实验二、离心技术及物质代谢实验
一、离心技术
【概念】
根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同,应用离心力使物质分离、浓缩、提纯的
方法
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。
【应用】
分离、提纯、鉴别生物高分子;分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。
【基本原理】
1、离心力
r m a m F 2
ω?=?=,602rpm ?=πω, F 3600转速422r m ???=π F :粒子在离心场中所受的离心力
a :粒子旋转的加速度
m :沉降粒子的有效质量
ω:粒子旋转的角速度
r :粒子的旋转半径(cm)
2、相对离心力
相对离心力:离心力相对于重力的倍数,单位是g
980
2r mg ma G F RCF ω=== RCF(relative centrifugal force) :相对离心力
rpm( revolutions per minute ) :每分钟转速
低速离心时常以转速“rpm ”来表示
高速离心时则以“g ”表示
3、沉降系数(S)
物质在单位离心力场下的沉降速度。
r
dt dr S 21ω?= 单位:Svedberg ,1S=10^-13s
另外,对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子量尚不了解时,
可用沉降系数对其物理特性进行初步描述,将其区别开来,如原核生物的核蛋白体RNA (rRNA )分为5S 、16S 、23S ,即是根据其在离心场中的行为来进行分类。
【离心机的类型和主要构造】
1、类型
2、主要构造
转头,离心管和管帽,制冷系统,真空系统,制动装置,指示表盘
【离心操作的注意事项】
1、使用各种离心机时,必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物,转头中绝对不能装载单数的管子,当转头只是部分装载时,管子必须互相对称地放在转头中,以便使负载均匀地分布在转头的周围。
2、每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限,使用转头时要查阅说明书,不得过速使用。
3、装载溶液时,要根据各种离心机的具体操作说明进行,根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管,有的离心管无盖,液体不得装得过多,以防离心时甩出,造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离心机的离心管,则常常要求必须将液体装满,以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。
4、若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。
5、离心过程中不得随意离开
二、物质代谢实验
工业用离心机
离心机 制备性离心机
实验用离心机
分析
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性离心机
普通离心机:< 6000rpm
高速离心机: 6000~20000rpm
超速离心机:≥20000rpm
【胰岛素对血糖含量的影响及测定】
1、实验目的
(1)通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作用, 即检测家兔 注射胰岛素前后血糖浓度的改变。
(2)掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度的方法。 2、实验原理
(1)胰岛素降血糖的机理
①促进肌肉、脂肪组织对葡萄糖的通透性,促进葡萄糖进入这些细胞; ② 糖原合成↑,糖原分解↓; ③糖有氧氧化↑;
④磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成↓→糖异生↓; ⑤激素敏感性脂肪酶↓→脂肪动员↓。 (2)血糖测定(邻甲苯胺法)
3、实验方法
(1)胰岛素对血糖含量的影响:家兔注射胰岛素前后血糖含量的变化。 ①取饥饿12小时家兔一只,记录体重.
②采取血标本:用二甲苯棉球涂擦家兔耳部,使局部血管扩张,然后用刀片纵行切开边缘耳静脉,让血液自然滴入试管中,收集约2ml
,待血凝固后,分
蓝绿色化合物 (630nm )
羟甲基呋喃甲醛
(羟甲基糠醛)
邻甲苯胺
浓酸溶液
(含有硼酸的冰醋酸)
水浴加热至100℃, 脱水形成
葡萄糖
离血清(3000rpm, 5min,离心后转移上清至一新离心管).
③按家兔体重,腹腔注射1.5单位/kg胰岛素,记录注射时间,待40分钟后,用同样方法取血,分离血清.
④将注射胰岛素前后的血清,分别测定血糖含量。
⑤注意事项
(a)家兔已经饥饿12小时,在采血和注射胰岛素时动作尽量温和。
(b)取耳缘静脉要用刀片纵向割开,从尖部到根部
(c)首次接触使用离心机,离心机使用时一定要配平,并对称放置。受离心机内空间限制,取血要用短试管。
(d)试管一定做好标记。
(2)血糖含量的测定
①取长试管四支,按下表操作
②混匀,置沸水浴中加热10分钟,取出立即置冷水中冷却.
③用630nm波长,以空白管校正吸光度为0,分别测定各管吸光度值.
标准
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液:0.490
注射前:0.641
注射后:0.319
④计算
(测定管吸光度/标准管吸光度)*标准液浓度*100=血糖(mg/100ml)
注射前:130.81mg/100ml
注射后:65.10mg/100ml
标准液:
葡萄糖标准液 0.1 mg/ml
正常参考范围
3.9~6.1mmol/L (人)
130mg/100ml (兔)
【糖酵解中间产物的鉴定】
1、实验目的
检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。
pH7.4磷酸盐缓冲液:提供适宜的pH,必要的金属离子等
CCL3COOH:强酸,使糖酵解的全部酶失活
一碘醋酸:与3-磷酸甘油醛脱氢酶的-SH(必需基团)起反应,使3-磷酸甘油醛脱氢酶失活。
酶-SH+ICH2COOH→酶S-CH2COOH+HI
硫酸肼:磷酸丙糖稳定剂,保护磷酸丙糖不致自发分解,使其不能向其他方向变化。
2,4-二硝基苯肼:与丙糖反应生成相应的苯腙,后者在碱性溶液中溶解呈紫红色,可借此鉴定丙糖之生成。
2、实验方法
(1)取试管3支,编号,按下表进行操作.
(2)记录三管所发生的情况,并加以简要的分析.
3、实验结果
4、注意事项
①成腙反应前,溶液必须先碱化并在室温放置10min,目的是使磷酸丙糖
中的磷酸基水解脱去,生成的颜色比较稳定;
②一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制剂,使用移液管后必须彻底清洗移液管,否则易导致实验失败。
【血清胆固醇测定(酶法)】
1、实验目的
(1)了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。
(2)掌握血清胆固醇测定的临床意义。
2、实验原理
血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE, 70%)和游离型胆固醇(FC, 30%)。胆固醇酯酶(CEH)先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸(FFA),胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)的作用下氧化生成Δ-4--胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶(POD)催化与4-氨基安替比林(4-AAP)和酚反应,生成红色的醌亚胺,其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比,在500nm波长处测定吸光度,与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下:
3、实验方法
(1)标本:不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA抗凝,不可用草酸盐、氟化物。
(2)取试管3支,编号,按下表操作。
混匀后,37℃水浴保温15分钟,在500nm波长处比色,以空白管调零,读取各管吸光度。
标准管吸光度:0.217
测定管吸光度:0.192
(3)计算
ΔA标本
CHO(mmol/L)= ————×标准液浓度ΔA标准
=0.192/0.217*5.17mmol/L=4.574mmol/L 标准液
胆固醇 5.17mmol/L(200mg/dL)
正常参考范围
3.10~5.70mmol/L