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【doc】 DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究

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【doc】 DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究【doc】 DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究 DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪 实验研究 李玉玲等.DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究?257? ? 论着? DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究 李玉玲,唐俊明.,潘国栋,王家宁?,杨建业.,孔霞.,陈龙 (.武汉大学医学院附属人民医院心内科,湖北武汉430060;东风公司茅箭医院心内科; 郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所,生理教研室) [摘要]目的:研究随着时间延长,DAPI标记问充质干细胞(...

【doc】 DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究
【doc】 DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究 DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪 实验研究 李玉玲等.DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究?257? ? 论着? DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究 李玉玲,唐俊明.,潘国栋,王家宁?,杨建业.,孔霞.,陈龙 (.武汉大学医学院附属人民医院心内科,湖北武汉430060;东风公司茅箭医院心内科; 郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所,生理教研室) [摘要]目的:研究随着时间延长,DAPI标记问充质干细胞(MSCs)的标记率变化.方法:分离培养纯化成年大 鼠骨髓MSCs,DAPI标记.不同时点荧光显微镜观察,计算MSCs中DAPI阳性率.将标记的MSCs移植到缺血下肢 模型动物骨骼肌中,不同时点取材,冰冻切片,观察移植细胞.结杲:标记当天,荧光镜下MSCs胞核呈明亮蓝色荧 光,标记率接近100%,随着培养时间延长,标记率逐渐下降.移植1周和2周组织切片中,可见密集移植MSCs,3 周以后,可检出的DAPI阳性细胞明显减少.结论:DAPI短期标记细胞效率很高,但标记率随着时间延长而迅速下降. [关键词]MSCs;4,6一联脒一2一苯基吲哚;标记细胞;大鼠 [中图法分类号]R329.24[文献标识码]A[文章编 号]1006—9674(2005)05—0257—03 Trae~agstudyofDAPILabeledMesenchymalStemCellsinVivoandinVitroLIYu—hng.一, TANGJun— ming,PANGuo—dong3,et(TheDivisionofCardiovascularDiseases,RenminHospital,Wuhanuniversity.一 ban,Hubei430060,China;TheDivisionofCardiovascularDiseases,MaojianHospital,Don~engAutomobileCompany Shiyan,Hubei442000,China;InstituteofClinicalMedicine,RenminHospital,YunyangMedicalCollege) Abstract:ObjectiveToexplorelabelingefficiencyofDAPIlabeledmesenchymalstemceUs(MSCs)invivoandinvitro, andprovidetechnicalfoundationforthestudyofcellfatedeterminationinthecourseofMSCstransplantationrepairingis— chemicdi~ases.MethodsDAP1wasaddedtotheculturemediumatafinalconcentrationof50r/mlf0r3Ominutes, whentheculturedMSCsinpassage3reached50%confiuency,Forinvitrostudy.MSCswerecollectedduringtheinitial periodandafter1.2,3and4weeks,TheIntensityandpaaemoffluorescence,aswellasthelabehngefficiency. weree— valuatedjustafterlabelingandagainafter1,2,3and4weeks.Thescalewascalculatedbasedonthefractionofpositive MSCstothetotalMSCsattachedtothebottom,Forinvivostudy.1abeledMSCsweretransplantedintoischemichindlimb inrats,andsampleswerecollected1,2,3and4weeksaftertransplantation,Thesetissuesectionswereobservedunder thesamemicroscopeththesamefilter.andthenumber~oflabeledMSCswereevaluated.ResultsDAP1achievedout— standinginitiallabeEngefficiencyfortheculturedMSCs(all100%).However,thelabelingefficiencyafter3,4weeks decreasedto20%and5%forDAPIinvitro.respectively,IntensivelabeledMSCsintissuesectionswereidentified1.2 weeksafterMSCstransplantation,thenumbersoflabeledMSCsafter3weeksdecreasedobviously.ConclusionAnadvan- tageofDAPIisthehighlabelingefficiencyviasimpleprocedure.ThelabeledMSCswereeasilydetected,andtheinitialla— belingefficiencywas100%,However,disadvantageofDAPIisthelossoflabelingintensityduetocellproliferationanddi— vision.DAPImaybeusedonlyforquantitativeanalysisforashortperiod. Keywords:mesenchymalstemcell;DAPI;labeledcells;rat [基金项目]湖北省自然科学基金(2005ABA079) [作者简介]李玉玲(1968一),女,湖北郧县人,副主任医 师,主要从事心血管疾病临床,教学,科研工作,研究方向为 心血管疾病的防治研究. [通迅作者]王家宁(1967一).男,湖北房县人.博士,副 教授,副主任医师,武汉大学医学院硕士生导师,长期从事心 血营疾病临床,教学,科研工作,研究方向:心血管疾病和肿 瘤疾病的基因治疗.E—mail:rywjn@vip.163.corn 间充质于细胞(mesenchymalstemcells.MSCs) 移植为冠心病,脑梗死等缺血性疾病治疗带来希望, 成为目前研究的热点J.细胞移植研究首先需要 有效区分移植细胞与宿主细胞.4,6一联脒一2一苯 基吲哚(DAPI)作为荧光染料,目前被广泛用于标记 移植细胞.然而进行中长期实验,DAPI标记效果如 何,目前尚缺乏报道.因此我们在进行MSCs移植 治疗心肌及肢体缺血性疾病研究之前,为评价其中 远期疗效研究,有必要对DAPI标记的MSCs进行体 ? 258?郧阳医学院(JYMC)2005年l0月,z4(5):257 内外示踪实验. 1材料与方法 1.1材料. 近交系Wistar大鼠,雄性,3,4月龄,250,300 g,湖北省实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK (鄂)2003—0005;实验动物使用许可证号:SYXK (鄂)2004—0021;实验动物技术上岗证:鄂动资字 第420171号;DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血 清(四季青生物技术材料有限公司);胰酶(Sangon 公司);DAPI(Sigma公司);二氧化碳培养箱(Forma Scientific公司);倒置相差显微镜,荧光显微镜(Ni— kon公司). 1.2骨髓MSCs的培养 参考我们以前的研究,采用全骨髓法.供体 鼠腹腔注射肝素5000U,15min后断颈处死,分离 双侧胫股骨中全骨髓,按1×10.细胞/ml接种于含 15%新生牛血清的DMEM培养基中,在37oC,5% CO饱和湿度环境中培养.24h换液以去除未贴壁 的造血干细胞,此后每3—4d换液1次,待贴壁的 成纤维样细胞达到80%融合时1:3传代.经2,3 次传代获得形态均一的MSCs. 1.3DAPI标记 取P3代MSCs,待细胞50%一60%融合时,培 养液中加入DAPI(终浓度50g/m1)孵育过夜后换 液,PBS洗涤培养瓶至少6次,以去除未与细胞结合 的DAPI. 1.4体外示踪实验 标记MSCs的培养瓶用锡纸包裹,避光换液,按 观察时点分为5组,分别于标记后1d,3d,1周,2 周,4周在荧光镜下观察.uV下计数视野中DAPI 阳性细胞,同视野相差镜下计数视野中全部细胞,按 标记率=DAPr阳性细胞数/全部细胞数,计算标记 率. 1.5下肢缺血模型制备 取同种大鼠,10%水合氯醛3.0ml/kg腹腔注 射浅麻醉;无菌条件下,从右侧腹股沟部正中纵向切 皮2,3cm;钝性分离并结扎股动脉及其分支;缝合 皮肤,正常条件下饲养. 1.6体内示踪实验 收集DAPI标记1d的MSCs,调节细胞悬液密 度至1.0×10/ml.取造模1周动物,每只将200 MSCs悬液通过多点注射移植到缺血下肢肌肉内. 于移植3d,1周,2周,4周取移植部位组织,4%多 聚甲醛溶液固定过夜,流水漂洗24h,梯度蔗糖脱 水,连续冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI阳性细 胞. 1.7统计 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 数据以均数? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差(?s)表示.使用 SPSS10.0统计软件进行统计学分析,率的比较采用 Fisher确切概率法,P<0.05为差异有显着性. 2结果 2.1MSCs培养 经过数次换液,悬浮的造血干细胞逐渐被清除, 贴壁MSCs呈现匀一梭形成纤维细胞样形态(图 1).呈集落生长,增殖迅速,一般原代细胞4,5d 可传代,传代细胞2,3d可再次传代. 图 2.2体外示踪实验 荧光镜下,DAPI标记1d的MSCs,胞核可见明 亮蓝色荧光.标记率达100%.随着时间延长,荧 光逐渐转变为黄绿色,亮度进行性减弱,标记率不断 下降,2周时,半数MSCs观察不到荧光,而4周时只 有约5%MSCs可观察到标记(图2,5).比较DAPI 标记MSCs后不同时间点标记效率,各时间点标记 率存在显着性差异(图6). Mscsi)API标记后培养天数 图6DAPI标记MSCs后不同时间标记率的变化 2.2体内示踪实验 荧光镜下,移植1周组织中,可观察到DAPI阳 性的移植MSCs,聚集在注射点周围,胞核呈明亮蓝 李玉玲等.DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究?259? 色.移植2周组织中,DAPI阳性细胞仍然可以清晰 辨认,分布稍分散,视野中移植细胞数量较前增加, 大部分细胞荧光呈蓝绿色,少数呈黄绿色,荧光强度 较前减弱.移植3周和4周组织中,可辨别的DAPI 阳性细胞明显减少,散在分布于宿主肌纤维之间,荧 光呈微弱黄色(图7,9). 3讨论 目前常用的标记方法主要有DAPI标记法,Br- dU标记法,染色体标记法以及基因标记法. BrdU法存在只能标记增殖期细胞,标记细胞不能直 接观察等不足.染色体标记主要将雄性供体动物细 胞移植到雌性动物体内,通过Y染色体杂交区别确 认移植细胞.其优点在于可以终生标记,但也存在 操作繁琐,无法观察活细胞等不足.基因标记法通 过基因转染或直接从转基因动物取材,使被标记细 胞携带GFP等 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因.但目前,实现报告基因在 目的细胞中高效稳定表达仍然存在程序繁琐,实验 周期长,成功率低等困难,而从转基因动物取材又因 为动物来源困难,在国内较少开展.DAPI是一种可 与DNA特异性结合的荧光染料,可以穿透活细胞胞 膜,无明显细胞毒性.DAPI标记细胞由于操作简 便,被标记细胞生命活动无明显影响,可以直接观 察,费用低廉,因此得到广泛使用. 由于荧光物质在激发光长时间照射下,荧光会 淬灭,即荧光漂白(bleach),因此我们在体外示踪实 验中,始终避光操作.每瓶细胞只在其观察时点荧 光显微镜观测一次,最大限度减少荧光漂白现象对 实验结果的影响. 体外实验结果表明,DAPI起初标记率很高(接 近100%),1周内,可维持80%,90%标记率.但 随着标记时间的延长,其标记效率迅速下降.3周 以后绝大多数细胞失去标记.分析DAPI标记率迅 速降低的原因,我们推测主要是细胞分裂的影响. 由于DNA半保留复制的特点,随着细胞分裂,与 DNA结合的DAPI不断被平分到子代细胞中,以至 胞内DAPI含量过低无法被测出.此外还存在细胞 代谢使DAPI变性,失去荧光特征的可能. 国内外研究表明,MSCs对缺血缺氧环境有很强 的耐受能力….本实验中,移植2周时,视野中DA. PI阳性MSCs较1周时增加,表明MSCs在移植部位 增殖.但由于DAPI标记率的迅速下降,3周以后, 大部分移植细胞不能被检测出,给检测,评价MSCs 在移植部位分化情况和命运转变带来困难.因此, DAPI标记细胞只适合2周以内的短期实验,而进行 3周以上的MSCs移植实验,还需要选择基因标记等 长效标记方法. (文中图2,5,7,9见封二) [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1O] [参考文献] GroundsMD,WteJD,Ro~enthalN,eta1.Therole ofstemcellsinskeletalandcardiacmusclerepair[J]. JHistochemCytochem,2002,50(5):589—610. — KhaldiA,AI—SabtiH,GalipeauJ,eta1.Thera— peuticangiogenesisusingautologousbonemarrowstro— malceils:improvedbloodflowinflchronichmbische— miamodel[J].AnnThoracSurg,2003,75(1):204— 209. 潘国栋,王凤婕,吴艳,等.老年骨髓基质细胞移植 治疗急性心肌梗死实验[J].郧阳医学院,2004, 23(2):65—67. KapuscinskiJ.DAPI:flDNA—specificfluorescent probe[J].BioteehHistochem,1995,70(5):220— 233. DorfmanJ,DuongM,ZibaitisA,eta1.Myocardial tissueengineeringwithautologousmyoblastimplanta— tion[J].JThoracCardiovascSurg,1998,l16(5):744- 一 751. ReineckeH,ZhangM,BartosekT,eta1.Survival, integration,anddifferentiationofcardiomyocytegrafts. Astudyinnormalandinjuredrathearts[J].Circula— tion,1999,100(2):193—202. ReineckeH,PoppaV,MurryCE.Skeletalmuscle stemceilsdonottransdifferentiateintocardiomyocytes aftercardiacgrafting[J].JMolCellCardiol,2002,34 (2):241—249. 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