呈正相关，即CAG重复次数越短，AR活性越高， T水平越低;同时较短的CAG重复次数和较高的雄激素水平可影响PCOS患者 的高雄表现，两者具有叠加作用，AR(CAG重复次数的多态性可能是造成PCOS 患者临床表现异质性的原因之一。 4、AR(CAG多态性与高胰岛素血症之间无直接相关性，可能是通过高雄激素血 症间接影响了高胰岛素血症的发牛。 关键词:多囊卵巢综合征高雄激素血症胰岛素抵抗高胰岛素血症AR CAG n重复次数 Abstract Objective: To the roleofthe investigate CAG androgenreceptor on gene repeat polymorphism the formationof polycysticovary itsaussociation syndrome PCOS andwitll and hyperandrogenemia hyperinsulinemia( Method: 97 were patients Decemberto2009 recruited 2008 the August from gynecolo百cal endocrine clinic who as outpatient PCOSascase diagnosed healthv group，60 Volunteerswererecruited ascontrol the were excludedfromother group(Allsubjects anddidnothave endocrinopathy hormonalforthe 3 any monthsbefore therapy past the the PCOS study(For hormonal andinsulin patients，circulating parameters testwere total releasing Tand measured;Serum blood and fasting insulin glucose were carriedincontrol PCOS were groups(The dividedinto patients hyperandrogen ‘lCand normal‘androgenic andII to subgroups I Serumtotal group group according a11drogenlevel，insulinresistanceand non―insulinresistance and subgroups A group B toHOMA-IR(DNAWasextracted group according fromsolidifiedblood clotof PCOS andcontrol patients DNAwasused subjects，thengenomic forPCR ofthe amplification CAGmicrosatellite androgenreceptorgene fragment(Agarose and gel denaturing detected polyacrylamide the gelrespectively products， atlast， ofthe DNAtodetermine sequencing theCAG numbers( repeat Results: 1(Theclinicaland biochemical characteristicsofthe WomcllwithPCOS: 1??1The clinical characteristicsofthe womenwithPCOS:themeanwas age 25(19? 4(87 Was years，BMI 97 26(85?4(56kg,m2;Among patients 60(82,displaved was 60(82,while obesity;Hyperandrogenism61(86,hadinsulin resistant(The overall incidenceofabnormalmetabolismratewas glucose which4(1 27(84,， in 2,( 7(53,and6(1 IG,1 and 9,displayedIFG,IGT adolescentshad abnormal 71(1 glucose metabolism; manifested 3, patients IV 天津医科大学硕士学位论文 andothers showed amenorrhea Oligomenorrhea,l 8(56,patientssecondary displayed or incidenceof were acne， hirsutism menorrhagiabradymenorrhea;The 6,caseswerebilateralorunilateral ovarian 40(2,，19(59,;72(1 polycysticchanges and withtwo resthadnoobviousabnormalities( ovaries 16(49,patients enlarged，the 1(2 were inPCOS thancontrol BMI，T，FPG,FINS，HOMA，HBClhigher group ISIWas differencewere withthe group，whilelower,the significant， consistent clinical featuresofPCOS( 1(3Serum sexhormonesand metabolicfeaturesindifferent glucose groups 1(3(1 tothe level:HOMA―IR、HBCI、IAUC、 FINSwere Accordingandrogen higher inI thanII ISlwas rest no had group group，whilelower P 0(05 ，Theparameters difference( significant 1(3(2 tothe FINSwere inA AccordingHOMA―IR:T，HBCI，IAUC，FPGhigher inA thanB ISlwas islower group group，whilelower P O(05 ;LH，LH,FSHgroup thanB thereisno difference( group，althoughsignificant 2(ne ontheAR CAG nand study repeats ovarysyndrome polycystic 2(1Theoveralldistributionofthe AR―CAG from AR―CAG:The lengthranged repeat 15to32inPCOS in22(23andfrom16to29incontrol patientsmajoring subjects in is22 intwo andthemeanCAG 22，24，20，most majoring repeats groups repeat Wassimilarinboth medianCAG forallallelesWas length length groups(The repeat The weredividedintotwo 23，SO patients groups:shortgroup 一 23 andlong 23 ， basedonthecut-offat23 short distributedinPCOS and repeats(Thegroup group controlwere69(07,and long were30(93, group 60(00, respectively,whilegroup and Wassimilarinboth 40(00,，it groups( 2(2Theassociationof and AR-CAG AR CAG nrepeatshyperandrogenism:The was than thedifferenceWasno repeats I II statistically hi曲el"ingroup group，although testinthe showeda PCOS significant;Correlation significant patients positive correlationbetweentheCAG andtheT theCAG repeats level(Accordingrepeats，the short containedinI andII were62(71and group group were Was than 37(29,and inI lowerII long 21(05,，short group groupgroup group， while inI Was thanII itWasno longgroupgroup higher group，but significant PCOS withacneorhirsutism(hadalowernumberof difference P 0(09 (Inpatients V ne hlrSutlsm??l without and ache PCOS without with patients CAG compared r印eats IleVeI short andeleVated of combinationrepeat PCOS withthe of patients Subgroup the 8ubg删叩 orhirsuti8m锄d withacne cases the 6, of had highestpercentage 62(1 had Tlevel andnon-elevated a of repeat conlbinationlong ofPCOS wi也the pati髓ts thelowest percentage 37(50, ( ( 1nthe and di行打ence hyperinsulinism: No of repeats aSsociationAR CAG n 2(3The was PCOS tound; andB of patientS Aof subgroups meanA艮CAGr印eat1en班s a11d inA B缪oup short contained theCAG group Moreoveraccordingrepeats，the 52(78,, 60??66,and were group long 39(34,and47(22,，respectively,while were inboth jtwasWassimilar groups( Conclusion: ofobesity, characteristlc metabolism and 1(PCOS hadtheendocrinology patients of effect resistance(The hyperandrogeIlism，insulin abno吼a1 0f glucose tobeadditive(Theprevalence appear may hyperinsulinism than be expected?? normal mayyounger washi than people，and metabolic gher inPcOs microsatellite pati铋ts CAG polymorphism is rec印tor 2(Thereandrogen notbeamajor may CAGn lengthpolymorphism aIld repeat contr01伊oup，the to deVelop sensitivly ashorterrepeatmay of wom铋with PCOS，but determinant thel CAG and the repeats between correlation a waS positive 3(There significant the CAG maytogether础 luence shorterrepeats levelsand andrclgen leVel(Higher otthe mereseasons beoneof PCOS(Thismay ofthe pheIlotype hyperandrogenic difference ofPCOS( phenotype ( CAG and be the repeats between noc011relation was 4(There hyperandrogenism?? though hyperinsulinism indirectlv撒ed rd syndrome;insulin s:polycyStic。vary Keywo CAGn receptorr印eats; hyperinsulinemia;androgen Vl 缩略语,符号说明 英文缩写 英文全称 中文全称 PCOS polycysticovarysyndrome多囊卵巢 综合征 IR insulinresistance 胰岛素抵抗 BMI massindex body 体重指数 OGTT oral tolerancetest glucose 口服葡萄糖耐量试验 FINS insulin fasting 空腹胰岛素 FPG flee plasmaglucose 空腹血糖 HOMA―IR Homeostasismode】assessment 稳态模型胰岛素抵抗 ofinsulinresistance 指数 INS(AUC insulinarea underc11rve 胰岛素曲线下面积 ISI insulin index sensitivity 胰岛素敏感指数 IFG impairedfastingglycaemia空腹血糖 调节受损 lGT tolerance impairedglucose 糖耐量减低 DM2 2diabetesmellitus type 2型糖尿病 FSH follicle hormone stimulating 促卵泡生成素 LH hormone luteinizing 促黄体生成素 PRL prolactin 催乳素 E2 es行adi01 雌二醇 P progestin 孕酮 T testosterone 睾酮 AR androgen receptor 雄激素受体 CAG cytosine--adenine??-guanine胞嘧 啶(腺嘌吟(鸟嘌呤 PCR chain reaction polymorphism 多聚酶链反应 0D opticaldensity 光密度 VllI 天津医科大学硕士学位论文 月IJ吾 研究现状、成果 多囊卵巢综合征 PCOS 是妇科最常见的一种内分泌紊乱性 疾病，占育龄 期妇女的5(10,111，以排卵障碍、雄激素过多、肥胖为主要临床特征，高雄激素 血症和胰岛素抵抗是其主要的病理生理基础。远期患妊娠期糖尿病、妊娠期高 血压疾病、II型糖尿病、心血管疾病及子宫内膜癌的风险大大增加。 近年研究发现PCOS具有高度的家族聚集性提示遗传因素在其发病中可能 存在重要作用。随着对细胞信号传导系统研究的深入，发现在PCOS患者发病 环节中存在各种受体的异常。在体内雄激素主要通过雄激素受体 AR 发挥作 用。在雄激素受体第一外显子区包含一个高度多态性的CAG序列，体外实验表 明，AR的转录活性与CAG的重复次数呈负相关，即CAG重复次数越短，AR 尽一致，有时与体外的功能研究相冲突。大样本的研究发现， CAG n的长度在 PCOS组和对照组无明显差别，但CAG重复次数为15或者更少的个体均患有 认为雄激素受体遗传性的改变可能导致了PCOS。同时也有研究得出相反的结 论:即在PCOS妇女中长的CAG等位基因优先表达【5】。由于CAG重复多态性 虽不是PCOS的决定因子，但可能影响脂质代谢。同时对月经初潮后性毛早现 女孩采用多重回归分析发现，出生低体重和短的CAG次数与卵巢性高雄激素血 症和高胰岛素血症相关，且具有叠加作用【7】。循环中游离睾酮和胰岛素抵抗的关 系也受到AR基因多态性的影响。在CAG长度为23时，游离睾酮对胰岛素抵 抗没有或仅有微小的作用;当CAG长度小于23时，随着游离睾酮的增加会增 加胰岛素抵抗的作用，长度越短这种作用越明显;另一方面，当CAG长度大于 23时，游离睾酮的浓度增加会改善胰岛素抵抗，CAG长度越长这种作用亦越明 显[81。另外Van 患者的二氢睾酮、雄烯二酮、促黄体激素 LH 的水平较低，且LH,卵泡刺激素 FSH 的比值也较低，痤疮或者多毛的发牛率较高。AR介导许多细胞过程，比如增殖、 天津医科大学硕士学位论文 的作用及其对高雄激素血症及胰岛素抵抗的形成是否存在影响，仍未明确。为 了明确以上问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 本实验通过对AR CAG n基因多态性与PCOS患者关系的初 中的作用及其对高雄激素血症和高胰岛素血症形成作用。 研究目的、方法 收集2008年12月"-一2009年8月在天津医科大学总医院妇科内分泌门诊就 诊的PCOS患者97例，选择健康志愿者60例为对照组，所有患者均排除其他 内分泌疾患，近3月内未使用激素类药物。所有PCOS患者行血清性激素水平 及胰岛素释放试验检查，对照组测定血清睾酮水平、空腹血糖及空腹胰岛素水 平。从血凝块标本中提取DNA，PCR扩增所有标本的雄激素受体 AR 基因的 CAG微卫星片段，琼脂糖凝胶、变性聚丙烯酰胺凝胶分别检测目的基因产物， 对目的基因测序确定CAG重复次数。以探讨雄激素受体CAG基因多态性在多 囊卵巢综合征 PCOS 发病机制中的作用，及其与高雄激素血症及高胰岛素血 症的关系。 2 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 对象和方法 1(1研究对象 素月经规律，除外高血压、2型糖尿病等家族史的健康志愿者60例为对照组， 年龄1 血症将PCOS患者分为高雄激素组 I组 雄激素水平正常组 II组 ;按照是 否存在胰岛素抵抗分为胰岛素抵抗组 A组 和非胰岛素抵抗组 B组 。 1(1(1诊断标准 1 多囊卵巢综合征的纳入标准参照修正的2003年鹿特丹会议诊断标准n们? 稀发排卵或无排卵?雄激素水平升高的临床 如多毛、痤疮 和 或 生化依 泡，上述3项有任意2项即可诊断，并除外先天性肾上腺皮质增 生症、Cushing 综合征、分泌雄激素的肿瘤等可导致雄激素增多的疾病。 2 高雄激素血症的诊断标准:根据我院特检中心制定的女性 正常血清总睾酮 标准判定，即大于76ng,dl为高雄激素血症。 model 3 IR的的诊断标准:采用稳态模型 Homeostasisassessment， HOMA ofinsulin modelassessment 法计算胰岛素抵抗指数 Homeostasis resistance， mIU,L ，根据全国糖尿病防治组测算的HOMA(IR t2(69判定为胰岛素抵抗??; Under 葡萄糖和胰岛素曲线下面积 Area Curve，AUC 0min值+180min值 X20, FPG一3(5 ，作为评估体内B细胞功能的指标。 DM2。 5 参照WHO2000年国际肥胖特别工作组提出的亚太地区肥胖诊断标准，体 重指数 BMI ?25 kg,m2为肥胖。 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 1(1(2标本采集 所有受试者均排除其他内分泌疾患，近3月内未使用激素类药物，于月经周期2, 4天 闭经者任意一天 抽取静脉血，静置离心后取血清，所有PCOS患者均检 测血清性激素水平及胰岛素释放试验;对照组检测血清睾酮水平及空腹血糖、 空腹胰岛素水平。所有受试者均留取离心后血凝块，以一20"C保存，待提取DNA 行PCR检测。 1(2研究方法 1(2(1主要仪器设备 ACS:180全自动化学发光仪 AbbottAXSYM德国 全自动化学发光免疫分析仪 ADVIACentaur德国 电泳仪 DDY-8C型北京六一仪器厂 一80?低温冰箱 日本三洋公司 微型离心机 BECKMAN美国 电子分析天平 梅特勒(托利多仪器有限公司 水平电泳槽 DDY-8C型北京六一仪器厂 垂直电泳槽 DYCZ(3C型北京六一仪器厂 微波炉 中国海尔公司 核酸蛋白测定仪 BECKMAN美国 PCR扩增仪 PERKIN美国 水平摇床 WD一9405B型北京六一仪器厂 恒温干燥器 909型中国天津海河 高压蒸汽灭菌锅 HY-85型日本尼康公司 Milli(Q超纯水系统 Millipore美国 Innotech美国 数码凝胶成像系统 Alpha 1(2(2主要试剂 riffs碱、Tris酸、丙烯酰胺、N，N(亚甲基 双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、尿素 Sigma公司 硼酸、去离子甲酰胺 北京鼎国 血DNA提取试剂盒 北京天根 DNA引物合成 上海生工 PCRMastermix 北 京天根 2×Taq(Plus 4 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 l DNAMarker 大连宝生 物 00bp DNAMarker 10bp invitrogen 公司 琼脂糖 Sigma公 司 EB Sigma公司 无水乙醇、甲醛溶液、冰乙酸 天津生化厂 1(2(3主要液体配制 节溶液的PH值至8(0，定容至1L，分装后高压灭菌备用。 Tris碱，57(1ml冰乙酸，100ml 2 50×TAE:2429 加双蒸去离子水定容至1000ml，高压灭菌后室温保存。 3 5×TBE:549Tris碱，27(59硼酸，20ml 蒸去离子水定容至1000ml，高压灭菌后室温保存。 4 10,过硫酸铵:0(19过硫酸铵加去离子水lml，分装后4?避光保存。 5 16,聚丙烯酰胺浓缩胶 PA 母液:丙烯酰胺1529，二甲叉双丙烯酰胺89， 400ml，加去离子水定容至1L，4"C保存。 尿素3209，5×TBE 6 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液: 含98,去离子甲酰胺 1O,mmol,L EDTA PH 8(O 0(025,二甲苯青FF O(025,溴酚蓝 7 雄激素受体引物: 7 AGAATCTGTAGAGCGTGC(3 上游引物:5’(TCC TCC 7 下游引物:57(GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT_3 由上海生工有限公司合成 EB加入lml中去离子水中，储存待 用，加入到琼 8 EB的配制:称取10ug 脂糖溶液中使其终浓度为O(5ug,ml。 9 固定液:100ml无水乙醇，50ml冰乙酸，加水至1000ml，摇匀备用。 10 染色液:称取0(29硝酸银加水溶解定容至100ml，摇匀备用，现用现配。 摇匀备用，现用现配。 5 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 1(2(4主要实验方法: 1 内分泌激素指标测定:收集静脉血3--一4ml，静置离心后 取血清，ACS:180 全自动化学发光免疫仪及配套试剂盒测定FSH、LH、PRL、E2、P、T; 2 OGTT实验:在试验前3天正常饮食，试验前一天晚8时后禁食，当日早 Centaur 的浓度。BayerADVlAimmunoassaysystem及配套试剂盒、化学发光法 560快速全自 测定血清胰岛素，以上高、中、低质控均由伯乐公司提供。Bayer 动生化分析仪及配套试剂盒、氧化酶法测定血糖，高、中、低质控由中生北控 科技股份有限公司提供。 3 基因组DNA提取: 本实验采取从分离血清后血凝块提取血样DNA的方法: A、细胞裂解: 11将血凝块标本在乳胶手套中捏碎 15s，10000rpm离心lmin，弃上清。 3 添加500山CL振荡混匀15s，10000rpm离心1rain，弃上清。 PK振荡15s。 4 添加200山GS，20ul 次。 6 添加220I(tl无水乙醇，颠倒混匀10次。 B、核酸吸附: 30s， 弃废液。 7 用枪头将溶液转移至吸附柱CB3 套在收集管中 12000rpm C、漂洗: 1 GD 8 添加5001al2000rpm30s，弃废液。 PW1 30s，弃废液。 9 添加7001al2000rpm 1 PW1 30s，弃废液。 0 添加500p12000rpm 2(5min，空甩去除乙醇。 11112000rpm D、核酸吸附: 2(5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中，此步骤重复2次。 6 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 2(5min收集DNA产物。 13 12000rpm 将DNA产物存放于-20。C冰箱，待检测浓度后，进一步行PCR扩增。 离子水为空白对照，在核酸,蛋白质浓度测定仪上测定OD260、 OD280。?DNA ×稀释倍数。 4 AR基因PCR扩增: 1 PCR引物设计，参照文献[6】设计，由上海生工有限公司合成。 TGC(3’ AGAATCTGTTCCAGAGCG 上游引物:5’(TCC 7 下游引物:57一GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT-3 2 引物配制:将合成的引物在离心机上6000rpm离心3min，使 引物干粉集中到 管底，分别在盛有上下游引物的EP管中加入适量的ddH20，充 分混匀，配制成 的ddH20，配成101aM的工作浓度，于(20?冰箱储存待用。 3 PCR反应体系: 总体系 25t上1 DNA模板 50,100ng 20×PCR―MIX 12(5pl 上游引物 1“l 下游引物 11(d 加水补足至251ai 4 PCR反应条件: 95? 5min J 95? 上 59(5? 5 cyc??es 上 72? 三三!_二 (3 上 7 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 72? 10min 上 4?保存 5 PCR产物检测: 检测PCR产物主要有两种方法:琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯凝胶电泳。 琼脂糖凝胶电泳具有制胶方便、电泳条件不高、电泳设备普通、染色方法简单 等优点，但琼脂糖胶孔径较大，分辨率较低，只能用于分离差异长度差异较大 的PCR产物。 聚丙烯酰胺凝胶胶孔径小，分辨率高，其分辨率精确度可达lbp，但其操作比 较复杂。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿 素等变性剂， 在电泳前先让DNA变性，消除构象对电泳结果的影响，常用于分离和纯化单链 DNA片段。本实验研究的AR基因扩增产物的长度一般在300bp左右，片段之 间差异在l至几十个碱基之间，只有用聚丙烯酰胺凝胶电泳才能完全区分开来。 因此本实验采用两种方法结合起来检测PCR扩增产物，先用2,的琼脂糖凝胶电 泳进行初步检测，主要看有无产物、产物的特异性、 产物量，然后再用变性聚 丙烯酞胺凝胶电泳进行精确的检测。即在加样前先让DNA样品在97"C充分变 性，然后立即放入冰水中冷却，使产物保持单链状态，再用变性聚丙烯酞胺凝 胶进行电泳检测，从而保证了PCR产物在电泳时只按照产物的长度进行分离。 A、琼脂糖凝胶电泳: TAE的锥形瓶中; ?称取0(49琼脂糖干粉加入到盛有20ml ?微波炉中加热lmin至溶化; ?待温度降到60。C时加入1山EB，充分混匀后倒入胶膜中; ?室温放置30min，当胶完全凝固后，小心移去梳子; ?将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液约110ml，高于胶面2mm; ?加样:将59lPCR产物和1“l Buffer 充分混匀后，依次加入凝 6×Loading 胶加样孔内 同时做一个DMAmarker : ?电泳:100V电压电泳约40min，待标记线超过2,3胶面时，结束电泳，取出 凝胶; ?凝胶图像采集及分析:于暗箱式紫外投射仪上进行观察，显示扩增效果， 与标准分子量序列对照鉴定，扫描拍照，产物存放于4"C，待进一步检测。 B、变性聚丙烯凝胶电泳 玻璃板规格20×15mm : 天沣医科大学硕士学位论文 对象和方法 ?电泳玻璃板及间隔板的清洗和处理; 16,的聚丙烯 ?用2,琼脂糖将玻璃板低端开口封好，待其凝固。取12(5ml 酰胺凝胶母液，加入12(5ml去离子水，再加入180I-tl10,过硫酸铵180ml和101al 的TEMED，混匀后立即灌胶。插入合适的梳子，避免气泡产生，室温下聚合2 小时; ?小心拔除梳子，用注射器反复冲洗点样孔，加入适量1×TBE缓冲液; ?预电泳，在50W恒定功率下，预热30耐min; PCR扩增产物，与6ul聚丙烯酰胺上样缓冲液上样缓冲液混匀后97 ?取3“l ?打开电泳仪以200V恒压电泳，直至二甲苯青移至凝胶底部，结束电泳。 ?银染显色剂结果记录:a、电泳结束后，小心分离玻璃板，将凝胶放置在固 定液中，水平摇床上固定10min;b、双蒸去离子水洗胶2遍，每次约20s，洗去 尿素;c、染色液中染色10min 水平摇床上轻摇，避光 ;d、双蒸去离子水漂 洗2次，每次约5s;e、显色液中轻摇直至显色出最后一批带为止:f、双蒸去离 子水洗胶2遍，终止显色;g、采用凝胶成像系统白光灯下拍照，分析各泳道条 带情况，记录条带的大小 用10bpDNAMarker做产物泳动位置的对照，估计扩增 片断的分子量 。 6 CAG序列重复次数 n值 检测系统的建立: CAG序列重复次数 n值 与该序列扩增产物长度成对应关系，为了能估计 所有目的条带11值大小，我们选其中具有代表性的，不同长度的AR等位基因扩 DNA测序 增产物进行测序 送北京天根生物技术有限公司，切胶纯化后在ABl37 仪上测序 作为检验这一测定准确性的参照物。确定CAG重复序列次数 n值 ， 确立AR第一外显子扩增产物碱基数与内含的CAG序列重复次数 n值 的对 应关系。 1(3统计方法 应用SPSSl6(0软件进行统计学处理，计量资料采用i土s表示，两均数比较 采用t检验，组间率的比较采用x2检验;采用Pearson积差进行相关分析，以P O(05为有统计学意义。 9 天津医科大学硕士学位论文 结果 结果 2(1 胰岛素抵抗的发生率为61(86, 60,97 ;糖代谢异常的整体 发生率为 月经过多或经期延长者为10(31, 10,97 ;多毛、痤疮的发生率分别为40(21,、 19(59,，其余表现正常;72(16, 70,97 为双侧或单侧卵巢呈多囊性改变， 16(49, 16,97 为双卵巢增大，其余未见明显异常。 2(2PCOS组与对照组各参数的比较 照组，差异具有统计学意义，符合PCOS的临床特征。见表1(PCOS组糖代谢 异常的整体发生率为27(84,，其中IFG的发生率为4(12,，IGT的发生率为 17(53,，DM2的发生率为6(19,，其中有2例青春期患者糖代谢异常。对照组 无糖代谢异常的发牛。 表1病例组和对照组见各指标比较 i士s 2(3不同分组时各参数比较 10 天津医科大学硕士学位论文 结果 ISI在I组低于II组，差异具有统计学意义。其余各指标差异 均无统计学意义， 见表2(