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蛋黄免疫球蛋白的功能性研究与开发.pdf

蛋黄免疫球蛋白的功能性研究与开发

chemidoctor 2012-07-26 评分 0 浏览量 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《蛋黄免疫球蛋白的功能性研究与开发pdf》,可适用于工程科技领域,主题内容包含《品添加剂》chi眦F。。dAmvlNo.卜蛋黄免疫球蛋白的功能性研究与开发c无锡轻工)‘T(无锡轻工大否、锡T一>.(浙江艾格生物制品有限公司长兴符等。

《品添加剂》chi眦F。。dAmvlNo.卜蛋黄免疫球蛋白的功能性研究与开发c无锡轻工)‘T(无锡轻工大否、锡T一>.(浙江艾格生物制品有限公司长兴县)摘要:免疫球蛋白(ImmunoglobulinIS)是一类具有增强抗菌.免疫功能的活性蛋白质.是人类特别是婴儿健康所需的生理活性物质。本文对蛋黄免疫球蛋白(ImmunoglobulinYolkIgY)的功能特性进行了较系统的研究。对lgY的功能性研究表明.IgY确实具有较高的抗菌免疫活性。可抑制致病性大肠杆菌.沙门氏菌金黄色葡萄球菌等常见肠道致病菌的生长.IgY的耐热耐酸性与牛.猪IgO相当。对胃蛋白酶较敏感.但经胰蛋白酶消化后仍保留了大部分的对抗原的结合力。动物及婴儿喂养实验证实IgY安全无毒并可帮助机体增强免疫功能.提高抵抗细菌感免疫球蛋白(ImmunoglobulinIg)对增强机体的免疫抗病能力虽早为人知但仅用于医疗。只是在最近O年国际上才开始对Ig用作盟能食丑添地进行了深入研究.发现母乳中Ig含量达mg/L另外还含有多种生物活性物质如乳过氧化物酶(LactoperoxidaseLp)、乳铁蛋白(LactoferrinLf)和溶菌酶(Lysozyme)等它们在调节动物体的生理功能和某些特定物质的代谢方面起着重要作用。大量流行病学研究充分证实母乳喂养能够有效降低乳儿出生后个月内感染疾病的发生率与死亡率用人的初乳能够成功治疗小儿大肠杆菌性肠炎、耐药性细菌性痢疾、婴幼儿喘息性肺炎等疾病。母乳喂养作为乳儿的最佳喂养方式能够保护免疫功能不成熟的新生儿免于感染而这种作用则主要来自于天然存在于母乳中的各种抗感染物质。而靠牛乳喂养的婴儿由于牛乳中Ig的含量极微仅.mg/'L(商品奶粉由于经过传统加热干燥工艺含量仅为痕量)使得生长发育、抵抗疾病等方面均比母乳喂养的婴儿差得多。正诲剃因为母乳有如此之多的优越性医学界近年来一直倡导母乳喂养。然而有不少母亲乳汁减少不足以哺育乳儿却是不争的事实。这就需要有良好的母乳代用品来满足乳儿的生长发育。而以母乳为模型广泛深入地研究其中的生物活性物质的结构与功能开发新的功能食品因子一直是食品界的重大课题。目前类母乳化型食品的研究已从单独的营养成分模拟向添加生物活性物质方面转化。因此开发Ig作为具有生理活性的功能食品因子成为科学家的研究重点。国外从年代末就开始研究从牛奶、乳清、初乳和血液中提取Ig的技术和工艺但限于资源不足大规模工业化生产技术不成熟及价格昂贵所以仅作为婴儿食品添加剂及免疫性药品。有关这方面的报道大部分来自专利和商品性广告。年美国StollInternationInc.生产了一种功能性奶粉并在台湾销售其产品含有活性IgG可抗人类常见的种致病菌及病毒。年美国的CENTURYLABS菌一号抑一.r丝子白一因蛋~能球一功疫一品免一塑能.功白一一辫增免一具黄一为蛋一作。~可蛋全鸡完..词力键能关的染维普资讯http:wwwcqvipcom《中国食品添加剂》ChinaFoodAdditivesNo.INC.公司介绍了微胶囊化Ig类婴儿食品的配方主要含有IgG、DHA、EPA蛋白质和碳水化合物并以与母乳相似的比例配成这类婴儿食品在脂肪酸和Ig组成上与母乳相近利于婴儿吸收并增强防病能力并对婴儿的生长发育也有明显的促进作用。LANIERINDS.INC。开发出含有Ig免疫活性的乳清固体粉末添加剂由低含量的乳糖、矿物质、%以上的低分子量蛋白质和不少于%的IgG组成其免疫活力与初乳相近该产品也能提高婴儿对疾病的免疫力促进婴儿生长。而美国的BIOMUNESYS巳MS.INC.开发了一种富含免疫球蛋白的产品其商品名为OPTIMUNE已经用于爱滋病人的辅助治疗经临床实验证实可帮助病人促进营养吸收、肌肉生长、提高生活质量并增强业已破坏的免疫系统的各项功能。另外鸡蛋中也富含免疫球蛋白IgY从免疫学上看与鸡血清蛋白质是同源的它是母鸡在卵泡中生成蛋黄的过程中由鸡血清中的IgG转移到蛋黄中而形成的。Poison首先从蛋黄中分离提取了IgY并研究了其性质。Gottstein和Hemmler更是详细比较了IgY与其他动物Ig的异同点发现母鸡经免疫后蛋黄中的IgY含量高达~g/L比母乳高多倍且抗体活性高。每只母鸡一年可以获得g以上的IgY而且鸡蛋宜于收集不象血清需要有一定技术的人员进行抽血故认为母鸡是一种高产、优质、经济的免疫球蛋白“加工厂”。Van.Regenmortal、Hatta、Ebina、Yokoyama等许多研究发现口服IgY可获得被动免疫保护从而帮助机体增加防病抗病能力。因此完全可作为婴幼儿、老年人的具有免疫活性的功能食品因子。而Shimizu最早提出将IgY应用于婴儿配方奶粉等婴幼儿食品的设想并且对IgY进行了一系列的功能性研究体外实验结果表明IgY各方面的功能一’一特性都不比牛血清及初乳中的IgG差完全可以应用于婴儿食品中作为免疫活性因子。因此IgY是比较良好的免疫球蛋白资源只是因为蛋黄的脂类多而使得分离难度大大增加到目前为止还没有工业化生产的报道。我国目前这方面的研究工作还刚刚开始主要是使用初乳粉作为免疫活性因子目前还没有使用其他免疫球蛋白资源的报道。无锡轻工大学在承担了国家“八五”重点科技(攻关)项目“鸡蛋中免疫球蛋白的分离提取”后逐渐摸索了一条切实可行的生产工艺路线以超滤为主结合其他生化分离技术效果比较明显。其中试规模达到日产粗IgYlkg并已通过国家级鉴定。目前已经和无锡轻工大学科研成果转化基地浙江长兴艾格生物制品有限公司通力合作预计今年月份就能生产出高质量的活性蛋黄免疫球蛋白产品。本论文主要就IgY的功能性研究及应用作一简单的介绍。实验方法.工艺流程新鲜鸡蛋厂蛋清蛋黄喷雾蛋白粉沉淀物(剩余蛋黄)厂鞭剩余蛋黄粉卵磷脂搅拌抽提液l加絮凝剂澄清厂絮凝澄清液沉淀物截留浓缩液透过液(弃去)I微滤除菌冷冻干燥蛋黄免疫球蛋白(IgY).温度对IgY的免疫活性的影响维普资讯http:wwwcqvipcom中国食品添加剂》ChinaFoodAdditivesNo...将IgY溶于pH..MPBS缓冲液浓度均为.mg/ml在不同温度条件下水浴保温min测其免疫活性。..将IgY溶解于pH。.MPBS(含.MNaC)缓冲液浓度均为.mg/ml装入毛细管柱密封分别放入恒温水浴于、、、各种不同温度下用ELISA方法定时测定IgY的活性。.pH对IgY的免疫活性的影响将IgY样品溶解于不同pH梯度(pH......)的.MTrisHC缓冲液中于、、反应h用MTris溶液中和然后用ELISA方法检查剩余活性。.胃蛋白酶对IgY的抗菌活性的影响将IgY样品溶解于.M不同pH梯度(pH...)的NaAcHAc缓冲液中使IgY的浓度为mg/ml加入%(E)胃蛋白酶温育h然后用MNaCO中和使酶失活采用ELISA法测定IgY的剩余活力。.胰蛋白酶对IgY免疫活性的影响胰蛋白酶以%(E/S)浓度加入IgY的pH..MTrisHC缓冲溶液在下培养h后取出用竞争性ELISA方法测定其剩余活力。.IgY对细菌生长的抑制作用首先用肉汤培养基摇瓶培养致病性Ecoli、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和绿脓杆菌培养h使菌液浓度达到CFU/ml左右然后将在无菌条件下配制的IgY溶液(mg/ml和lmg/ml两种浓度)分别与上面种细菌溶液等体积混合空白的无菌生理盐水分别与细菌溶液等体积混合作为对照再在下培养定时用nm波长测定其透光率Too。.动物实验动物实验条件:将体重为~g雄性断乳大鼠随机分为二组其中实验组:只大鼠喂标准火鼠饲料(含个致病性的E.coli)再加入IgY免疫增加剂.g/只天。对照组:只大鼠喂标准大鼠饲料(含个致病性的E.coli)。实验共进行周观察老鼠的食量、体重、生长等情况。..IgY经ElLDo实验按中华人民共和国国标GB进行。..体重增加实验按上述实验条件饲喂周后对实验组及对照组的大鼠分别称重并记录。..抗疲劳试验按上述实验条件饲喂周后对实验组及对照组的大鼠采用游泳达衰竭的方法观察IgY对大鼠的抗疲劳作用。按体重的%负重在水深cm水温的水池中游泳至衰竭并记录下衰竭时间。结果与讨论.蛋鸡免疫实验..免疫实验本实验的规模为只蛋鸡其中只为实验组只为对照组。实验组经过第一次免疫注射后即开始用ELISA方法来检测IgY抗致病性E.coli菌的生物活性历时长达个月之久实验结果见图..寸凸O时(d)图IgY抗致病性的Ecoil的活性变化从图可看出在注射抗原后的第天便检测到较高的抗致病性E.coli的活性。第二次加强注射后的一周蛋中抗体的一一维普资讯http:wwwcqvipcom《中国食品添加剂》ChinaFoodAdditiveslNO.活性开始大幅度提高.经第次注射.其高活性维持个月后.有所下降。经第次注射后。活性恢复并又维持个月。因此免疫佐剂确实可以提高抗原的免疫原性并发挥缓慢释放延长免疫增强作用时间的功效。..免疫注射对蛋鸡产蛋率的影响给蛋鸡免疫过程相当于一次感染过程.因此而产生的免疫应激反应对蛋鸡的生理活动有一定影响。其产蛋率由注射前的%猛然下降到注射后第一天的%至第天才恢复至原来的水平(见图)。有趣的是对照组的产蛋率也同步下降这可能是因为对照组与实验组在同一地方受其影响所致。日j【LJ图免疫注射对蛋鸡产蛋率的影响因此.可以认为免疫注射给蛋鸡带来的短时间的影响是非常显著的.幸好其影响的时间不太长.只有天左右。因此对蛋鸡总产蛋率的影响还是非常小的。.蛋黄免疫球蛋白的功能性研究..温度对IgY的影响蛋白质热稳定性的研究对于工艺流程的选择、产品的保存及使用都有非常重要的意义。Ig作为一个有生理活性的生物大分子其肽键具有特定的空间排布。若吸收了过多的热能。则维持蛋白质空间结构的次级键容易解体。导致热变性。随着变性的明显化其免疫活性也迅速下降。但以前的测定方法因为没有考虑介质对Ig的影响许多结果是相互矛盾的。因此。无法进行相互比较。一一本研究充分考虑介质对IgY的影响。对其热变性作了进一步的研究。鉴于IgY的最大应用是在配方婴儿奶粉中.因此.本实验主要比较了IgY在牛奶和pH..MPBS缓冲液中温度的不同影响。其结果如图所示。图温度对不同介质的IgY活性的影响从图中可看出.在PBS缓冲液中的IgY对温度的耐受性要稍高于牛奶中的IgY这可能是因为环境不同。其磷酸盐缓冲液(含生理盐水)的环境比较适合保持IgY构象的稳定。而动力学研究发现IgY的活化焓值达到.kJ/mol左右这表明在变性期间。IgY的构象发生了很大的变化。然而IgY的活化能与其他蛋白质相比如一乳球蛋白A、一乳球蛋白B及c一乳白蛋白相比还是比较低的(它们的表观活化能都达到E=~kJ/mo)这说明IgY远比它们更易失活。因此在IgY的分离、超滤浓缩、干燥等工艺流程设计及产品保存、使用等方面都应注意到IgY这些特性。..pH对IgY免疫活性的影响环境介质对IgY活性的影响。pH在其中起了重要的作用。Ig是一类特殊的蛋白质分子它具有类似酶的结构与功能。其抗原识别、结合位置(位于Fab端)的功能是直接与抗原相结合。再通过一系列的代谢达到抑菌灭菌的效果。但是。其活性部分必须保持一定的空间结构才能发挥作用。而维普资讯http:wwwcqvipcom《中国食品添加剂》ChinaFoodAdditiVeSlNo.pH值的改变直接影响了构成活性中心的各基团的解离状态从而引起空间结构的变化.使得活性中心的构象与抗原分子的结合减弱当然过低或过高的pH值可能会导致Ig的不可逆变性从而导致失活。因此有必要研究在不同条件下IgY对pH耐受性的影响.本实验比较了、、O条件下.IgY对pH的敏感性.其实验结果如图所示。lI吝OOOpt{图pH对IgY的影响从图上可看出pH对IgY的影响随着温度的提高而变得敏感。在低温时.这种变化不太明显与时其活性在pH以上都非常稳定但是当温度升至pH降至.时IgY就开始失活pH到.O时活性已损失火约O%左右在pH.时已基本上全部失活了。以上结果表明.时IgY对pH的耐受性比时要下降O.~个pH单位这可能是在高温条件下构成活性中心的基团更易受pH的影响而引起解离状态的变化从而导致免疫活性丧失而Dr.Nakai的研究表明婴儿(O~个月)的胃即使在喂养过牛奶h后其pH值始终在.O左右因此在正常生理条件下IgY如作为婴幼儿的免疫强化剂应是完全可行的不过pH对IgY的负面影响是应该考虑的可采用胶囊或微胶囊的方法以增加IgY制品的耐酸性防止过低的pH值对IgY免疫活性的破坏..胃、肠蛋白酶对IgY免疫活性的影响口服IgY除了必须耐受低pH值以外在胃、肠中还要受到胃蛋白酶及胰蛋白酶的催化水解.因此要证实其临床有效必须先进行体外模拟实验(invitro)。本实验拟定在系列不同pH值(pH......)条件下.加入%(E)胃蛋白酶处理h再用夹心ELISA法测定其剩余活性结果见图.I。I墨o...O...pH图胃蛋白酶对IgY活性的影响从图可见胃蛋白酶对IgY活性的影响随着pH的下降而变得显著。在pH.时只有少量的水解片段但当pH下降至.时其IgY已基本上完全被水解成分子量为O~OKD的碎片采用竞争性ELlSA方法来测定其免疫活性也已完全丧失因此IgY比哺乳动物血清或乳中的IgG对胃蛋白酶有更高的敏感性庆幸的是在pH.时胃蛋白酶对IgY的影响已非常小了其免疫活性没有较大的降低。与胃蛋白酶相比胰蛋白酶对lgY免疫活性的影响小得多在pH.%(E/S)的胰蛋白酶水解后用ELISA方法检测其免疫活性几乎没有什么破坏(数据未发表)..IgY对细菌生长的抑制作用由于Ig具有识别细菌的活性部位因此IgY特异性地和某种细菌发生抗原一抗体反应其结合能力可能为库仑吸引一一维普资讯http:wwwcqvipcom《中国食品添加剂》ChinaFoodAdditivesNo.力、范德华力和氢键力。抗原一抗体反应可分为两个阶段即()结合阶段:是由抗原抗体根据两者的物理和化学性相对应而进行特异性结合但不出现肉眼可见的反应现象。()反应阶段:是当抗体与抗原特异性结合后每个结合物又受环境中因素(温度、补体、pH及其他物质等)的影响发生互相凝集、溶解等现象从而抑制了细菌的正常生长繁殖达到抑菌的效果。经对致病性E.coli的抑菌实验发现IgY对致病性的E.coli具有最大的抑制作用对这种菌的抑菌能力依次为致病性Ecoli、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌。IgY对致病性E.coli具有极强的抑菌能力即使在lmg/ml低浓度下仍然具有很强的抑制效果。经平板计数IgY的抑菌率达到.%这是因为该IgY是经致病性Ecoli免疫后产生的因此其抗致病性E.coli的能力特别强另外IgY对沙门氏菌也有较好的效果其在mg/~和lmg/mlIgY浓度下抑菌率分别达到.%和.%。其次为金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌在mg/mlIgY浓度下抑菌分别达到.%和.%。I.动物实验...IgY经VILD实验给药途径为经VI(灌胃)剂量为g/kg体重观察天。大鼠活泼无异常及死亡现象故IgY的经VILD>g/kg可视为无急性毒性。如果以大鼠耐受人用量的倍以上为安全的话成年人每El一次摄入.gIgY如果以奶粉中添加为‰~‰计相当于一天可摄入g以上奶粉...IgY对大鼠生理的影响经过周喂养后实验组与对照组的大鼠.在外观症状方面可观察到明显的不同。对照组在第一周就可观察到致病性的E.coli对大鼠生长的影响。至第周结束所有大鼠全部都出现了致病性的E.coli感染的症状。一一而整个实验组在第一周仅有只大鼠食量减少没有明显症状至第周增加到只直至第周结束也仅有只大鼠出现不正常症状。因此可以看出IgY在帮助大鼠抵抗致病性的E.coli感染维持机体健康方面确实有一定效果(见表)。表IgY对大鼠生理方面的影响...IgY对大鼠的体重增加作用大鼠在喂以。cvu/~的致病性E.coli之后必然影响其正常生理生长。对照组在大鼠由于受致病性E.coli感染消化系统受到较大影响体重的增加趋势明显缓慢至喂养l天后体重增加极少而实验组因添加了活性IgY具有了较强的抵抗致病性Ecoli感染能力消化系统所受的损伤相对较小表现在体重上则增加较为正常要远远快于对照组的生长速度。实验组平均体重增加达.g而对照组仅为O.gP值<O.。这说明IgY在帮助大鼠抵抗致病性E.coli感染提高生长速率具有极显著的效果。...IgY对大鼠的抗疲劳作用二组大鼠在完成上述实验后继续进行抗疲劳试验测试大鼠在一定负重条件下游泳至衰竭时间结果见表。表IgY对大鼠的抗疲劳功能的影响实验组有一只大鼠低于平均体重的%~只高于平均体重的%:而对照组有一只大鼠低于平均体重的%应剔除从上表可看出对照组的大鼠因感染致维普资讯http:wwwcqvipcom中国食品添加剂》ChinaFoodAdditivesNo.病性的E.coli消化道正常生理活动受到影响进而影响其新陈代谢因此体质也受到较大的影响两个相比P值<.O说明IgY对于动物抵抗细菌感染增强体质有显著的作用。..IgY产品的性状及稳定性研究IgY产品的外观为基本无色的晶状体(有时呈极浅黄色)其主要成分如下:蛋白质为%其中IgY的含量为%水分为.%灰分为.%。产品以铝塑复合袋真空包装在室温下存放二年后测定其活性(经ELISA方法).发现其活性下降不到%。..婴儿喂养试验在不影响母乳喂养的前提下用单盲法随机抽样选择试验组(最终有效例数为例)与对照组(最终有效例数为例)年龄段为~个月不等。按不同个体需要提供奶粉量试验时间为二个月。其中实验组喂养添加了IgY产品的婴儿配方奶粉(Ⅱ)对照组为普通的婴儿配方奶粉(Ⅱ)经二个月的试验证实对照组在试验期间有例细菌性腹泻发生而试验组则无一例发生。婴儿的其他各项营养、生长发育指标均无明显差异。因此喂养含IgY免疫活性增强剂的婴JLIt方奶粉具有一定的被动免疫保护作用增强机体防病抗病能力。当然其明确的结论还有待于进一步的研究论证。结论.IgY是一种前景良好的免疫球蛋白资源从免疫母鸡所产的蛋中分离IgY是一种简便、经济、高效的方法。.IgY具有优异的稳定性因而有利于运输、保藏及应用.IgY安全无毒体外实验、动物试验及婴儿喂养试验都证实了IgY确实具有被动免疫保护作用可帮助机体增强防病抗病能力。完全可以用作免疫生物制剂或功能食品的免疫功能因子。StudiesandDevelopmentofImmunoglobulinYolkYangYanjun(SchoolofFoodScience&Technolo)WuxiUniversityofLightIndustryWuxi)ZhouJianxin(ZhejiangAloeBiologicalProductsCoLtd.Changxing)ABSTRACT:Immunoglobulin(Ig)isakindofimmunomodulatingandantimicrobialproteinswhichisbeneficialtohumanespeciallytoinfant.ThestudyonfunctionalpropertiesofIgYshowedthatIgYhadhighimmunomodulatingandantimicrobialactivityandinhibitedenterpathogenicEschericbiacoliSalmonellasp.andStaphylococcusaureus.IgYwassimilar'tooovineandpigIgGinheatstabilityandpHstabilitybutmoresusceptiblet(pepsindigestion.AdditionallyIgYdigestedwithtrypsinwasstillretaineditsantigenbindingactivity.KEYWORDS:eggyolkimmunoglobulinimmunoglobulinyolkimmunomodulatingantimicrobial一一维普资讯http:wwwcqvipcom

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