功能因子冬虫夏草多糖的研究开发

《中国食品添加剂 China Food Additiv 1999 No ． 2 一 乙 功能因子冬虫夏草多糖的研究开发 ／ 袁建国 程显好、侯永勤 孙 玲 庄志发 1 (山东省食品发酵工业研究设计院 济南，2500 3) 、 ) 摘要：本文对冬虫夏草多糖的组分组成、理化性质、结构连接特性、毒理学性质及药理活性进行 了研究，并确定 了 可作为保健食品中功能因子的虫草多糖的生产工艺。 关键词：冬虫夏草，虫草多糖，功能因子 ， — — — — — — ～ r — — — — — 一 r — — — — — 一 V 、f 安 录 品 l 前 言 保健食品发展到今天已经过三个阶段， 第三代保健食品是最新一代保健食品，它区 别于第一、二代保健食 品的一个显著特点 是 ，须 明确其所含 的功 能 因子的结构 、含量 及其作用机理。 目前市场上第三代产品占极 少数，而且功能因子多数从国外引进，缺乏 我们 自己的系统研究工作。 冬虫夏草作为我国传统名贵的强壮滋补 品，在历 史上很早就引起 重视和应用 ，近年 来由于国家的重视和商业经济的需求，对冬虫 夏 草 的研究 、 生产 和 应 用取 得 了 迅 速 的 发 展。虫草多糖作为虫草中含量最高的生理活 性物质 ，也是其主要 活性 成分之一 。本文对 冬虫夏草 多糖进行深入 系统的研究 ， 旨在开 发出可用于保健食品生产的功能因子，对冬 虫夏草多 糖的组分组 成、理化性质 、结构连 接特性 、毒理及药理 活性， 以及虫草 多糖生 产工艺进 行了研究 。 2 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 2．1 原料 冬虫夏草菌丝体 由山东智灵生物工 程有 限公 司提 供 ，所用其 它药 品为分 析纯药品 。 2．2 影响冬虫夏草多糖提取的因素 采用正交试验测定了温度．盐浓度、加 水量、提取时间4个因素对虫草多糖提取的 影响 ．确 定了虫草 多糖提取 的工艺。 2．3 虫草多 糖的分离纯化 一 1 8 — 2．3．1 乙醇分级分 离 用 1％ 的 虫 草多 糖溶 液 ，离 心去 沉 淀， 以无水 乙醇分级沉淀 虫草多糖 。当乙醇浓度 达到 4O％ 时，开 始 有大 量 沉 淀产 生，将 沉 淀离心、干燥，制备出来。继续加乙醇，依 次使乙醇浓度递增 5％，每一级沉淀都离心 制备出来，直至沉淀完全。乙醇 浓度达到 75％ 时基本沉淀完全，共分出8个分级组分。 对 各 级 的 乙 醇 沉 淀 物 以 Sephadex G —l00柱层 析检 测 分 子量是 否 均 一 结 果 只有 40％ 乙醇浓度下沉淀的多糖组分 为单 一 峰， 即分 子 量 基 本 均 一， 定 名 为 PC I 其它 7个组分皆为多峰，是多组分 的 混合物。所 以将不纯的 7个分级组分合并后 (PC Ⅱ )进行进一步 的分离纯化 。 2．3．2 PC Ⅱ 的 DEAE—Biogel A层析 将 PC Ⅱ 多 糖 组 分 进 行 了 初 步 的 Sephadex G一100柱 层 析，测 定 其 所 含 成 分 的复 杂性 ，以 0．5％ 的溶 液上 柱 ，蒸 馏水 进 行 柱 平 衡 ， 以 硫 酸 一 苯 酚 法 检 测 洗 脱 液 。 结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，PC Ⅱ 的多糖组分非常复 杂，单通过分子量火小对其分离纯化很 因 难。多糖组分都带有肽链，带有电荷，所以 选用 DEAE—Biogel A柱层析进行进一步 分 离纯 化 。 PC Ⅱ 的 水 溶 液 以 2．6× 40cm 的 DEAE—Biogel A 柱层 析分 离 ，以 蒸 馏 水 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives l999 No．2 进 行 柱 平 衡。 先 以 蒸 馏 水 洗 脱 ． 然 后 以 0．1M、 0．5M 和 lM 的 NaCl和 lM NaOH 洗脱含糖 成分 。 蒸 馏 水洗 脱成 分 再进 行 2．6× 60cm 的 Sephadex G一50柱 层 析，分 成 两个 组 分 ， 第一 个峰收集 并制备 出来 的为 PCA I，第 二峰制 备出的 为 PCA IT[。 虫草多搪 (精品) I 乙醇分缴沉淀 PC I ．‘一L + PC Ⅱ 台糖部分 ’ PCA I 含糖部分 0．1M NaC1洗 脱 物 经 Sephadex G一50 柱层析分成两个峰，前一个峰制备出的样品 定 名为 PCB I，后一 个峰为 PCB Ⅱ 。 IM NaCl洗 脱物 也经 Sephadex G一50 柱层析分成两个峰，前一个峰制备的样品定 名为 PCC I，后一个峰 为 PCC II。 按 以下流程共分 离出 7个组 分： 1M NaCl洗脱 含糖部分 一 Scpha 。 dcx G_ 晰 厂 一 肺 PCA Ⅱ PCB I PCB Ⅱ PCC I PCC Ⅱ 2．4 虫 草多糖 的理化性质研究 2．4．1 纯度 鉴定 对分离 纯化 出的 7种 多糖组分 进行 电泳 和柱层析 ，鉴定其纯度 以不连续盘状凝胶系 统进行电泳，蛋白质染色采用考 马斯亮蓝 G250改 良法，多 糖 染 色 以 D．Racusen法。 根 据 所分 离样 品的分 子量大小差异 ，选 用 3种凝 胶 进 行 柱 层析 以鉴 定样 品 的 均 一 性 。 PC I和 PCA I进行 Sepharose 4B 柱层析 ，PCB I和 PCC I进行 Sephadex G一100柱层析 ，PCA Ⅱ 、PCB Ⅱ 和 PCC Ⅱ 进 行 Sephadex G一50柱层析 。 2．4．2 分 子量测 定 以柱层 析法 测定各样 品的分子量 ，其 中 PCB 工 、 PCC I 、 PCA Ⅱ 、 PCB Ⅱ 以 1．6× 100cm 的 Sephadex G一100柱 层析测定，以蓝葡聚糖和铬酸钠上柱测定其 外 水 体 积 和 内 水 体 积， 以 Dextran770、 T40、TIO及 Dextrinl0为标 准分子量作 标 准 曲 线。PC I 和 PCA I1分 子 量 太 人 ， 采用 Sepharoes 6B柱 层析测 定。 2．4．3 样品 【}】糖含 量 与蛋 白含量的测定 以 硫 酸 一苯 酚 法 测 定 样 品 中 的 糖 含 量，以甘露糖作 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线；以 Folin一酚法 测定样品中的蛋 白含量，以牛血清蛋白做标 准 曲线 。 2．4．4 多糖样品中的单糖组成测定 采用纸层析定性测定 了样 品的单糖组 成，以气相色谱分析法定性和定量测定了单 糖组 成及 比例。 2．4．5 儿种多糖组分的氨基酸成分分析 对几种 主要 的大 分 子 多糖 组 分 PCA I 、PCB I和 PC I进行 酸水解后 ，测 定了其氨基酸组成。 2．4．6 红外光谱分析 对 样 品 PC I、 PCA I、 PCB I 、PCA II、PCB Ⅱ 、 PCC Ⅱ 进 行 KBr压片，测定红外吸收光谱图。 2．4．7 核 磁共振分 析 对几 种 水 易 溶 的样 品 PCA I ，PCB I， PCA II， PCB II进 行 了 核 磁 共 振分析 。 条 件：溶 剂 D，o，温 度 60℃ ， 管 径 10mm，参考标准 DSS，观察核 ”C，观 察 频 率 22，51MHz，观察道偏 置 23KHz，数 据点 一 l9 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 《申国食品添加剂》 China Food Additives 1999 No．2 8K，累加 l万次，谱宽 4,500i-rz。 2．5 虫 草多 糖急性毒性试验 口服给药的急性毒性 试验采用体 重 20 ± lg小鼠 40只，雌雄各半，用虫 草多糖 药液0．34g／ml，按0．3ml／1唣灌胃，于给药当 日灌 胃 3次 ，连续 观察 7天。测试冬虫夏 草 多糖对小鼠经口灌胃急性毒性反应 2．6 虫 草多糖对小 白鼠免疫 功能的影 响 测 定 了复 合虫 草多 糖、虫 草 多 糖 PCA I、PCB I对小 鼠单 核 吞 噬 细 胞 系 统 碳 粒廓清能力 的影响 及 对 小 鼠免 疫 器官 重 量 的 影 响， 以 探 讨 复 合 虫 草 多 糖 及 经 分 纯后的虫草多糖对小 鼠免疫功能影响的差 别。 2．7 虫草多糖 的抑瘤作 用 研究 了虫草多糖 对小 鼠肿 瘤 S㈨ 的抑 制作用及虫草多糖与环磷酰胺合用对小鼠移 植肿瘤 S㈨ 的影 响。 2．8 虫草多糖的中试生产 通过反复提取实验 ，采用了以下生产工艺 ： 加 lO倍水 提取液 (1) 加 5倍水 提取液(2) 加 5倍水 ／ 提取液(3) 原料 过 滤 —— 残渣 过 滤 ／_—— 残 渣 —_—— 过 滤 100℃ 2h 100℃ 2h 100℃ lh 残 渣 提取液合并后浓缩、酒精沉淀、干燥 3 结果与讨论 3．1 温 度、 盐 浓 度 、 加 水 量、 提 取 时 间 4 个因素对虫草多糖提取的影响 正交分析表明，温度 以 100℃最佳．加水 倍数以 17倍最佳，盐浓度以0最佳，时间以 7h最佳 ．一次性 提取 ，提取 率最大达 67％ 3．2 多糖组分的颜色及溶解性 (见表1) 3．3 组 分 PCA I、 PCB I 、PC I 、 表 1 多糖组分的物理性状 PCA Ⅱ 、PCB Ⅱ 及 PCC Ⅱ 电 泳 结 果 结果表明，7个组分都为单一带，而且糖 染 色和 蛋 白染色 区带位置相 同，表 明样 品达 到 电泳 纯；PC I 、PCA I 采 用 Sepharose 4B柱层 析，PCB I和 PCC I采 用 Sephade G—l00柱 层 析， PCB Ⅱ 、 PCA Ⅱ 、 PCC Ⅱ 采 用 Sephadex G一50柱 层 析， 结果表明 ，各组分达到层析纯 ，为均 一组 分 3．4 分 子量测定 结果 为 PCA I 55．6 万 ，PC I 35万 ， PCB I 6万 ， PCC I 5．7万 ， PCA Ⅱ l668．PC Ⅱ 3030，PCC Ⅱ 分 子量太小未 能 测 出 3．5 各组分 糖含量 与蛋 白含量结果(见表 2) 表 2 样 品中糖含量和蛋白含量 3．6 纸层析结果 结果表 明PCA I和 PCB I含 甘露糖 和半乳糖 ；PC I、 PCA Ⅱ 、PCB 17则 含有 3种单糖 ，甘露糖 、半乳糖和 葡萄糖 一 20 一 气 相 色谱 结果 表 明，PC I 含 甘。露 糖、 半 乳糖 、 葡 萄 糖 ， 摩 尔 比 l：0．65 ：0．30； PCA I含甘露糖和半乳糖．摩尔比 l：l； PCB I含甘露糖和半乳糖摩尔比为 l：0，73； 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂 China F00d Additives l999 No ． 2 PCA 13 含 露糖、半乳糖、葡萄糖 ，摩尔 比 为 1：0．71：0．42；PCBⅡ含 露糖、半乳 糖、葡萄糖 ，摩 尔 比为 1：0．51：0．50。 3．7 PC I 、PCA I 、PCB I 三种 组 分的氨基酸组成 (见表 3) 3．8 红外光 谱 分 析和 核 磁共振 谱 图解 析 表 3 PCA I、PCB I和PC I的氨基酸组成 注：氨 基酸 含量 单位 为每 100 g样 品 中氨基 酸 的毫克 数。 PCA I 的结 构 连 接 点 为， l一 4连 接的吡喃甘露糖构成主链，侧链由单一的或 多个 单位 的呋喃半乳 糖组成，侧链 与主链连 接 点有 l一 2、 l一 3、 l一 6等 连接 方 式 ，而 且侧链偶 尔夹 杂一些吡 喃半乳糖 与主 链 以 l一 2、l一 3方式连接 。 PCB I 的结 构 特 点是 ， l一 4连 接 的吡喃 甘一露糖构成 主链，侧链主要 由呋喃半 乳糖构 成，也有少量 吡喃甘露糖和 吡喃半乳 糖构成的侧链。主链峰和侧链峰的相对高度 差别 不太 显 著， 表 明有许 多 侧链 重 复 性 很 高 ，即分子 中分枝 很 多 ，PCB I 为高度 分 枝 的半乳 露糖 。 PCA Ⅱ 含有 6个单糖分 子，即有 吡喃 形式的，又有呋喃形式的，它们是 3分子的 甘露糖 ，2分 子 的半乳糖和 1分子的葡萄糖 ， 构成非一 条链连接 的杂多糖。 PCB Ⅱ 中糖 的结 构 特点 是 4分 子 的单 糖 (2分 子 甘露 糖 、 1分子 半乳 糖 、 1分 子 葡萄糖 ) 以 l一 3方式 线 性 连接 起 来， 至 于 4个 单 糖分 子 的排列 次 序 尚不 能 分 析 清 楚 。 3．9 虫草多 糖的急性 毒性 实验结果 按 虫 草 多糖 最 高浓 度 34％ 及小 鼠最 大 灌胃容量 0．3ml／lO× 3计算，灌 胃剂量为 30．6g／l(g，40只小 鼠 7天 内无一 中毒及 死亡 ， 可 以认为 ，LD 大 于 30000mg／kg。 根 据 急 性毒性分级 标准 ，为无毒物质 。 3．10 虫草多糖对小鼠单核吞噬细胞系统碳 粒廓清 能力的影响试验结果 虫 草 多 糖 PCB I 80mg／kg、 复 合 虫 草多糖 40mg／kg、ip，可明显提高正常小 鼠 血 中碳 粒 廓 清 速 度 (P<0．01)， 虫 草 多 糖 PCA I 80mg／kg、复合虫草多糖 23．44mg／kg 有提高正常小鼠血中碳粒廓清速度的趋势。 虫草 多糖对小 鼠免疫器官重量 的影 响试 验 结 果 表 明， 虫 草 多 糖 PCA I 、 PCB I及复合虫草 多糖 23．44--375mg／kg均 能程 度不 同的增 加正常小 鼠胸腺和脾脏 的重量 。 本研究 结果显示，虫草多糖及分 离纯 化 的虫草多糖 PCA I、PCB I可使 中枢 免 疫器官胸腺重量明显增重，有的报道称其能 使小 鼠胸 腺缩小 ，由此可 以推论 ，冬 虫夏草 内含有 使胸腺重量增 加和 缩小 的 两种 组分 ， 使胸腺增重的有效赓分由本实验可以确定为 虫草多糖，导致胸腺缩小的成分有待于进一 步分离 纯化，深入探讨 。 本实验对虫草多糖可增加胸腺重量这一 发现，可充分地完善虫草抑瘤作用机理。因 老年人血清中胸腺激素水平降低，可能是老 年人易患 自身免疫性疾病和肿瘤的重要原因 之 一。因此，虫草多糖可使胸腺增 重这一发 一 2l 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives l999 No．2 现对于冬虫夏草用于治疗肿瘤有着极高的学 术价值和应用价值，有必要进一步深入研究 探讨。 3．1l 复合虫草多糖的抑瘤试验结果 虫草 多糖对小 鼠 S-劬有 明显的抑 瘤作 用，抑瘤率可达 45．71％，与 CTX合用抑瘤 呈协同作用，并能减轻用 CTX对免疫功能 的损伤．与CTX合用具有增效减毒的作用。 根据我国中草药抑制实体瘤疗效评价标 准，实体瘤疗效以瘤重抑制百分率表示，抑 制率大于 30％，合成药大于 40％，并经统计 学处理有明显差异 时，而认为 系有苗头的抗 肿瘤药物。目前既能抗癌又有增加机体特异 性和非特异性免疫的单一成分的药物极少， 因此很有必要对虫草多糖进一步从化学及药 效等方面深入探讨和研究 。 3．12 中试生产结果 结果表明，虫草多 糖提取 收率可达到 85％ 以上。根据 虫草 多 糖 的药 理 试验 结 果，每人每天食用0．18 g就可产生免疫调节 作用。虫草多糖无色、无味、稳定性好，其 水溶，适合在各种形式的保健食品中应用。 Study on P0lysaccharide from Cordyceps as Functional Factor Yun n Jianguo，Cheng Xianhao，Hou Yongqin，Sun Ling，Zhuang Zhifa (Shandono Food＆Fermentation Researr．h＆ Institute Jinan，250013) ABSTRACT： The component， physical & chemical properties， structure property， and toxico logic & pharmacodynami c properties of polysaccharide from cordyceps were studied， and the techological process for producing polysaccharides from cordyceps as a functional factor has been established． K EY W ORDS： cordyceps sinensis，polysaccharide from cordyceps，functional factor 几种抗氧化剂对鲲 鱼油的抗氧化作用的研究 一 i一直 李浩明 5E 丽 王建国 刘玉申 (青 岛大学天然色素研究所 青岛，266071) 鲞 (青 岛大学化学系 -v ／ 燕 、 青岛，266071) 中 摘要：研究了维生素 E(使用浓度为 O．1％．1％ TBHQ(叔丁基对苯二酚．使用浓度 为 O．02％、O．O5％)和生姜油溶 性提取物 (使用浓度为 O．2％．O．5％)对鲲 鱼油的抗氧化作用。结果表明．浓度为 O．1％ 的维生素 E的抗氧化效果最好。 关键词：鱼油．抗氧化刺 - 一 — — — — — 一 一 22 一 牡妻E，丁 1 ． 蜘 睡 物 色定 1白 才 维普资讯 http://www.cqvip.com