电化学脱氧核糖核酸传感器进展

电化学脱氧核糖核酸传感器进展 〃综述〃 Ξ电化学脱氧核糖核酸传感器进展 a ,b a红, 计亮年 李 a b ()中山大学化学与化学工程学院 广州 510275 ; 华南师范大学化学系 广州 510631 DNA 传感器的发展在过去短短几年里倍含 DNA 探针分子的搅拌的醋酸缓冲溶液中于 117 V 电化学 1 () () 受重视。它是一种全新的特定 DNA 序列 基因vs. Ag/ AgCl的电位下活化电极 1 min , 然后在 015 (检测技术 , 它与通常的标记 放射性同位素标记 , V 的电位下吸附富集探针分子 2 min , 最后用 0175 - 1 ) mol〃L NaCl 的磷酸缓冲溶液淋洗 10 s , 便对 DNA 荧光标记等探针技术相比 , 具有选择性好 、灵敏 度高 、响应快 、操作简便 、价格低廉等特点 , 可望 探针分子进行了固定 。 用于临床上基因疾病的快速检验 , 用于探讨各种因 庞代文等也发展了一种简便制备 DNA 修饰电极素引起 DNA 损伤的程度和可能的突变机理 , 用于以 的方法 。将 ssDNA 溶液转移至经过抛光 、活化 、超 3 4 ,6 声波清洗的玻碳电极或金电极表 面 , 涂 匀 , DNA 为作用靶的药物研究 。因此 , 虽然电化学 DNA (传感器才有几年的历史 , 但已有了很大的进展 。本 空气中放干 , 无菌 2 次水冲洗 , 充分浸泡 多于 24 ) h, 即得到几乎单分子层的 DNA 修饰电极 。该法制 文将对电化学 DNA 传感器研究进展进行评述 。 得的修饰电极浸泡 3 天 , 信号基本不变 , 表明得到 1 电化学 D NA 传感器原理 电化 学 DNA 传 感 器 是 由 一 个 支 持 DNA 片 段的修饰层相对稳定 , 耐酸能力较强 , 耐碱能力较差 。 () ( 探针的电极和检测用的电活性杂交指示剂 hy2化学吸附法的优点是简单 , 但该法得到的 DNA ) bridization indicator 构 成 。DNA 探 针 是 单 链 DNA 修饰电极仅是相对稳定 , 且不利于分子杂交 。() () ssDNA片段 或者一整条链, 长度从十几个到上 21112 自组装膜法 () 基于分子自组作用 , 在固体表面自然形成高度 千个核苷酸不等 , 它与靶序列 target sequence是 互补的 , 一般多采用人工合成的短的寡聚脱氧核苷 有序的单分子层的方法称自组装膜法 。制备 DNA 修 ) (酸作为 DNA 探针 。通常是将 ssDNA 探针分子修 饰电极多采用巯基化合物在金表面的自组作用 。 7 Maeda 等利用 DNA 的 5′末端的磷酸基与 2 - 饰到电极表面构成 DNA 修饰电极 。由于 ssDNA 与其 互补靶系列杂交具有高度的序列选择性 , 使得这种 羟乙基二硫化合物的羟基反应生成磷酸酯键 , 将反 ssDNA 修饰电极呈现极强的分子识别功能 。在适当 应混合物通过凝胶柱分离 , 得到纯的 5′末端修饰的 的温度 、p H、离子强度下 , 电极表面的 DNA 探针分 DNA , 再通过巯基将修饰 DNA 固定于金电极表面 , 8 ,9 ( 子能与靶序列选择性地杂交 , 形成双链 DNA dsD2得到 DNA 修饰电极 。Hashimoto 等在 ssDNA 5′末) 端修饰巯己基 , 通过巯基将 ssDNA 固定在金电极上 。NA, 从而导致电极表面结构的改变 。这种杂交前 10 ,11后的结构差异 , 可以通过具有电活性的杂交指示剂 则通过巯丁基磷酸在金电极上的有序吸Bard 等 () 来识别 , 这样便达到了检测靶序列 或特定基因附和反应步骤 , 制备出一层有序的链烷磷酸铝膜 , 3 + 的目的 。 膜中含有金属中心离子 Al, 能与带负电的 DNA 链 强烈作用 , 将 DNA 固定于电极表面 , 得到 DNA 修饰 2 D NA 修饰电极的制备及其特点 DNA 修饰电极所使用的基底电极有玻碳电极 ,电极 。 金电极 , 碳糊电极和裂解石墨电极等 。目前制 DNA自组装膜法制得的 DNA 修饰电极 , 表面结构高 度有序 , 稳定性好 , 有利于杂交 , 但对巯基化合物 3 种方法 :修饰电极主要有 吸附法 、共价键合法和 修饰的 DNA 的纯度要求较高 , 分离提纯操作较繁 组合法 。 211 吸附法 琐 。 21111 化学吸附法212 共价键合法 1 ,2Joseph Wang 等 发展了一种简单 DNA 修饰电共价键合法一般分 2 步进行 。第 1 步是电极的 () 活化预处理 , 以引入活性键合基团 ; 第 2 步进行表 极的方法 。将碳糊电极 carbon paste electrode放到 Ξ ()广东省自然科学基金资助课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 顺序号 : 990452 通过共价键合反应把探针分子修饰面的有机合成 ,子传递而使指示剂与电极发生电子交换完成电化学 到电极表面 。反应过程 。 12 , 在氧化的玻碳电极表面 ,研究发现 Millan 等311 杂交指示剂和 DNA 的结合方式与电化学响应 ) (的关系 以一种水溶性的乙基 - 3 - 二甲基丙基碳二亚胺 ( ) () 盐酸盐 EDC和 N - 烃基磺基琥珀酰亚胺 NHS杂交指示剂与 DNA 的结合方式有 3 种基本的模 作偶联活化剂 , 变性的小牛胸腺 DNA 和多聚脱氧鸟 式 。第 1 种是指示剂分子与 DNA 分子的带负电荷的 ( ) ( ) 苷酸多聚脱氧胞苷酸 poly dGpoly dC] 片段 脱氧核糖 - 磷酸骨架之间通过静电作用而相互结合 , () ( ) 即静电结合 electrostatic binding; 第 2 种是指示剂 通过与活化的电极表面 O - 酰基异脲形成磷酰 胺键 共 价 结 合 到 电 极 表 面 , 而 未 变 性 的 小 牛 胸 腺 分子依靠碱基的疏水作用在沟面与 DNA 分子相互作 ( ) 用而结合 , 即面式结合 surface binding; 第 3 种是 DNA 和 多 聚 脱 氧 腺 苷 酸 多 聚 脱 氧 胸 腺 苷 酸 poly () ( ) dApoly dT] 则不能结合上去 。进一步研究表 指示 剂 分 子 依 靠 氢 键 、范 德 华 力 和 堆 积 作 用 插 入 ( 明 DNA 是通过 dG 残基选择性地共价结合到电极表 DNA 分子双螺旋的碱基对之间 , 即插入作用 inter2 ) 面 , 因此他们利用末端脱氧核苷酸转移酶在脱氧核 calation。 15 ,17 (Bard 等研究了外源分子 实质上是杂交指 苷酸 3′末端处用 dG 残基将 ssDNA 共价结合到电极表 ) 示剂与 DNA 之间的相互作用方式对外源分子的循 面 。 13 环伏安行为的影响 , 指出插入指示剂不仅能通过插 方禹之等报道通过硅烷化试剂在石墨电极表 ( ) 入结合与 dsDNA 作用 , 而且也能通过静电结合与 ss2 面导 入 氨 基 - NH, 在 EDC 存 在 下 , - NH与 2 2 DNA 相互作用 , 因此 , 一个适合电化学 DNA 传感器 DNA 的 5′末端磷酸基缩合而共价到电极表面 。 的指示剂应该对 dsDNA 比对 ssDNA 具有更高的选择 共价键合法制备的 DNA 修饰电极 , 得到稳定的 性结合能力 。由于 dsDNA 和 ss DNA对指示剂具有预 修饰层 , 易进行分子杂交 , 但由于电极表面活性位 富集作用 , 因此 , 电流响应增加 。但由于指示剂与 DNA 量因而固定的 点少 , 表面合成又是异相反应 , dsDNA 和 ssDNA 选择性结合能力上有差别 , 因此在 少 , 响应信号较小 。 dsDNA 和 ssDNA 修饰电极上富集程度不同 , 也就是 213 组合法 () 电流响应不一样 , 即插入指示剂对 dsDNA 的选择性该法是将化学修饰剂与电极材料 石墨粉混 14 结合可通过电流的响应而间接地加以测量 。合以制备组合修饰电极 。Millan 等将 18 - 烷基胺 312 杂交指示剂的类型混入碳糊中 , 得到修饰的碳糊电极 。在 EDC 存 在 使用杂交指示剂主要有 2 种类型 。第 1 类是过 下 , 18 - 烷基胺的氨基与 ssDNA 5′末端的磷酸基形 (渡金属配合物 , 例如由平面多吡啶配体 已研究的 成磷酸酰氨 键 , 而 将 DNA 固 定 到 电 极 上 , 或 者 在 ) 主要是 2 , 2 - 联吡啶和 1 , 10 - 邻菲咯啉配位的EDC 和 NHS 共存下 , ssDNA 通过 dG 残基与碳糊电 3 + 2 + 15 ,17 过渡金属 Co和 Os八面体手性配合物和四极中的 18 - 烷基酸结合而修饰到电极上 。 () ( )( )Mn N - 甲 基 吡 啶 基 卟 啉 锰 ? ? 组合法制备的 DNA 修饰电极 , 得到的修饰层稳 18 TMPyP ; 第 2 类是带刚性大平面芳香环化合物 , 定 , 且易于分子杂交 , 响应信号较共价键合法好 , ( 例 道 诺 霉 素 抗 癌 药 物 daunomycin anticancer 但经杂交后形成的 DNA 传感器再生能力差 。当用热 9 ,19 ,21 22 ) (drug、盐酸阿霉素、水溶性 meso - 四 4 的去离子水冲洗时 , 仅在开始的 1 次 、2 次获得满意 23 ) ( ) - 三 甲 胺 基 苯 基 卟 啉 HTMAP、米 托 蒽的效果 , 在进行了多于 2 次杂交后就较难再用去离 2 14 8 24子水再生了。 理想的核酸修饰电极制备方法应、Hoechst 33258等 。 醌 简单 , 得到的 目前的研究发现道诺霉素在 dsDNA 修饰电极上 修饰层稳定 、响应灵敏 、易于杂交 、再生能力强等 。比在 ssDNA 修饰电极上峰电位有比较明显的正移 , 3 杂交指示剂的研究二者的峰电位差约 34 mV , 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 了道诺霉素在与 ds2 杂交指示剂是一类能与 ssDNA 和 dsDNA 以不同 DNA 和 ss DNA的结合方式上有较明显的差别 , 因此 , 方式相互作用的电活性化合物 , 且其还原电位处于 道诺霉素可以用来识别 dsDNA 和 ssDNA , 即可做为 ( DNA 的 电 化 学 窗 口 之 中 + 112 , - 019V , vs.杂交指示剂 。在用它做为指示剂检测靶基因时 , 检 - 8 - 1 - 12) ()SCE。当它与 DNA 结合后 , 发生可逆的氧化还原反 测限达 10 g〃mL 。然而 , 这对低于 pg 级 10 应时 , 可与 DNA 发生电子交换 , 而 DNA 通过远程电 的痕量靶基因分析的要求还有一定的距离 。这主要 与杂交指示剂的选择 、杂交指示剂直接与电极的非, 特定碱基序列的 DNA 在电极表面能否杂交作用下 6 特性吸附 、杂质的干扰等因素有关 。Hashimoto 等及杂交程度的差异 。 26 ,28 在磷酸缓冲底液进行检测 , 从而避免了指示 Hoechst还值得指出的是 , Fawcett 等利用电化学 33258 的非特性吸附和杂质的干扰 。其结果显示 , 靶 石英天平对杂交时间 、杂交温度 、DNA 传感器的再 - 7 - 13 - 1 DNA 的浓度在 10 ,10 g〃mL 范围内与杂交指 生等方面进行了研究 , 获得了较为满意的结果 。示剂电氧化的峰电流线性相关 。 6 展望 4 电化学 DNA 传感器的应用综上所述 , 电化学 DNA 传感器具有重要的理论 人类的遗传病和某些传染病的早期诊断基于已 意义和应用价值 。它被认为是开辟了电化学与分子 知非正常碱基序列 DNA 的测定 。电化学 DNA 传感器 生物学交叉学科的新领域 , 为生命科学的研究提供 了一种新方法 。它将成为生物电化学的一个非常有 可快速检测特定 DNA 序列和痕量基因分析 。 12 ( ) ( ) () Millan 等以 Co bpyClO或 Co phen生命力的前沿领域 。 3 4 3 3 () ( ) ( ) ClO为杂交指示剂 , oligo dT探针经 dG延 今后电化学 DNA 传感器的研究工作将会集中43 20 ( ) 长被固定在玻碳电极上 , 与其互补的 oligo dA杂 () 在 : 1适合于高灵敏检测的杂交指示剂的筛选研 20 () 交后 , 通过循环伏安法 CV测定杂交指示剂响应 () 究 ; 2电极结构的优化 , 稳定的自组装单分子层 的增大来检测靶序列 。杂交后的电极可用热的去离 修饰电极在电化学 DNA 传感器的研究中将会被广泛 子水冲洗而再生 , 反复杂交再生 , 传感器性能稳定 。 () 应用 ; 3电化学 DNA 传感器在疾病基因的诊断上 当使用碳糊电极进行 DNA 传感器的研究时发现 : 在 () 的应用 ; 4电化学石英晶体微天平 DNA 传感器的 ( ) 低的离子强度下 , 杂交缓慢 t ?1 h; 而高的离子 () 研究 ; 5一些药物作为杂交指示剂研究与 DNA 的 ( ) 强度 , 杂 交 快 速 t ?10 min。采 用 高 离 子 强 度 , () 相互作用 ; 6应用电化学 DNA 传感器研究 DNA 的 () poly dA的检出限为 215 ng 。该结果用于选择性 4000损伤因素 。 Δ测定 18 个碱基长度的囊性纤维变性基因 F508 序 列 , 结果满意 。但该传感器难以再生使用 。 参考文献 10 ,111 Wang J , Chicharro M , Rivas G , et al . DNA biosensor for the detec2 ( )Bard 等 将 电 致 化 学 发 光 ECL 与 ss2 tion of hydrazines. Anal Chem , 1996 , 68 : 2251 DAN 修 饰 电 极 相 结 合 进 行 基 因 传 感 器 研 究 。用 2 Wang J , Cai X - H , Rivas G , et al . DNA electrochemical biosensor 2 + () Ru phen标记与探针互补的靶序列 , 杂交后产 3 for the detection of short DNA sequences related to the human immunode2 2 + () 生Ru phen标 记 的 dsDNA , 杂 交 程 度 由 ECL 测 3 ficiency virus. Anal Chem , 1996 , 68 : 2629 3 定 。未用标记的 DNA 杂交 , 通过加入与 dsDNA 发生Pang D - W , Zhang M , Wang Z - L , et al . Modification of glassy 2 + carbon and glod electrodes with DNA. J Electroanal Chem , 1996 , 403 : () 作用的 Ru phen, 测定其 ECL 来检测同源序列 , 3 183 并对 8 个碱基的靶序列进行了检测 。 4 Zhao Y - D , Pang D - W , Wang Z - L , et al . DNA - modified elec2 25 Joseph Wang 等提出以肽核酸代替 ssDNA 探针 trodes. Part 2. Electrochemical characterization of gold electrodes modi2 分子进行基因传感器的研究发现 , 电极表面的肽核 fied with DNA. J Electroanal Chem , 1997 , 431 : 203 酸仍保持其在溶液中专一 、有效的杂交特性 。与 ss25 Pang D W , Abruna H D. Micromethod for investigation of the interac2 tions between DNA and redox - active molecules. Anal Chem , 1998 , DNA 识别层相比 , 肽核酸层使基因传感器具有更优 70 : 3162 越的性能 。他们最近报道了一种用于人类免疫缺陷 6 Brett C M A , Brett A M O , Serrano S H P. An EIS study of DNA - ( ) 病毒?HIV相关的短 DNA 序列测定的传感器 。将 modified electrodes. Electrochim Acta , 1999 , 44 : 4233 来源于 HIV - ?ULTR 序列的含有 21 或 42 个碱基的 2 + 7 Maeda M , Nakano K , Uchida S , et al . Mg- selective electrode 单链寡聚核苷酸部分修饰到碳糊电极上 , 以指示剂 comprising double - helical DNA as receptive entity. Chem Lett , 1994 , 2 + ( )() Co phen的计时电位信号转换模式监测 PSA 1805 3 8 Hashimoto K , Ito K , Ishimori Y , et al . Sequence - specific gene de2 的计时电位峰来测定杂交 , HIV - ?U5LTR 片段的检 - 9 - 1 tection with a gold electrode modified with DNA probes and electrochemi2 出限为 4 ×10 mol〃L 。cally active dye . Anal Chem , 1994 , 66 : 3830 电化学 DNA 传感器也可用于 DNA 损伤的研究9 Herne T M , Tarlov M J . Characterization of DNA probes immobilized on 19。方禹之等利用 ssDNA 分子共价固定在石墨电中 gold surfaces. J Am Chem Soc , 1997 , 119 : 8916 极表面 , 以道诺霉素作为杂交指示剂 , 研究了在不 10 Xu X - H , Yang H C , Mallouk T E , et al . Immobilization of DNA on ( ) an aluminum ?alkanebisphosphonate thin film with electrogenerated () 同致突变 紫外光照射 、亚硝酸作用 、超声波作用 () J Am Chem Soc , 1994 , 116 : 8386 chemiluminescent detection. 中的应用. 高等学校化学学报 , 1998 , 19 9: 1393 11 20 Wang J , Ozsoz M , Cai X - H , et al . Interactions of antitumor drug Xu X - H , Bard A J . Immobilization and hybridization of DNA on an a2 ) ( luminum ?alkanebisphosphonate thin film with electrogenerated daunomycin with DNA in solution and at the surface . Bioelectrochem and chemiluminescent detection. J Am Chem Soc , 1995 , 117 : 2627 Bioenerg , 1998 , 45 : 33 12 21 Millan K M , Mikkelsen S R. Sequence - selective biosensor for DNA Chu X , Shen G - L , Jiang J - H , et al . Voltammetric studies of the based on electroactive hybridization indicators. Anal Chem , 1993 , 65 : interaction of daunomycin anticancer drug with DNA and analytical appli2 2317 cations. Anal Chim Acta , 1998 , 373 : 29 Liu S - H , Ye J - N , He P - G , et al . Voltammetric determination of 13 22 方禹之 , 刘盛辉 , 何品刚. 用盐酸阿霉素作为嵌入剂石墨电极 sequence - specific DNA by electroactive intercalator on graphite elec2 伏安法识别测定 DNA 片段的研究. 高等学校化学学报 , 1996 , () trode . Anal Chim Acta , 1996 , 335 : 239 17 8: 1222 14 23 Millan K M , Saraullo A , Mikkelsen S R. Voltammetric DNA biosensor 庞代文 , 齐义鹏 , 杜全胜等. DNA 与水溶性卟啉 HTMAP 的相 2 () for cystic fibrosis based on a modified carbon paste electrode . Anal 互作用. 科学通报 , 1994 , 39 17: 1606 Chem , 1994 , 66 : 2943 24 刘盛辉 , 何品刚 , 方禹之. 在石墨电极上脱氧核糖核酸与米托 () 15 蒽醌嵌入作用的电化学研究. 分析化学 , 1996 , 24 11: 1301 Carter M T , Rodriguez M , Bard A J , Voltammetric studies of interac2 25 tion of metal chelates with DNA. 2. Tris - chelated complexes of coblt Wang J , Palecek E , Nielsen P E , et al . Peptide nucleic acid probes ( ) ( ) ?and iron ?with 1 , 10 - phenanthroline and 2 , 2 - bipyridine . for sequence - Specific DNA biosensors. J Am Chem Soc , 1996 , 118 : J Am Chem Soc , 1989 , 111 , 8901 7667 (Carter M T , Bard A J . Voltammetric studies of the interaction of tris 1 , 16 26 Fawcett N C , Evans J A , Chien L - C , et al . Nucleic acid hybridiza2 ) ( ) 10 - phenanthrolinecobalt ?with DNA. J Am Chem Soc , 1987 , ( ) tion detected by piezoelectric resonance . Anal Lett , 1988 , 21 7 : 109 , 7528 1099 Rodriguez M , Bard A J . Eletrochemical studies of the interaction of met2 17 27 Okahata Y , Matsunobu Y , Ijiro K , et al . Hybridization of nucleic al chelates with DNA. 4. Voltammetric and Electrogenerated Chemilu2 acids immobilized on a quartz crystal microbalance . J Am Chem Soc , () minescent Studies of the interaction of tris 2 , 2 - bipyridineosmium 1992 , 114 : 8299 ( ) ?with DNA. Anal Chem , 1990 , 62 : 2658 28 Yamaguchi S , Shimonura T , Tatsuma T , et al . Adsorption , immobi2 18 Bard A J . New challenges in electrochemistry and electroanalysis. lization , and hybridization of DNA studied by the use of quartz crystal os2 Pure Appl Chem , 1992 , 64 : 185 cillators. Anal Chem , 1993 , 65 : 1925 孙星炎 , 徐春 , 刘盛辉等. DNA 电化学传感器在 DNA 损伤研究 19 ()本文于 1999 年 10 月 19 日收到 FT - IR 定量分析中多变量校正法的应用 徐新元王伟民 ()上海市药品检验所 200233 1 多变量校正方法由于傅氏红外光谱仪的诞生 , 红外定量分析得 ( ) 到了很大推广 , 由傅氏红外光谱仪可以得到一个具 : 经典最小二乘法 CLS、 多变量校正法包括 ( ) 有高信噪比和线性范围较宽的数字化的红外光谱 , 反最小二乘法 ILS、q - 矩阵 、部 分 最 小 二 乘 法 ( ) ( ) 由此可以用现代统计方法对红外光谱进行分析研究 。 PLS及基本成分回归 PCR。经典最小二乘法和 多变量校正法的引入使得红外定量分析和定性分析 反最小二乘法常常被红外工作者称为 K - 矩阵和 P - 1 的能力得以大大提高。以前认为无法解决的问题 矩阵 。CLS 是指校正模式符合 Beer 定律 , 即光谱吸 现在可以通过红外光谱分析来解决 。这些统计方法 收度被表达为组分浓度的线性函数 。 属于化学统计学的范畴 。由于 FT - IR 包含大量的光 其他几种方法是浓度被表达为光谱强度或强度 谱数据 , 所以 , 用于转变光谱数据为化学信息的化 的线性组合的线性函数 。这些校正方法不受被分析 学统计学近年来成为快速发展的一个领域 。因此 , 光谱中组分数要与校正样品中组分数一致的限制 , 化学工作者对应用定量 FT - IR 分析的各种化学统计 可以使用较少或较多的线性组分来进行校正 。因此 , 方法有个清楚的了解是非常重要的 。 这些方法具有很大的灵活性 。而在 Beer 定律中可能