第06章_皮肤性病常用实验室技术

~ 被遗忘的经筋医学~ 第06章_皮肤性病常用实验室技术 第一节 免疫病理检查 1．适应证 大疱性皮肤病、结缔组织病等自身免疫性皮肤病、某些感染性皮肤病及皮肤肿瘤的诊断和鉴别诊断。 2．方法及原理 主要有直接免疫荧光法、间接免疫荧光法（图6-1）和免疫酶标法。 （1）直接免疫荧光法（direct immunofluorescence，DIF）：主要用于检测病变组织中存在的抗体或补体。将冷冻切片组织固定于玻片上，滴加荧光标记的抗人免疫球蛋白抗体或抗C3抗体等，经孵育、清洗等处理后，置于荧光显微镜下观察。若组织中有人免疫球蛋白或C3沉积，则荧光抗体与之结合呈现荧光。 （2）间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）：主要用于检测血清中存在循环的自身抗体，并可作抗体滴度测定。底物取自正常人皮肤或动物组织（如鼠肝切片），将患者血清滴于底物上，再滴加荧光标记的抗人免疫球蛋白抗体等，荧光显微镜下观察。若血清中存在循环的特异抗体，荧光标记的抗人免疫球蛋白抗体与结合到底物上的抗体结合，呈现荧光。 图6-1 （3）免疫酶标记法：有多种不同的检测系统和方法，机制与间接免疫荧光法类似，但显示系统为可催化成色反应的辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。主要标记细胞的某种特异性成分，用于肿瘤的鉴别诊断。 3．标本处理 直接免疫荧光检查需将皮肤标本用湿润的生理盐水纱布包裹，4℃下尽快送检。多数免疫酶标法可用普通病理方法制备的石蜡包埋的组织块作为检验材料。 4．结果 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 （1）直接免疫荧光：荧光显示的部位通常为棘细胞膜、皮肤基底膜带及血管壁。天疱疮皮损棘细胞间IgG、IgA、IgM或C3呈网状沉积，皮肤基底膜带阳性可见于红斑狼疮、大疱性类天疱疮，血管壁内免疫球蛋白或补体沉积可见于血管炎和红斑狼疮等。 （2）间接免疫荧光：可测定血清中自身抗体的性质、类型和滴度，对诊断、鉴别诊断、观察病情变化和药物疗效有指导意义。如结缔组织病中抗核抗体的类型可分为周边型、均质型、斑点型及核仁型，不同型各有其特殊意义。红斑狼疮中的抗dsDNA抗体、天疱疮中的抗棘细胞抗体等对疾病活动情况具有重要参考意义。 第二节 真菌检查 1．采集标本 浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75％的乙醇消毒。深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本时应注意无菌操作。 2．检查方法 真菌检查的方法主要有： （1）直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。取标本置玻片上，加一滴10％KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热，待标本溶解，轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。可用于检查有无菌丝或孢子（图6-2），但不能确定菌种。 图6-2 （2）墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。方法是取一小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，盖上盖玻片后直接镜检。 （3）涂片或组织切片染色：涂片染色可更好地显示真菌形态和结构。革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等；瑞氏染色适用于组织胞浆菌；组织切片通常用PAS染色，多数真菌可被染成红色。 （4）培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（Sabouraud agar）上，置室温或37℃培养1～3周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌落的形态（图6-3）及显微镜下形态判断，对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。 图6-3 第三节 变应原检测 变应原检测用于确定过敏性疾病患者的致敏物质，特别是对明确职业性皮肤病的病因有重要意义，有助于指导预防和治疗。变应原检测可分为体内试验和体外试验。 （一）斑贴试验（patch test） 1．适应证 接触性皮炎、职业性皮炎、手部湿疹、化妆品皮炎等。 2．方法 根据受试物的性质配制适当浓度的浸液、溶液、软膏或原物作为试剂，置于4层1cm×1cm的纱布上，贴于背部或前臂曲侧的健康皮肤，其上用一稍大的透明玻璃纸覆盖，再用橡皮膏固定边缘。同时作多个不同试验物时，每两个之间距离应大于4cm。同时必须设阴性对照。目前多用市售的铝制小室斑试器进行斑贴试验。 3．结果及意义 24～48小时后观察。受试部位无反应为（－），出现痒或轻度发红为（±），出现单纯红斑、瘙痒为（＋），出现水肿性红斑、丘疹为（＋＋），出现显著红肿、伴丘疹或水疱为（＋＋＋）。阳性反应说明患者对受试物过敏，但应排除原发性刺激或其他因素所致的假阳性反应，假阳性反应者将受试物除去后，皮肤表现很快消失，而真阳性反应除去受试物后24～48小时内皮肤表现往往可增强。阴性反应则表示患者对试验物无敏感性。 4． 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 ①应注意区分过敏反应及刺激反应；②阴性反应可能与试剂浓度低、斑试物质与皮肤接触时间太短等有关；③不宜在皮肤病急性发作期作试验，不可用高浓度的原发性刺激物作试验；④受试前2周和受试期间服糖皮质激素、受试前3天和受试期间服用抗组胺类药物均可出现假阴性；⑤如果在试验后72小时至1周内局部出现红斑、瘙痒等表现，应及时到医院检查。 （二）皮内试验（intracutaneous test） 1．适应证 用于测试Ⅰ型（如青霉素试验）和Ⅳ型变态反应（如结核菌素试验）。 2．方法 一般选择前臂屈侧为受试部位，局部清洁消毒后取配制好的皮试液进行皮内注射，形成直径为0.1ml的皮丘。 3．结果 15～20分钟后观察结果。受试部位无反应为（－），出现红斑直径＞1cm、伴风团为（＋），直径2cm、伴风团为（＋＋），直径＞2cm、伴风团或伪足为（＋＋＋），6～48小时后出现反应并出现浸润性结节为迟发反应阳性。 4．注意事项 ①宜在病情稳定期进行；②应设生理盐水及组胺液作阴性及阳性对照；③结果为阴性时，应继续观察3～4天，必要时3～4周后重复试验；④有过敏性休克史者禁用；⑤应做好抢救准备，以对应可能发生的过敏性休克；⑥受试前2天应停用抗组胺药物；⑦妊娠期应尽量避免检查。 第四节 滤过紫外线检查 滤过紫外线（Wood灯）是高压汞灯发射出的波长为320～400nm的光波，可用于色素异常性皮肤病、皮肤感染及卟啉病的辅助诊断，也可观察疗效。 1．方法 在暗室内将患处置于Wood灯下直接照射，观察荧光类型。 2．临床意义 色素减退、色素脱失或色素沉着性皮损更易与正常皮肤区别。假单胞菌属感染发出绿色荧光，铁锈色小孢子菌、羊毛状小孢子菌等感染为亮绿色荧光，黄癣菌感染为暗绿色荧光，马拉色菌感染为棕色荧光，紫色毛癣菌和断发毛癣菌感染无荧光。皮肤迟发性卟啉病患者尿液为明亮的粉红－橙黄色荧光，先天性卟啉病患者牙、尿、骨髓发出红色荧光，红细胞生成性原卟啉病患者可见强红色荧光。局部外用药（如凡士林、水杨酸、碘酊等）甚至肥皂的残留物也可有荧光，应注意鉴别。 第五节 性病检查 （一）淋球菌检查 1．方法 （1）标本采集：用含无菌生理盐水的藻酸钙棉拭子，伸入男性尿道2～4cm，轻轻转动取出分泌物；女性先用无菌的脱脂棉擦去阴道内粘液，用无菌的藻酸钙脱脂棉拭子插入宫颈内1～2cm处旋转取出分泌物；患结膜炎的新生儿取结膜分泌物；全身性淋病时可取关节穿刺液；前列腺炎患者经按摩取前列腺液。 （2）直接涂片：主要用于急性感染患者。涂片2张，自然干燥、加热固定后作革兰染色，油镜下检查。 （3）细菌培养：标本立即接种于血琼脂或巧克力琼脂平板上，置于含5％～10％的CO2孵箱，37℃孵育24～48小时后观察结果。挑选可疑菌落作涂片染色镜检，也可用氧化酶试验或糖发酵试验进一步证实。 2．结果 涂片染色镜检可见大量多形核细胞，细胞内外可找到成双排列、呈肾形的革兰阴性双球菌（图6-4）。在培养皿上可形成圆形、稍凸、湿润、光滑、透明到灰白色的菌落，直径为0.5～1.0mm。生化反应符合淋球菌特性。 图6-4 3．临床意义 直接涂片镜检阳性者可初步诊断，但阴性不能排除诊断；培养阳性可确诊。 4．注意事项 ①取材时拭子伸入尿道或宫颈口内的深度要足够；②男患者最好在清晨首次排尿或排尿后数小时采集标本进行培养；③涂片时动作宜轻柔，防止细胞破裂变形，涂片的厚薄与固定及革兰染色时间要合适。 （二）衣原体检查 1．细胞培养法 将每份标本接种于3个培养瓶（为McCoy单层细胞管）中，置37℃吸附2小时后，用维持液洗涤2～3次，最后加生长液，37℃培养3～4天，取出盖玻片，经吉姆萨染色或直接荧光染色后镜检。阳性标本碘染色包涵体呈棕黑色，吉姆萨染色呈红色。有尿道炎症状，再加上衣原体分离培养阳性者可确诊。 2．衣原体抗原检测法（clearview chlamydia，简称C-C快速法） 用商品试剂盒检测，方便、简单、快速，但稳定性略差。按说明书操作，质控窗和结果窗均显示一条蓝带为阳性结果，阴性为结果窗无变化。阳性结果结合临床可确定沙眼衣原体感染，阴性时不能完全排除，可用细胞培养法确定。 3．免疫荧光法 采集标本同淋球菌检查。将标本涂于玻片凹孔或圆圈中，干燥处理后加荧光素标记的抗沙眼衣原体单克隆抗体试剂，反应、封固后置显微镜下检查。阳性标本在高倍镜下可见上皮细胞内的原体颗粒，为单一、针尖大小、明亮的绿色荧光，在油镜下为荧光均匀、边缘光滑的圆盘样结构，也可见网状体等其他形态的衣原体颗粒。 （三）支原体检查 采集标本同淋球菌检查，也可用10ml中段尿离心（2000r／min，10min），取沉渣接种于液体培养基。置5％～10％CO2环境中，37℃培养24～72小时，每日观察颜色变化。如由黄色变为粉红色，可能有解脲支原体生长。取0.2ml培养物接种到固体培养基上，培养48小时后观察，有典型“油煎蛋”状菌落者为阳性，可诊断支原体感染。 （四）梅毒螺旋体检查 1．梅毒螺旋体直接检查 可取病灶组织渗出物、淋巴结穿刺液或组织研磨液，用暗视野显微镜检查，也可经镀银染色、吉姆萨染色或墨汁负染色后用普通光学显微镜检查，或用直接免疫荧光检查。 梅毒螺旋体菌体细长，两端尖直，在暗视野显微镜下折光性强，沿纵轴旋转伴轻度前后运动（图6-5）。镀银染色法示螺旋体呈棕黑色，吉姆萨染色法螺旋体呈桃红色，直接免疫荧光检查螺旋体呈绿色荧光。镜检阳性结合临床表现、性接触史可确诊。 图6-5 2．快速血浆反应素环状卡片试验（rapid plasma reagin test，RPR） （1）原理：为非梅毒螺旋体抗原血清试验。人体感染梅毒螺旋体一定时间后，血清中产生一定数量的心磷脂抗体，可用免疫学方法检测，作为梅毒的诊断筛选试验。 （2）操作方法：①卡片定性试验：取50μl待检血清加入卡片的圆圈内并涂匀，用专用滴管加入摇匀的抗原1滴，将卡片旋转8分钟后立即观察结果，出现黑色凝聚颗粒和絮片为阳性；②卡片定量试验：用等量盐水在小试管内作6个稀释度，即1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32，每个稀释度取50μl血清加入玻片圆圈中，按定性法测定。 类似方法还有性病研究实验室试验（venersal disease research laboratory test，VDRL）、不加热血清反应素试验（unheated serum reagin test，USR）等。 （3）临床意义：本试验敏感性高而特异性低。结果为阳性时，临床表现符合梅毒，可初步诊断。定量试验是观察疗效、判断复发及再感染的手段。假阴性常见于一期梅毒硬下疳出现后的2～3周内、感染梅毒立即治疗、晚期梅毒或二期梅毒的“前带现象”。假阳性常见于自身免疫性疾病、麻风、海洛因成瘾者、少数孕妇及老人。 3．梅毒螺旋体颗粒凝集试验（treponema pallidum particle agglutination test，TPPA） （1）原理：为梅毒螺旋体抗原血清试验。将从感染家兔睾丸中提取的梅毒螺旋体纯化，并以超声粉碎后作为抗原，以明胶颗粒为载体。 （2）临床意义：阳性结果可明确诊断。类似方法有梅毒螺旋体血凝试验（treponema pallidum particle hemagglutination assay，TPHA）、荧光螺旋体抗体吸收试验（fluoresent treponemal antidody-absorption test，FTA-ABS），后者特异性更高，因抗原制备复杂，已很少采用。梅毒螺旋体抗原血清试验常呈持久阳性，不可用于观察、判断疗效。 （五）杜克雷嗜血杆菌检查 1． 直接涂片 在开放的溃疡中不易查到细菌，所以最好从淋巴结潜行穿刺取材，一次推涂成片，以保持细菌的特征性排列方式。革兰染色可见呈鱼群状排列的杜克雷嗜血杆菌，阳性即可作出初步诊断，但容易出现假阴性或假阳性，特异性和敏感性可能都低于50％。 2．细菌培养 用含血清和低浓度万古霉素的选择培养基培养24～48小时后观察，菌落直径1～2mm，色灰黄、凸起、粗糙并能在培养基上推动，取菌落镜检或做生化反应可确诊，还可做药敏试验。 3．其他方法 单克隆抗体进行免疫荧光快速检测的阳性率可达93％；DNA探针检测的特异性和敏感性均较高。 （六）醋酸白试验 人类乳头瘤病毒感染的上皮细胞与正常细胞产生的角蛋白不同，能被冰醋酸致白。以棉签清除局部分泌物后，蘸5％冰醋酸涂在皮损及周围正常皮肤黏膜，2～5分钟后皮损变为白色、周围正常组织不变色为阳性。 （七）毛滴虫检查 在阴道后穹隆、子宫颈或阴道壁上取分泌物混于温生理盐水中，立即在低倍镜下镜检，如有滴虫时可见其呈波状移动。男性可取尿道分泌物、前列腺液或尿液沉渣检查。 第六节 蠕形螨、疥螨和阴虱检查 （一）蠕形螨检查 1．挤刮法 选取鼻沟、颊部及颧部等皮损区，用刮刀或手挤压，将挤出物置于玻片上，滴一滴生理盐水，盖上盖玻片并轻轻压平，镜检有无蠕形螨。 2．透明胶带法 将透明胶带贴于上述部位，数小时或过夜后，取下胶带贴于载玻片上镜检（图6-6A）。 （二）疥螨的检查 选择指缝、手腕的屈侧等处未经搔抓的丘疱疹、水疱或隧道，用消毒针头挑出隧道盲端灰白色小点置玻片上，或用蘸上矿物油的消毒手术刀轻刮皮损6～7次，取附着物移至玻片上，滴一滴生理盐水后镜检（图6-6B）。 （三）阴虱的检查 用剪刀剪下附有阴虱和虫卵的阴毛，以70％乙醇或5％～10％甲醛溶液固定后放在玻片上，滴一滴10％KOH溶液后镜检（图6-6C）。 图6-6 第七节 分子生物学技术 分子生物学技术飞速发展，为生物医学研究提供了非常便利的条件。对于临床实际应用，目前最有前景的是PCR技术和基因芯片技术。 （一）PCR技术（polymerase chain reaction，聚合酶链反应） PCR是用于体外选择性扩增特异性核酸片段的一项技术，是在模板DNA、引物、四种脱氧核糖核苷存在的条件下，体外模拟依赖于DNA聚合酶的DNA酶促合成，由变性、退火、延伸等三个连续步骤周而复始、反复循环的过程。扩增DNA片断的特异性是由引物与模板DNA结合的特异性所决定的。PCR技术可广泛应用于感染性皮肤性病及某些遗传病的诊断。 （二）基因芯片技术 基因芯片（genechip）又称DNA芯片（DNA Chip），或称DNA阵列（DNA array）。其原理是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，最后利用计算机软件对每点上的荧光信号做出比较和检测。目前基因芯片技术多应用于研究，临床的实际应用还有待于其成本的大幅减低和技术的进一步完善。（高天文） PAGE 经筋医学 1 是一部传自古老医学的智慧宝藏，探讨人体结构有别于现代医学，经筋医学以整体结构论局部病理变化。