带His_tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的表达及纯化

带His_tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及纯化 China Biotechnology,2011,31( 4) : 53-59中国生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 杂志 His-tagLip2带的 解 脂 耶 氏 酵 母 脂 肪 酶 * 在 毕 赤 酵 母 中 的 表 达 及 纯 化 ,,汪小锋 申旭光 赵鹤云 孙永川 纪昌涛 闫云君 430074)( 教育部分子生物物理重点实验室 华中科技大学生命科学与技术学院 武汉 6 ×Hi s YlLip2 pPIC9K N-，摘要 将去自身信号肽并且 端带 标签的 基因克隆至表达载体 中电转 GS115 His-YlLip2 。化 获得高效表达脂肪酶 的基因工程菌筛选到的阳性克隆子摇瓶发酵脂肪酶 6 400U / ml。10 L His-YlLip2 活力最高为 对重组毕赤酵母在 发酵罐中表达 的分批补料发酵工艺进 6 ，、pH、。: 行了初步优化探 讨 了 培 养 基温 度 对 生 物 量 和 重 组 蛋 白 表 达 量 的 影 响结 果 表 明采 用 FM22 25? ，pH 5, 0，114 h His-YlLip2 ，培养基诱 导 温 度 为 甲 醇 诱 导 后 的 最 高 酶 活 力 达 到 6 3160U / ml。SDS-PAGE ，38kDa。His-YlLip2 分析表明蛋白的分子量大约为 重组的 经镍柱一步纯 6 95, 43% ，4250U / mg。化后的纯度达到 比酶活达到 高密度发酵 脂肪酶关键词 毕赤酵母 解脂耶氏酵母 组氨酸标签 Q814, 1中图分类号 。( triacylglycerol acylhydrolases,EC 本较低等优点 脂肪酶 3, 1, 1, 3) ,本文采用 毕 赤 酵 母 表 达 系 统将 去 自 身 信 号 肽 ,、、、、 是一类重要的 酯 键 水 解 酶在 食 品洗 涤制 革饲 料6 ×His YlLip2 N-标签的 基因克隆至甲醇并 且 端带 、、、油脂加工有机 合 成生 物 能 源对 映 体 拆 分 和 工 具 酶 pPIC9K GS115 ,诱导 型表达载体 中电转化到 中获得高,1,。等领域 应 用 十 分 广 泛解 脂 耶 氏 酵 母 胞 外 脂 肪 酶 His-YlLip2 ,10 效表 达 的基因工程菌并对重组蛋白在 6 Lip2( YlLip2) 、在水解酯化和转酯反应中都表现出较高 L ,发 酵罐中的高密 度 工 艺 进 行 了 研 究以 期 为 该 脂 ,2,,、的活力在酯合成生物柴油的生产和对映体拆分等 。肪 酶 的 大规模工业化生产和应用奠定技术基础 ,3-4,。领域具有广阔的应用前景 ,5,Y, lipolytica , 野生型的 菌株能产生多种脂肪酶 1材料和方法 YlLip2,分泌到胞 外 的 脂 肪 酶 主 要 是 但 产 酶 量 较 1, 1 材 料 ,6,。 Destain YlLip2 ,低等为了提高 的表达量采用诱变1, 1, 1 P, pastoris GS115 ( his4 ) 、菌 株 和 质 粒 菌 株 YlLip2 的方 法筛 选 到 一 株 高 产 胞 外 脂 肪 酶 的 突 pPIC9K 、E, coli Top10 Invitrogen 质 粒菌 株 均 购 自 公 LgX64, 81。LgX64, 81 ,变 株 以 突变株为出发菌株法国的。Y, lipolytica 。 司菌株为中国科学院微生物所赠送,研 究小组对其进 行 了 大 量 的 工 程 化 改 造构 建 了 一 系 1, 1, 2 试剂及仪器 所有化学试剂均购自 上 海 国 Lip2 列 解脂耶氏酵 母 胞 外 脂 肪 酶 的 多 拷 贝 同 源 表 达 ; 、T4 DNA 药 集团化学试剂有限 公 司限 制 性 内 切 酶连 ,7-9,,。,菌 株使 产 酶 量 得 到 了 较 大 提 高然 而在 毕 赤 酵 、Primer STAR HS DNA 、DNA 接 酶高保真 聚 合 酶凝 胶 回 YlLip2 母 中异源表达 能获得比传统诱变育种和同源表TaKaRa BCA ; 收试剂盒等购自 公司蛋白定量检测试剂 ,5,,、、达 更高的表达量并 且 具 有 蛋 白 纯 度 高纯 化 简 单; 盒购自北京索莱宝科技有限公司基因测序由上海桑 收稿日期: 2010-12-072011-01-25修回日期: 成 *2006AA02020,3 2007AA05Z417,“ 863 计 国 家 ; Gene Pulser尼生物科技有限公司完成?电穿孔仪购自 划 ” ( 2007AA10070,32009AA03Z23) 2、教 育 部 新 世 纪 人 才 基 金 ( NCET Bio-RAD ; 10 L ( BIOTECH-10JGZ) 公司搅拌式发酵罐购070336) 、( 2009CDA04) 6湖北省自然科学基金资助项目 。自上海保兴生物设备工程有限公司蛋白质纯度检 yanyunjun@i lm,a hust, edu, cn,: ,,通讯作者电子信箱 50ml BMGY 500ml 测由 华 中 科 技 大 学 分 析 测 试 中 心 的 高 效 液 相 色 阳性克隆子接种于装有 培养基的 摇 谱 ,30? 。OD= 4 :6 瓶中下 进 行 增 殖 培 养当 吸 光 度 600 Agilent 1100 series) 。( 完成 1, 1, 3N-6 ,,50ml BMMY,28?端 带 时离心收集菌体加入 诱导培养基 引物 用 于 扩 增 去 自 身 信 号 肽 且 × 120 h,24 h His YlLip2 Lip2F : 下继续诱导培养至 每隔 检测发酵液的酶活标签的 基因上下游引物分 别 为 ( 5'- 。 和蛋白质含量 GACGAATTCCATCATCATCA TCATCATGTGTACACCTC 10 L ,8 0? 1, 2, 3发 酵 罐 分 批 补 料 培 养 将 保 存 的 TACCGA-3') Lip2R( 5'-TA TAGCGGCCGCTTAGATACC BMGY 18 : 20h,阳性克隆子接种到 培养基中摇瓶培养 AC AGACACCCTCGG-3') ,其中划线部分分别为引入的 OD= 4 : 6,10% 4至 以 的接种量接入到起始装液量为 600 EcoR I 与 Not I酶 切 位 点; 用 于 鉴 定 外 源 基 因 整 合 P,pastorisAOX1 :5'-GACL BSM FM22 10 L ,基因组 位点的上下游引物为的基础盐培养基 或 的 发酵罐中进行 至 。 TGGTTCCAA TTGACAAGC3 5GCAAATGGCATTC分批补料培养菌体生长阶段和诱导阶段温度分别设定-''-及 TGACATC C-3'。DNA 30? 28? ,500 :80 0 DO ,引物合成和 序 列 分 析 分 别 由 上为 和 搅 拌 速 度 为 转维 持 在 25% ,1 : 3vvm,28% ( w / w) 海生工生物技术有限公司和上海桑尼生物科技有限公以上通气量维持在 流加 氨水 30% ( w / w) pH 5, 0。DO 。和 的磷酸自动控制 为 当 逐渐司完成 YPD、BMGY、BMMY、MD、MM 1, 1, 4,400ml 50% ; 等培养培养基 上升时表明碳源甘油已耗尽补加 的甘油当 Invitrogen 。DO 再次上 升 后,流 加 100%甲 醇 至 罐 中 的 甲 醇 浓 度 为基参考 公司的毕赤酵母表达手册酶活检测 BMMY-B-( 100ml BMMY平板为 罗丹明 橄榄油平板的 0, 5% ( v / v) ,0 : 6h 1, 5 : 3, 5ml / ( L / h) ; 6 : 流速为 24h, 1ml 400l 0, 2% 培养基中加入 橄榄油乳化液和 μ的 的6 : 8ml / ( L / h) , 逐渐提高流加速度到 并一直维持该 流 B) ; 10 L BSM 罗丹明 发酵罐上的基础盐培养基 和微 速至发酵结束,发酵过程中根据 DO 的波动适当调节甲 PTM1 Invitrogen 。,4 : 8h 、量元素 补加液参考 公司的毕赤酵母发醇流速发酵过程中每隔 取样测定菌体湿重 FM22 PTM4 ,酵指导手册和微量元素 补加液参考文献。 酶活和蛋白质含量 ,10,。发酵罐补料培养基: 甘油 50% ( W / V,含 12ml / L1, 2, 4 BSM FM22 HisYlLip2 - 和 培养基 对 表 达 的 影 6 100% ( 12ml / L PTM1 PTM1 PTM4) ;含 的 或BSM FM22 10 L 甲醇 或 响 分别采用 和 两种基础盐培养基为 的 PTM4) 。,, 发酵罐起始培养基控制参数和培养条件保持一致考 1, 2方法His-YlLip2 。 察其对 表达的影响 6 1, 2, 1 Y, lipolytica 1, 2, 5载体的构建与转化 以 基 因 组pH His-YlLip2 采 用对 表 达 的 影 诱 导 6 响 FM22 10 L ,DNA Lip2F Lip2R Lip2 基础盐培养基为 发酵罐起始培养基生长期,为模板利用 和 为引物扩增 基 PCR pMD18-T simple ,pH 5, 0,pH 4, 0,5, 0,,A 载体连接产的 诱 导 期 分 别 设 定 因产物加 后链接 控制 在 为 E, coli Top10 ,物转化 后筛选阳性克隆子插 入 基 因 通6, 0,His-YlLip2 。 考察其对 表达的影响 6 。 1, 2, 6过测序确认对测序正确的克隆子培养过夜后试剂盒His-YlLip2 FM22 表 达 的 影 响 以 基温 度 对 6 10 L ,,EcoR I Not I T4 ,础盐培养基作为 发酵罐起始培养基生长期的温抽质粒经 和 双酶切后用 连接酶连接 30? ,pH 22? ,25? ,pPIC9K ,度控 制 在 诱 导 期 分 别 设 定 为 至用相同内切酶双酶切后的表达载体 中构建 pPIC9KLip2H ,-28? ,His-YlLip2 。成 重 组 质 粒对 重 组 质 粒 进 行 测 序 验 考察其对 表达的影响 6 。pPIC9K-Lip2H Sal I 5ml ,1, 2, 7证将重组 质 粒 用 线 性 化 后取 发 酵 液 至生物 量 与 细 胞 活 力 的 测 定 取 10g 80l GS115 ,4? 8000 10 min,μ与 μ的 感受态细胞混合在电转参数一预先已称重的离心 管 中 下 转 离 心 1 4? 8000 ,为吸尽上 清 液 后 用 无 菌 水 洗 涤 次下 转 离 心 10 min,,( WCW) 。1500V、25F、200弃上清后称重计算细胞湿重细胞活。μΩ 的条件下转化电转后的酵母菌涂 ,11,。 MD 28? 2 : 3 力的检测采用亚甲基蓝染色法,布在 平板上培养 天后挑取单菌落到不 1, 2, 8 12% SDS-PAGE 表达产物的检测与纯化 电泳 YPD-G418 28? 2 :3 ,同浓度梯度 抗性平板上培 养 天 ,R250 HisYlLip2 。-检测表达产物考马斯亮蓝 染色的 6 YPD-G418 ,后将 抗 性 平 板 上 长 出 的 克 隆 子转 移 到 : 100ml 4? ,8000 15 min,纯化发酵液在 转离心 上清通 BMMY-B-28? 2 :3 ,,罗丹明 橄榄油平 板 上培 养 天 后 10kDa Millipore,USA) 50mmol / L ( 过 超 滤 膜 浓 缩 后 与 PCR 挑取有明显水解圈且水解圈较大的克隆子进行 验 Tris-HCl ( pH 8, 0 ) 1 ? 1 ( v / v) 缓冲液 按 混 合 作 为 1, 2, 2 。 高产菌株的筛选与 摇瓶发酵将有 水 解 圈 的证和酶活力筛选 上 样 55 2011,31( 4)is-tag Lip2 : H汪小锋 等带 的解脂耶氏酵母脂肪酶 在毕赤酵母中的表达及纯化 10ml 0, 1%,的样 品将 的 样 品 液 加 到 镍 柱 中 用 添 加 ( w / v) Triton X-100 NTA NTA-0 ,的 缓冲液梯度洗脱缓 0 : 500mmol / L ,冲液的洗脱梯度为 的咪唑洗脱后的收 SDS-PAGE 集液经 超 滤 浓 缩 后 跑 胶 和 高 效 液 相 色 谱 。 检测 1, 2, 9 脂肪酶酶活与蛋白质浓度的测定 脂 肪 酶 活 ,12,。: 性测定采用碱式滴定法操作步骤如下酶活力测 ( ? PVA = 1 ? 3,v / v) 定以橄榄油乳化液 橄榄油 为 底 YlLip2 PCR 1 图 基因的 扩增产物 。 4ml、Tris-HCl( pH8, 5,50mmol / L) 5ml、物底物 适当稀释PCR amplification of Y, lipolytica Lip2 gene Fig, 11ml 10ml 40? ,的 发酵上 清 液 组 成 反 应 体 系水 浴 反 M: DL2000DN A marker; 1: PCR production 应 0, 05。10min( ? = 1?1 ,v / v) 15mmoll / L反应酶 催 化 水 解 产 生 的 脂 肪 酸 通 过 后加入终止液乙醇丙酮 终 NaOH 0, 5% ,。止 滴定测定加两滴 酚酞指示滴定终点在 40? 、pH8, 0 ,的条件下脂肪酶每分钟水解橄榄油产生 1mol / L μ游离脂肪酸所需的酶量定义为一个活力单 位 ( U) 。BCA 蛋白 浓 度 测 定 采 用 蛋 白 浓 度 定 量 检 测 试 。 剂盒 2结果 2, 1pPIC9K-Lip2H 分泌型表达载体 的构建和鉴定 N-6 ×H is YlLip2 去自身信号肽且 端带 标签的 PCR 924bp( 1) 。扩增产物长度为 图 对测序正确因的 基 T pPIC9K ,的 载体阳性克隆子抽质粒并和载体 分别经 IC9K-Lip2H 2pP图 毕赤酵母表达质粒 框架图 EcoR I Not I ,和 双酶切处理后酶连构建分泌型表达载 Fig, 2 Schematic diagam of the Pichia rpPIC9K-Lip2H( 2) 。体 图 expression plasmids pPIC9K-Lip2H 2, 2 高产菌株的筛选与摇瓶发酵 BMMYB--挑取 罗 丹 明 橄 榄 油 平 板 上 有 明 显 水 解 圈His-YlLip2 ,4 。发酵生 产 的 影 响结 果 如 图 所 示发 6 酵 PCR , 且水解圈较大的克隆子进行 验证和表型验证随 + 153 h pH 5, 0 6, 0 ,时诱导 值为 和 时的细胞湿重分别 24 Mut 机选取 株 阳性克隆子做摇瓶发酵筛选酶活 力 444g / L 454g / L,pH 4, 0 152 h 为 和 而 为 时发酵 细 胞 。96 h ( 高的菌株脂肪酶活力在 达到最高值数据未 列 湿重仅达到 400g / L,说明低的诱导 pH 值不利于细胞的 ) ,,250 :出且不同克隆子的脂肪酶活力变化较大在 。pH 5, 0 His-YlLip2 生长诱导 值为 时 的表达量较6 ,高 400U / ml 。96 h 400U / ml之间将 发酵脂肪酶活力达到 148 h 2450U / ml; pH 4, 0 最高脂肪酶活力为 诱导 为 时 # 13。的 克隆子作为以下进一步的实验研究菌株His YlLip2 ,138 h - 的表达量较低诱导 最高酶活力仅6 为 2, 3 BSM FM22 His-YlLip2 和 培养基对 发酵的影响1375U / ml。pH 6, 0 138 h ,诱导 值为 时发酵 酶活力最6 10 L 对比研究了两种基础盐培养基对 发酵罐中毕 高为 1800U / mll。 His-YlLip2 。3 2, 5His-YlLip2 赤酵母的 生 长 和 表 达 的 影 响由 图 诱导温度对 表达的影响 6 6 FM22 : 可 知培养基发酵得到的细胞湿重和脂肪酶活力甲醇诱导期的培养温度是影响外源基因在毕赤酵 BSM 148 h,His-YlLip2 ,,都 明显高于 培养基发酵 脂肪母中表达量的 重 要 因 素 之 一许 多 文 献 报 道 诱 导 阶 6 段 ,2475U / mll,442, 6 g / L。酶 活力最高达到 细胞湿重为 ,13,。 适当降低培养温度能有效提高外源蛋白的表达量 2, 4pH Hs-YlLip2 i诱导 对 表达的影响 6 10 L 30? ,生长阶段控制 发酵罐中培养温度为 诱 导阶10 L pH 5, 0,生长阶段 发酵罐中 控制为 诱导阶段 22? 、25? 28? ,段分别设定温度为 和 考察其对生 pH 4, 0、5, 0 6, 0,分别设定 为 和 考察其对细胞密度和 3 BSM FM22 图 和 培养基对菌体密度 His-YlLip2 和 发酵生产的影响 6 Fig, 3 Effect of BSM and FM22 medium on wet cell BSM: weight and His-YlLip2 fermentation production 6 Lipase activity ( ) ; WCW( ;) ?? FM22: Lipase activity ( ?) ; WCW( ?) His-YlLip2 5 图 诱导温度对菌体密度和 表达的影响 6 Fig, 5 Effect of induction tempeatue on wet cerrll weight and His-YlLip2 fementation poduction rr6 His-YlLip2 4 pH 图 诱导 对细胞密度和 发酵生产的影响 6 ( a) 22? ; ( b) 25? ; ( c) 28? Fig, 4 Effect of induction pH on wet ce weight and ll His-YlLip2 fermentation production 6 ,剧烈搅拌和高 通 气 量 使 得 大 量 细 胞 死 亡降 低 诱 导 pH 4, 0: Lipase activity ( ) ; WCW ( ) ; pH 5, 0: Lipase ? ? 温 activity ( ) ; WCW( 6, 0: Lipase activity( ) ; WCW( ) ; pH )???? ( 6 ) 。120 ,h度可以有效降低细胞的死亡率图 诱导 诱 28? 28% ,22? 导温度为 时约有 的细胞死亡而 时只有 His-YlLip2 ( 5) 表达量图 以及细胞活力的影响物量和 6 10% 。约 的细胞死亡 ( 6) 。5 ,图 由图 可知不同的诱导温度对生物量的影响 2, 6 His-YlLip2 的纯化6 ,His-YlLip2 。较小而对 表达量 影 响 较 大诱 导 温 度 为 6 SDSPAGE -取不同时刻发酵液上清进行 电泳检测 25? 28? His-YlLip2 ,114 h和 时 表达量较高甲醇诱导 6 ( 7 ) ,His-YlLip2 分析图 的 表 达 量 随 发 酵 时 间 逐 步 6 3160U / ml 2450U / ml ( 5b,酶活力最高 分 别 达 到 和 图 ,,。增 加发酵液中杂蛋白含量较少给纯化带来了方便5c) ; 22? His-YlLip2 ,诱导温度为 时 表达量较低甲醇 6 ( 8) ,经 过镍柱纯化后的蛋白呈现单一条带图 蛋白的分 120 h 1450U / ml( 5a) 。诱导 酶活力仅为 图 38kDa Y, poytca ,lili子 量大约为 左,14右,与 野生菌产生的Lip2 。His -YlLip2 肪酶 大小相当将纯化后的 浓 6 , 甲醇诱导 阶 段由 于 细 胞 密 度 的 不 断 增 长 带 来 的脂 缩 ( Zorbax30 0-SCX C-18 后用反相高 效 液 相 色 谱 法 色 谱 代谢压力以及为维持发酵罐中溶氧浓度恒定而造成的 57 2011,31( 4)is-tag Lip2 : H汪小锋 等带 的解脂耶氏酵母脂肪酶 在毕赤酵母中的表达及纯化 8 His6-YlLip2 图 毕赤酵母表达的重组 的 6 图 诱导温度对毕赤酵母细胞活力的影响过程曲线 Fig, 6 Ce viability pofies of ecombined llrlrSDS-PAGE 分析 P, pastoris measured under induction Fig, 8 SDS-PAGE anaysis of ecombinant lr His-YlLip2 produced by P, pastoris temperature of 22? ( ) ,25? ( ) ,28? ( )??? 6 1: Low molecular weight marker; 2: 5l of culture supernatant μ after ) 。柱检测脂肪酶酶液纯度 125 h,eluting by bufferN TA-200; 3: 5l of culture supernatant μ after 125 h 7 SDS-PAGE 图 发酵过程中发酵液上清的 胶分析 Fig, 7 SDS-PAGE analysis of culture supernatant during the fermentation M: Molecular weight marker; 1 : 8: 5l of culture supernatant of μ 27, His-YlLip2 9 图 纯酶的反相高效液相色谱图 6 42,53,66,81,114,125 and 14 8hFig, 9 RP-HPLC profile of the purified lipase 280 nm --,以三氟 乙 酸水乙 腈 流 动 相 梯 度 洗 脱检 His-YlLip2 6 ,25? ,,测柱温 外标法定量检测 结 果 显 示 为 单 一 对 称 ,6, 135 min ( 9 ) ,峰出 峰 时 间 为 图 目 标 蛋 白 纯 度 为 ,,、,制简单能获得较高表达量且蛋白纯度高纯化简单 95, 43% ,His-YlLip2 4250U / mg。的比酶活达 6 。能有效降低生产总成本 BSM 培 养 基 是 毕 赤 酵 母 高 密 度 发 酵 常 用 的 培 养 3讨论 。,、pH 基但该培 养 基 也 存 在 一 些 缺 陷如 盐 浓 度 较 高目前已发现的产脂肪酶的微生物中许多种属都存 5, 5 、大于 易于 造 成 沉 淀易 于 造 成 氮 源 供 应 不 平 衡 ,在多个脂肪酶 基 因从 解 脂 耶 氏 酵 母 基 因 组 数 据 中 ,15,。FM22 “”和 氮源饥饿等缺陷培养基中添加的,4,21 / ,可 以找到 个 羧 酸 酯 酶 脂 肪 酶 的 基 因目 前 已 “硫酸铵 能有效改善氮源供应的不平衡和氮源饥8 。鉴 定 的脂肪酶基因就有 个虽然分泌到胞外的脂肪BSM ”,饿问 题与 培养基相比生物量和脂肪酶的表达YlLip2,酶主 要是 但用 野 生 菌 株 生 产 很 难 保 证 得 到 。,量均得到了不 同程度提高另 外还 有 采 用 低 盐 培 养 。YlLip2 的 脂 肪 酶是单一脂肪酶将编码 的基因克隆/ BSM 基 和 甘 油 磷 酸 钠 钾盐作为磷源替代和改进 的,至毕赤酵 母中表达不仅 可 以 得 到 单 一 脂 肪 酶而 且 发 ,15-16,。报道低盐 培养基虽然前期降低了培养基的电导酵 工 艺 控 率有利于菌体生 ,,95% 4250U / mg,,长但后期会造成盐缺乏需要补加盐份以维持培养基 以 上比 酶 活 达 为步纯化后的纯 度 达 ,,中的营养均衡增加了发酵工艺控制的复杂性最终不 该脂肪酶 的 大 规 模 工 业 化 生 产 和 应 用 奠 定 了 技 术 。/ 一定能提高 外 源 蛋 白 的 表 达 量甘 油 磷 酸 钠 钾 盐 基 BSM ,作 为磷源替代 基础盐中的磷酸和甘油可从根本。、础后期我们还 将 系 统 考 察 溶 氧比 生 长 速 率 以 及 His-YlLip2 醇的补料速率和补料方式对 表 达 的 影 6 ,,响上 解决盐培养基 的 沉 淀 问 题但 这 两 种 化 合 物 用 作 甲,。以期进一步提高表达量降低该脂肪酶的生产成本 ,培 养 基成本较高不利于脂肪酶的大规模工业化生 参考文献 。产 pH 3 : 8,毕赤酵母正常生长的 范围是 最适生长的 ,1 , Hasan ,FShah A A,Hameed A, Industrial applications of pH 5 : 6,pH 一般为 甲醇诱导时的 对蛋白表达量和活 microbial lipases, Enzyme Microb Technol,2006,39 ( 2 ) : 235- 。性以及胞外蛋白酶活性影响较大一般通过降低诱导 251, pH,,, 期的 降低蛋白酶活力减少其对目标蛋白的降解,2 , Fickers P,Benetti PH,Wache Y,et al, Hydrophobic substrate 。从而提高外源蛋白的表达量但该策略不一定适用于 utilisation by the yeasYt arr owia lipolytica, and its ,pH 5, 0 所有的蛋白因为某些蛋白在 低于 时可能稳定 potential ,。His-YlLip2 性急剧降 低导 致 最 终 表 达 量 的 降 低诱 6 applications, FEMS Yeast Res,2005,5( 6-7) : 527-543, pH 5, 0,pH 4, 0 ,导表达的最适 为 降低 至 时生物量和 ,3 , Liu W,Zhao H,Jia B,et al, Surface idsplay of cative lipase ,His-YlLip2 脂肪酶活力 都 较 低主 要 原 因 可 能 是 由 于 6 in ,5,pH 5 : 8,pH 稳定的 范围为 在较低 下不稳定性导致 Saccharomyces cerevisiae using Cwp2 as an ancphrootr ei n, 。了表达量的降低 Biotechnol Lett,2010,32( 2) : 255-260, ,4 , ,,,, a 刘文山徐莉赵鹤云等利用 凝集素在酿酒酵母表面展示 ,温度是影 响 外 源 蛋 白 表 达 的 重 要 因 素 之 一甲 醇 Lip2, ,2008,48 ( 11) : 1543-解脂耶氏酵母脂肪酶 微生物学报 ,诱导时降低温 度 有 利 于 新 生 肽 链 的 正 确 折叠降 低 折 1548, ,,叠压力和菌体死亡率减少蛋白酶分泌降低蛋白酶活 Liu W S,Xu Li,Zhao H Y,et al, Acta Microbiologica ,13,16,,、。 性提高醇氧 化 酶 活 性转 录 水 平 和 蛋 白 稳 定 性Sinica, ,降低甲醇诱导 期 的 温 度 能 有 效 降 低 细 胞 的 死 亡 率但 2008,48( 11) : 1543-1548, His-YlLip2 ,25? 过低的温度并不利于 的表达温度为 6 ,5 , Yu M,Lange S,Richter S,et al, High-level expression HisYlLip2 。-时最有利于 的分泌表达 6 of extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica in 目标产物的复性和纯化对于生物制品的商业化生 Pichia ,产至关重要因 为 生 物 制 品 下 游 的 处 理 过 程 的 成 本 往 ,16,,5, pastoris and its purification and characterization, Protein 50% 。Yu YlLip2 往占到总成本的 以上等报道将 的 Expr C-,。 端加上 组 氨 酸 标 签脂 肪 酶 活 力 较 低 且 不 稳 定 Purif,2007,53( 2) : 255263,- YlLip2 N-6 ,而在 的 端 加 上 个 组 氨 酸 的 标 签脂 肪 酶 ,6 , Destain J,Roblain D,ThonartP , Improvement liofp ase production HisYlLip2 ,-表现出较 高 活 力 和 稳 定 性发 酵 液 上 清 置 6 from Yarrowia lipolytica, Biotechnol Lett,1997,19 ( 2 ) : 105- 4? 1 ,( 放 个 月 以 上酶 活 力 没 有 明 显 降 低 数 据 未 108, 列 ,7 , Pignede G,Wang H J,Fudalej F,et al, Autocloning ) 。C-N-YlLip2 出可能的原因主要是 端相对于 端离 脂 and ,amplification of LIP2 in Y arrowia lipolytica, Appl 肪酶活性中心 较 近组 氨 酸 标 签 影 响 了 脂 肪 酶 的 折 Environ 叠 Microbiol,2000,66( 8) : 3283-3289, 。和阻碍了底物与酶的结合通过镍柱一步纯化可以使 ,8 , Nicaud J M,Madzak ,Cvan den Broek, ePt al, Protein expression His-YlLip2 95% ,脂肪酶的纯 度 达 到 以 上有 效 简 化 了 6 and secretion in the yeasYta rrowia lipolytica, FEMS Yeas tRes, ,。下游纯化的步骤降低了脂肪酶的纯化成本 2002,2( 3) : 371-379, His-tag YlLip2 本文构建 了 高 效 表 达 带 的 的 基 因 ,9 , Fickers P,Fudalej ,FNicaud J M,et al, Selection of new ,10 L 工程菌并对重组蛋白在 发酵罐中的高密度工艺 over- FM22 ,进行了初步研究基础盐培养基为发酵罐上较好 的producing derivatives for thei mprovemnet of xetracellular ,pH 5, 0、培 养 基最 适 的 诱 导 和 诱 导 温 度 分 别 为 lipase 59 2011,31( 4)is-tag Lip2 : H汪小锋 等带 的解脂耶氏酵母脂肪酶 在毕赤酵母中的表达及纯化 lipase from Pseudomonas fuorescens HU380, J Biosci iBoeng,,15, Zhang W,Sinha J,Meagher M M, Glycerophosphate as al 2003,96( 3) : 219-226,phosphorus sourcin e a defined medium for Pichia ,13, Wang Y,Wang Z,Xu Q,et al, Lowering induction temperaturfeor pastoris enhanced opdructon of poygaacturonate yase in recombnantfermentaton, Appl Microbiol Botechno,2006,72 ( 1 ) : 139illliiil- Pcha pastos, ProcessB ochem,2009,44( 9) : 949954,144,iirii- ,14, Aloulou A,Rodriguez J A,Puccinelli ,Det al, Purification ,16, Surribas A,Stahn R ,Montesinos J L,et al, Production of aand biochemical characterization of the LIP2 li pase from Rhizopus oryzae lipase from P ichia pastoris using Yarrowiaalternative lipolytica, Biochim Biophys Acta,2007,1771( 2) : 228-237, operational strategies, J Biotechnol,2007,130( 3) : 291-299, High-level Expression and Purification of Yarrowia lipolytica Lipase Lip2 with Six Hisditine Tags in Pichia pastoris WANG Xiao-feng SHEN Xu-guang ZHAO He-yun SUN Yong-chuan JI Chang-tao YAN Yun-jun ( Key Laboratory of Molecular Biophysics,Ministry of Education,College of Life Science and Technology, HuazhongU niversity of cSience , Technology,Wuhan 430074,China) Abstract The matureY, lipolytica lipase Lip2 gene without the isgnal sequence andwi th a 6 ×Hi s-tag in N-terminal,was ligated into vector p PIC9K, The ercombinant plasmid pPIC9K-Lip2H was linearized by rectriction enzymeS al I,and then transformiednt o Pichia pastoris GS115 bye lectroporation, A clone exhibiting a maximum lipase activity of 400U / ml in shaking flask was chosen for L 10bi oreactor cultivation, The efd-batch fermentation process waspre liminarily optimized, With respect to the effectbsi omonas s and thex peression level of His-YlLip2,the optimal basal salt medium was FM2,2and theo ptimal parameters for ind uction pH 6 and temperature were5, 0 ,25? ,respectively, After 114hm ethanol induction,the lipase activity of His-6 YlLip2 reached thehi ghest value of 3160U / ml, SDS-PAGE analysis showed that the olec umlar weight of the aimed protein was about 38 kDa , Using a Ni-NTA affinity chromatography,the purity of recombinant His-6 YlLip2 reached 9, 543% byo ne-step purification with the psecific activity of 4250U / mg, Key words Pichia pastoris Yarrowia lipolytica His-tag High cell-density fermentation Lipase