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实验二、离心技术及物质代谢实验.doc

实验二、离心技术及物质代谢实验

谢有德
2019-02-27 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《实验二、离心技术及物质代谢实验doc》,可适用于医药卫生领域

实验二、离心技术及物质代谢实验一、离心技术【概念】根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同,应用离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。【应用】分离、提纯、鉴别生物高分子分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。【基本原理】、离心力rmamFω==,rpm=πω,F转速rm=πF:粒子在离心场中所受的离心力a:粒子旋转的加速度m:沉降粒子的有效质量ω:粒子旋转的角速度r:粒子的旋转半径(cm)、相对离心力相对离心力:离心力相对于重力的倍数,单位是grmgmaGFRCFω===RCF(relativecentrifugalforce):相对离心力rpm(revolutionsperminute):每分钟转速低速离心时常以转速“rpm”来表示高速离心时则以“g”表示、沉降系数(S)物质在单位离心力场下的沉降速度。rdtdrSω=单位:Svedberg,S=^s另外,对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子量尚不了解时,可用沉降系数对其物理特性进行初步描述,将其区别开来,如原核生物的核蛋白体RNA(rRNA)分为S、S、S,即是根据其在离心场中的行为来进行分类。【离心机的类型和主要构造】、类型、主要构造转头,离心管和管帽,制冷系统,真空系统,制动装置,指示表盘【离心操作的注意事项】、使用各种离心机时,必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物,转头中绝对不能装载单数的管子,当转头只是部分装载时,管子必须互相对称地放在转头中,以便使负载均匀地分布在转头的周围。、每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限,使用转头时要查阅说明书,不得过速使用。、装载溶液时,要根据各种离心机的具体操作说明进行,根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管,有的离心管无盖,液体不得装得过多,以防离心时甩出,造成转头不平衡、生锈或被腐蚀而制备性超速离心机的离心管,则常常要求必须将液体装满,以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。、若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。、离心过程中不得随意离开二、物质代谢实验工业用离心机离心机制备性离心机实验用离心机分析性离心机普通离心机:<rpm高速离心机:~rpm超速离心机:≥rpm【胰岛素对血糖含量的影响及测定】、实验目的()通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作用,即检测家兔注射胰岛素前后血糖浓度的改变。()掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度的方法。、实验原理()胰岛素降血糖的机理①促进肌肉、脂肪组织对葡萄糖的通透性,促进葡萄糖进入这些细胞②糖原合成↑,糖原分解↓③糖有氧氧化↑④磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成↓→糖异生↓⑤激素敏感性脂肪酶↓→脂肪动员↓。()血糖测定(邻甲苯胺法)、实验方法()胰岛素对血糖含量的影响:家兔注射胰岛素前后血糖含量的变化。①取饥饿小时家兔一只,记录体重②采取血标本:用二甲苯棉球涂擦家兔耳部,使局部血管扩张,然后用刀片纵行切开边缘耳静脉,让血液自然滴入试管中,收集约ml,待血凝固后,分蓝绿色化合物(nm)羟甲基呋喃甲醛(羟甲基糠醛)邻甲苯胺浓酸溶液(含有硼酸的冰醋酸)水浴加热至℃,脱水形成葡萄糖离血清(rpm,min,离心后转移上清至一新离心管)③按家兔体重,腹腔注射单位kg胰岛素,记录注射时间,待分钟后,用同样方法取血,分离血清④将注射胰岛素前后的血清,分别测定血糖含量。⑤注意事项(a)家兔已经饥饿小时,在采血和注射胰岛素时动作尽量温和。(b)取耳缘静脉要用刀片纵向割开,从尖部到根部(c)首次接触使用离心机,离心机使用时一定要配平,并对称放置。受离心机内空间限制,取血要用短试管。(d)试管一定做好标记。()血糖含量的测定①取长试管四支,按下表操作②混匀,置沸水浴中加热分钟,取出立即置冷水中冷却③用nm波长,以空白管校正吸光度为,分别测定各管吸光度值标准液:注射前:注射后:④计算(测定管吸光度标准管吸光度)*标准液浓度*=血糖(mgml)注射前:mgml注射后:mgml标准液:葡萄糖标准液mgml正常参考范围~mmolL(人)mgml(兔)【糖酵解中间产物的鉴定】、实验目的检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。pH磷酸盐缓冲液:提供适宜的pH,必要的金属离子等CCLCOOH:强酸,使糖酵解的全部酶失活一碘醋酸:与磷酸甘油醛脱氢酶的SH(必需基团)起反应,使磷酸甘油醛脱氢酶失活。酶SHICHCOOH→酶SCHCOOHHI硫酸肼:磷酸丙糖稳定剂,保护磷酸丙糖不致自发分解,使其不能向其他方向变化。,二硝基苯肼:与丙糖反应生成相应的苯腙,后者在碱性溶液中溶解呈紫红色,可借此鉴定丙糖之生成。、实验方法()取试管支,编号,按下表进行操作()记录三管所发生的情况,并加以简要的分析、实验结果、注意事项①成腙反应前,溶液必须先碱化并在室温放置min,目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去,生成的颜色比较稳定②一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制剂,使用移液管后必须彻底清洗移液管,否则易导致实验失败。【血清胆固醇测定(酶法)】、实验目的()了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。()掌握血清胆固醇测定的临床意义。、实验原理血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE,)和游离型胆固醇(FC,)。胆固醇酯酶(CEH)先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸(FFA),胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)的作用下氧化生成Δ胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶(POD)催化与氨基安替比林(AAP)和酚反应,生成红色的醌亚胺,其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比,在nm波长处测定吸光度,与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下:、实验方法()标本:不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA抗凝,不可用草酸盐、氟化物。()取试管支,编号,按下表操作。混匀后,℃水浴保温分钟,在nm波长处比色,以空白管调零,读取各管吸光度。标准管吸光度:测定管吸光度:()计算ΔA标本CHO(mmolL)=×标准液浓度ΔA标准=*mmolL=mmolL标准液胆固醇mmolL(mgdL)正常参考范围~mmolL

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