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PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死.doc

PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死

不可预知的未来花园
2019-01-11 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死doc》,可适用于医药卫生领域

PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死徐慧敏刘玉茹万琪琳李彦明吴昌维(河南大学淮河医院老年病科河南省开封市 )引用本文:徐慧敏刘玉茹万琪琳李彦明吴昌维PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死J中国组织工程研究():DOI:jissn  ORCID:X(徐慧敏)文章快速阅读:PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死大鼠徐慧敏女年生河南省商水县人汉族年郑州大学医学院毕业主治医师主要从事老年心脑血管疾病方面的研究。中图分类号:R文献标识码:B文章编号:()稿件接受:细胞增殖加快细胞凋亡减少用Lipofectamin转染PTEN基因特异的siRNASD大鼠骨髓间充质干细胞植入心肌梗死模型SD大鼠心肌组织内存活细胞增多心功能改善明显文题释义:基因沉默:双链RNA被特异的核酸酶降解产生干扰小RNA(siRNA)这些siRNA与同源的靶RNA互补结合特异性酶降解靶RNA从而抑制、下调基因表达。PTEN基因:是迄今发现的第一个具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因该基因的突变失活与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关在细胞的生长发育、信号转导和细胞凋亡中起着重要作用。摘要背景:骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死是近年来的研究热点但是心肌梗死区域的缺血缺氧微环境和早期炎症反应不利于移植细胞的存活影响治疗效果。目的:探讨PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的效果。方法:①SD大鼠骨髓间充质干细胞随机分为组空白对照组不进行任何处理阴性对照组用Lipofectamin转染无意义的NCsiRNARNAi组用Lipofectamin转染PTEN基因特异的siRNA。采用MTT法描绘细胞生长曲线流式细胞仪检测细胞周期②取只SD大鼠建立心肌梗死模型随机分为组每组只分别为空白对照组、阴性对照组、RNAi组。建模h后使用微量注射器和立体定位仪在左心室前壁梗死区中心注射相应的骨髓间充质干细胞治疗后周进行超声心功能检测采用荧光显微镜观察细胞的存活和增殖情况。结果与结论:①RNAi组骨髓间充质干细胞在培养各时间点的吸光度值均显著大于空白对照组和阴性对照组②RNAi组SG期细胞占总数的比例显著大于空白对照组和阴性对照组(P<)③RNAi组大鼠心肌组织中骨髓间充质细胞数量显著多于空白对照组和阴性对照组(P<)④治疗周RNAi组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率显著小于空白对照组和阴性对照组(P<)⑤体外实验表明PTEN基因沉默能有效地促进骨髓间充质干细胞的增殖抑制细胞凋亡⑥体内实验表明PTEN基因沉默的骨髓间充质干细胞在心肌梗死区域更易存活和扩增心功能改善明显。关键词:干细胞移植急性心肌梗死第号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因基因沉默骨髓间充质干细胞干细胞移植主题词:心肌梗塞PTEN磷酸水解酶骨髓间质干细胞基因沉默组织工程PTENsilencedbonemarrowmesenchymalstemcelltransplantationforacutemyocardialinfarctionXuHuimin,LiuYuru,WanQilin,LiYanming,WuChangwei(DepartmentofGeriatrics,HuaiheHospitalofHenanUniversity,Kaifeng,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Bonemarrowmesenchymalstemcelltransplantationformyocardialinfarctionbecomespopularizedinrecentyears,buttransplantedcellscannotsurviveandproliferateunderearlyinflammatoryreactionorlocalischemiahypoxiamicroenvironment,eventuallyhamperingthetherapeuticoutcomesOBJECTIVE:ToinvestigatethetherapeuticeffectofPTENsilencedbonemarrowmesenchymalstemcellsonacutemyocardialinfarctionMETHODS:()BonemarrowmesenchymalstemcellsfromSpragueDawleyratswererandomlyassignedtoreceivenotreatment,NCsiRNAtransfectionusingLipofectaminorPTENsiRNAtransfectionusingLipofectaminCellgrowthcurvesweredescribedusingMTTmethodtodetectcellcycleusingflowcytometry()ThirtySpragueDawleyratswereselectedtopreparemyocardialinfarctionmodelsthatwererandomizedintothreegroups(n=pergroup):blankcontrol,negativecontrolandRNAigroupSixhoursaftermodeling,bonemarrowmesenchymalstemcellstransfectedwithnothing,NCsiRNAandPTENsiRNAwererespectivelyinjectedintotheinfarctedcenteroftheleftventricularanteriorwallinthesethreeratgroupsAfterweeks,allratsweresubjectedtocardiacfunctiondetectionusingechocardiography,andthesurvivalandproliferationofbonemarrowmesenchymalstemcellsintheratswereobservedbyfluorescencemicroscopyRESULTSANDCONCLUSION:Comparedwiththeothertwogroups,asignificantincreaseintheabsorbancevaluesatdifferentculturetime,theproportionofcellsinSGphase,andthenumberofbonemarrowmesenchymalstemcellsinthemyocardialtissuewasfoundintheRNAigroup(allP<)Additionally,theleftventricularejectionfractionandleftventricularshorteningfractionweresignificantlyreducedintheRNAigroupthantheblankcontrolandnegativecontrolgroupsatweeksaftercelltransplantation(P<)BothinvivoandinvitroexperimentalfindingsshowedthatPTENsilencingcouldeffectivelyimprovecellsurvivalandproliferationintheinfarctedmyocardiumMoreover,intheinvivoexperiment,anovertimprovementinrat’scardiacfunctionwasachievedSubjectheadings:MyocardialInfarctionPTENPhosphohydrolaseBoneMarrowMesenchymalStemCellsGeneSilencingTissueEngineeringCitethisarticle:XuHM,LiuYR,WanQL,LiYM,WuCWPTENsilencedbonemarrowmesenchymalstemcelltransplantationforacutemyocardialinfarctionZhongguoZuzhiGongchengYanjiu():XuHuimin,Attendingphysician,DepartmentofGeriatrics,HuaiheHospitalofHenanUniversity,Kaifeng,HenanProvince,China 引言 Introduction急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死是一种致命性疾病其发病率呈不断上升趋势。目前临床治疗心肌梗死的方法主要有药物治疗、手术治疗、介入治疗等但是上述方法不能修复或逆转已坏死的心肌无法获得理想的效果。随着干细胞理论和技术的不断发展各种类型干细胞开始应用于治疗心肌梗死。研究表明骨髓间充质干细胞移植后能够分化为心肌细胞替代受损的心肌细胞同时还能分化为血管内皮细胞促进心肌梗死区域的血管再生是目前心肌梗死治疗研究的热点但是仍然有许多问题有待解决其中心肌梗死区域的缺血缺氧微环境和早期炎症反应不利于移植细胞的存活。为提高骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的效果需要通过有效的方式对细胞进行处理以提高其生物学性能。PTEN基因是具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因能有效抑制肿瘤细胞的生长还可以通过抑制Akt途径而使Bcl蛋白表达减少从而促进细胞凋亡。为此实验选择PTEN基因沉默方式对骨髓间充质干细胞进行处理探讨PTEN基因沉默对骨髓间充质干细胞生物学性能的影响及其移植治疗急性心肌梗死的效果。 材料和方法 Materialsandmethods 设计 细胞学体外观察随机对照动物实验。 时间及地点 实验于年至月在河南大学淮河医院实验室完成。 材料雄性SD大鼠只月龄体质量g由上海義森生物科技有限公司提供。SD大鼠骨髓间充质干细胞株由上海信裕生物技术有限公司提供。 实验方法 SD大鼠骨髓间充质干细胞培养 将骨髓间充质干细胞株从液氮中取出放入水浴锅中轻轻摇动让细胞快速溶解用吸管将冻存管中的细胞悬液移至加入DMEM培养液的离心管中离心弃上清添加mLDMEM培养液进行细胞重悬。将细胞悬液接种至培养瓶中加入适量培养液晃动培养瓶使细胞均匀贴壁放入℃体积分数为CO培养箱中进行培养第天进行换液以后每d换液次待细胞长到汇合时进行传代。 细胞分组和细胞转染 将骨髓间充质干细胞随机分为组分别为正常组(空白对照不进行任何处理)阴性对照组(用Lipofectamin转染无意义的NCsiRNA)RNAi组(用Lipofectamin转染PTEN 基因特异的siRNA)。严格按照说明书操作利用Lipofectamin将PTEN基因特异的siRNA瞬时转染至事先接种在孔板的骨髓间充质干细胞中转染d时流式细胞仪检测其转染效率。 MTT法描绘生长曲线 将上述组细胞接种于孔培养板每孔×个细胞分别在培养h添加MTT液在℃体积分数为CO培养箱内孵育h弃掉上清液每孔添加二甲基亚砜置于摇床中振荡min充分溶解结晶物用酶标仪检测各孔在nm波长处的吸光度值并按照结果描绘出各组的生长曲线。 流式细胞仪检测细胞周期 取各组细胞制备单细胞悬液体积分数为乙醇固定添加RnaseA和PI工作液染色上流式细胞仪检测S期G期细胞比例。 心肌梗死模型建立 取只大鼠建立急性心肌梗死模型给予水合氯醛腹腔注射麻醉剪开颈部皮肤分离皮下组织及肌肉暴露气管用套管针行气管穿刺进入气管后拔除针芯连接小动物定压呼吸机实施间歇正压通气沿胸骨左缘肋间逐层剪开皮肤和皮下筋膜剪断第肋打开胸腔暴露心脏利用小圆针及丝线在左心耳下缘约mm处结扎冠状动脉左前降支观察左心室前壁颜色变苍白收缩力减弱则视为造模成功。 骨髓间充质干细胞移植 将只SD大鼠随机分为组每组只分别为空白对照组、阴性对照组、RNAi组。建模h后使用微量注射器和立体定位仪在左心室前壁梗死区中心注射μL(×个)相应的骨髓间充质细胞悬液。 超声心功能检测 治疗前和治疗后周用多普勒超声诊断仪以二维超声和M型超声进行心脏功能检测。每只实验动物均在胸骨旁乳头肌水平以短轴形式测量次取平均值作为该大鼠的心功能数据测量指标为左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(LVFS)。 苏木精伊红染色 骨髓间充质干细胞移植周后取材大鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉剪开胸腔迅速取出心脏制备切片进行苏木精伊红染色。 主要观察指标 ①各组骨髓间充质干细胞的生长曲线。②各组骨髓间充质干细胞SG期细胞百分比。③各组SD大鼠心肌组织形态学变化。④各组SD大鼠心功能指标。 统计学分析 利用SPSS软件完成数据处理。计量资料用 结果 Results 大鼠骨髓间充质干细胞形态 骨髓间充质干细胞散在分布细胞呈多角形或者长梭形活力好可见细胞分裂相(图)。 细胞转染情况 流式细胞术检测细胞转染率达到见图。 各组细胞生长曲线比较 RNAi组在不同时间点的吸光度值均显著大于其他两组(P<)。空白对照组和阴性对照组比较差异无显著性意义(P>)可见PTEN基因沉默之后细胞生长显著加快见表图。表不同时间点各组细胞吸光度值(±sn=A)TableComparisonofabsorbancevaluesofwavelengthnmineachgroupatdifferenttime表注:与空白对照组和阴性对照组比较aP<。 各组细胞周期比较 经流式细胞仪检测RNAi组SG期占总数的比例显著大于空白对照组和阴性对照组(P<)。空白对照组和阴性对照组比较差异无显著性意义(P>)。PTEN基因沉默后细胞周期发生了变化S期和G期细胞比例升高表明细胞分裂、生长速度增加见表图。表各组骨髓间充质干细胞SG期占总数的比例(±sn=)TableProportionofcellsinSGineachgroup表注:与空白对照组和阴性对照组比较aP<。 实验动物数量分析 纳入研究的只SD大鼠均进入最终结果分析未出现死亡或者脱落现象。 各组心肌梗死模型中的骨髓间充质细胞存活和增殖情况 荧光显微镜观察RNAi组的细胞数量显著多于空白对照组和阴性对照组(P<)。空白对照组和阴性对照组比较差异无显著性意义(P>)见表图。PTEN沉默后的骨髓间充质干细胞更有利于在心肌损伤局部的存活和扩增。表各组心肌梗死模型中的骨髓间充质细胞存活和增殖情况(±sn=)TableSurvivalandproliferationofbonemarrowmesenchymalstemcellsinthemodelofmyocardialinfarctionineachgroup表注:与空白对照组和阴性对照组比较aP<。 心肌组织形态学 正常对照组心脏大体标本局部未见苍白缺血及瘢痕形成阴性对照组梗死区中可见新生心肌样细胞呈小岛样分布形态呈椭圆形且与心肌纤维排列方向一致RNAi组梗死区可见更多的此类新生心肌样细胞分布见图。 各组治疗前后超声心功能指标变化 与治疗前比较治疗周时各组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率显著下降(P<)。治疗周RNAi组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率显著小于空白对照组和阴性对照组(P<)。空白对照组和阴性对照组比较差异无显著性意义(P>)见表。表各组治疗前后超声心功能指标变化(±sn=)TableThechangesofultrasonicheartfunctionindexesineachgroupbeforeandaftertreatment表注:与空白对照组和阴性对照组比较aP<与治疗前比较bP<。 讨论 Discussion当前干细胞移植治疗心肌梗死已经得到了较为广泛的应用其临床效果及安全性均得到证实。目前关于骨髓间充质干细胞移植改善心功能的具体作用机制尚缺乏明确的定论。大多数研究认为可能与骨髓间充质干细胞分化为新的心肌样细胞达到修复心肌损伤的效果。经过大量的研究发现单纯实施干细胞移植治疗心肌梗死的过程中由于缺血缺氧微环境和早期炎症反应使能够迁移到心肌缺血区域并存活发挥功能的细胞较少无法获得理想的治疗效果。为提高移植治疗效图大鼠骨髓间充质干细胞培养形态(×)FigureCultureandmorphologyofratbonemarrowmesenchymalstemcells(×)图注:细胞呈多角形或者长梭形活力好可见细胞分裂相。图流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞基因转染情况FigureDetectionresultsofcelltransfectionbyflowcytometry

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