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草栽与段木栽培的灵芝活性成分的分离与鉴定__多糖肽成分的提取_纯化及性质.pdf

草栽与段木栽培的灵芝活性成分的分离与鉴定__多糖肽成分的提取_…

上传者: luvie2011 2012-07-25 评分 0 0 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《草栽与段木栽培的灵芝活性成分的分离与鉴定__多糖肽成分的提取_纯化及性质pdf》,可适用于人文社科领域,主题内容包含ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:wwwcnki符等。

ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:wwwcnkinet草栽与段木栽培的灵芝活性成分的分离与鉴定É多糖肽成分的提取、纯化及性质林树钱,王赛贞,林志彬,林跃鑫Ξ(福州绿谷生物药业技术研究所,福建福州  北京大学医学部药理系,北京  福建师范大学,福建福州 )摘 要:目的 研究草栽和段木栽培灵芝的多糖性质和含量考察以草代木栽培灵芝的可行性的研究。方法 提取、分离、逆相透析方法研究二者子实体多糖。应用气相色谱、凝胶渗透色谱法测定多糖的组成、摩尔比和相对分子质量。IR,HNMR和CNMR等光谱确定多糖肽化合物结构。结果 草栽灵芝多糖肽(GLPG)和段木多糖肽(GLPW)的重均相对分子质量(Mw)分别为和黏均相对分子质量(MΓ)分别为和,二者具有相同的相对分子质量分布及光谱数据。从光谱分析中看出各单糖间的苷键构型相似,均以Β苷键为主糖肽部分均含有相同的种氨基酸,糖的组份为鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖等,GLPW还含有微量甘露糖。结论 草栽灵芝与段木灵芝多糖肽的主要理化特性相似,其提取率比段木灵芝约高倍,为草栽灵芝的综合开发与药用提供了科学依据。关键词:草栽灵芝多糖肽段木灵芝多糖肽提取纯化光谱鉴定中图分类号:R   文献标识码:A   文章编号:()IsolationandidentificationofactivecomponentsofGanodermalucidumcultivatedwithgrassandwoodlogIExtraction,purificationandcharacterizationofglycopeptideLINShuqian,WANGSaizhen,LINZhibin,LINYuexin(FuzhouGreenValleyInstituteofBiopharmaceuticalTechnology,Fuzhou,ChinaDepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalScience,PekingUniversity,Beijing,ChinaFujianNormalUniversity,Fuzhou,China)Abstract:Object TostudytheamountandpropertiesofglycopeptideofGanodermalucidum(LeyssexFr)Kaistcultivatedwithgrass(GLPG)andwoodlog(GLPW)toinvestigatethefeasibilityofsubstitutionofgrassforwoodlogtocultivateGlucidumMethods GlycopeptideswereextractedandisolatedfromthefruitbodyofGlucidumfollowedbydialysisthemonosaccharidconstituentandrelativemolecularweightofpolysaccharideswereexaminedbyGCandgelfiltrationstructureofglycopeptidewasdeterminedbyIR,HNMRandCNMRResults RelativemolecularweightsofGLPWandGLPGglycopeptideswere(Mw)and,(MΓ)and,respectivelytheglucosidicbondsofbothglycopeptideswereΒtypebothglycopeptidesconsistaminoacidsandRha,Xyl,Fru,GalandGlc(therewastraceamountofManinGLPW)Conclusion TherearelessphysicalandchemicaldifferencebetweenGLPGandGLPWThepurificationrateofGLPGistimestoGLPWKeywords:glycopeptideofGanodermalucidum(LeyssexFr)Karstwithgrass(GLPG)glycopeptideofGlucidumwithwoodlog(GLPW)extractionpurificationspectrumidentification  我国是世界上生产食(药)用菌的大国。每年栽培食(药)用菌消耗大量的木材,影响生态环境。目前,市场上应用的段木灵芝Ganodermalucidum(LeyssexFr)Karst,每年要消耗十几万立方米木材。为此,笔者对福建农林大学菌草研究生产的草栽灵芝与段木灵芝中的多糖成分的提取、纯化与特性进行了比较研究,为进一步研究草栽灵芝多糖与活性的关系,用草栽灵芝代替段木灵芝应用奠定中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第卷第期年月Ξ收稿日期:基金项目:上海绿谷(集团)有限公司专项科研资金全额资助项目作者简介:林树钱(),男,福建人,副研究员,年毕业于福建师范学院生物系(现福建师范大学),现任福州绿谷生物药业技术研究所常务副所长,主要从事灵芝等药用真菌药物的研究与开发。 Tel:()  Email:lsqsohucomChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:wwwcnkinet了基础。 材料与仪器 材料:草栽灵芝子实体来自福建农林大学菌草研究所段木灵芝子实体来自福建省泰宁县段木灵芝生产基地。子实体经中国科学院微生物研究所卯晓岚研究员鉴定。 仪器与设备:PerkinElmer红外光谱仪(KBr压片)UNRTY核磁共振仪日立氨基酸自动分析仪岛津LcA高压液相色谱仪RIDA示差折射检测器岛津GCA型气相色谱仪。 实验方法与结果 多糖肽提取、分离和纯化 粗多糖提取与分离:将灵芝子实体用粗颗粒粉碎机破成目左右,称取g用倍量的乙醇,加热回流h,醇提残渣经风干后,分别用倍水加热回流提取次(,,h),滤过后的水提取液合并,经减压浓缩至原体积的ö,römin离心min,上清液再浓缩相当于每毫升含灵芝生药量g,然后加浓缩液体积的倍量乙醇作多糖沉淀剂,置于冰箱内静置过夜,沉淀物离心(römin,min),再溶于蒸馏水mL中,用乙醇~倍量沉淀多糖,依此反复提纯次,最后将沉淀的多糖分别用乙醇、丙酮和乙醚各洗涤次后,置低温()干燥至恒重,即得黄灰色的粗多糖。草栽灵芝粗多糖的平均提取率为,段木灵芝粗多糖的提取率为。 多糖肽的分离、纯化,:将上述粗多糖肽溶于蒸馏水中,置透析袋内(截留相对分子质量以上),逆流透析h,取出透析液在下减压浓缩,加入多糖浓缩液体积的倍量乙醇,搅拌、静置,然后离心(römin,min),沉淀物为透析后截留的大分子部位多糖,分别用乙醇、丙酮和乙醚各洗次,离心,沉淀物置低温干燥至恒重,分别得草栽灵芝多糖肽(GLPG)和段木灵芝糖肽(GLPW),并求大分子部位多糖肽各占粗多糖含量比。结果表明,GLPG,GLPW约占粗多糖~。而低聚糖和色素等低分子杂质约占。 糖肽分离除去蛋白:称取g草栽灵芝粗多糖溶于蒸馏水中,采用Sevag法除去蛋白,即加入多糖溶液体积倍氯仿和倍正丁醇混合摇振min,离心分离,除去沉淀部分,依此反复处理至氯仿和水的界面无沉淀为止。通过Sevag法对草栽灵芝多糖肽分离以除去蛋白,经次的反复处理纯化后的样品,其氨基酸总量为,比处理前仅减少肽部分仍有种氨基酸组成,比处理前仅减少种异亮氨基酸(表),说明灵芝多糖肽中蛋白质与多糖键结合相当牢固,故本试验样品称为多糖肽。 多糖肽的氨基酸分析:取一定量GLPG和GLPW以及Sevag法处理后的GLPG,加HCl,封管,水解h,浓缩,调pH值为中性,用mLöLHCl定量,经氨基酸自动分析仪测定,结果见表。从表可见GLPG和GLPW具有相同的氨基酸组成,其氨基酸总量基本一致。表 GLPG和GLPW的氨基酸组成mgögTable CompositionofaminoacidsinGLPGandGLPWmgög氨基酸名称GLPGGLPWGLPGSevag处理天门冬氨酸        苏氨酸丝氨酸谷氨酸甘氨酸丙氨酸胱氨酸缬氨酸蛋氨酸异亮氨    亮氨酸酪氨酸        苯丙氨酸赖氨酸组氨酸精氨酸脯氨酸总 量 相对分子质量测定与相对分子质量分布:采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定,利用示差折射检测器和HW色谱工作站,色谱柱为ShimpackDIOL,流动相为HO,流速mLömin,进样量为ΛL。根据已知标准葡聚糖相对分子质量和其相对应的出峰时间绘出标准曲线,GLPG和GLPW的相对分子质量分布由色谱工作站根据所绘出标准曲线计算,分别得出GLPG和GLPW相对分子质量与分布,其相对应的相对分子质量分布数据见表。表 GLPG和GLPW的相对分子质量分布数据Table RelativemolecularweightdistributionofglycopeptideinGLPGandGLPW组 份重均(Mw)相对分子质量(Mn)黏均(MΓ)分布宽度指数(n=MwöMn)GLPGGLPW  由图和表可见,两者具有非常相似的相对中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第卷第期年月ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:wwwcnkinet分子质量分布。GLPG的Mw为,MΓ为GLPW的Mw为,MΓ为。ÉGLPW ÊGLPG图 GLPG和GLPW相对分子质量分布Fig GPCspectraofglycopeptidesfromGLPWandGLPG 多糖肽组份及摩尔比,:取单糖标准样品mg和样品水解后冷冻干燥,称重,分别制备成单糖三甲基硅烷样品,注入气相色谱,确定各出峰时间及峰面积。色谱条件:岛津GCA,OV,m、直径mm填充柱,柱温,进样器温度度,检测器温度,载气N=mLömin,H=mLömin,AIR=mLömin。进样量为ΛL。根据单糖质量ö峰面积之比,求出水解多糖中各单糖质量,转化为物质的量除以各自的相对分子质量为摩尔比。气相色谱分析表明,GLPG和GLPW均由D葡萄糖(Glc)、D半乳糖(Gal)、果糖(Fruct)、D木糖(Xyl)、D鼠李糖(Rha)组成。GLPW尚含有微量甘露糖(Man),说明二者组份中单糖构成基本一致。GLPG摩尔比为RhaXylFructGalGlc=GLPW的摩尔比为RhaXylFructGalManGlc=。 波谱分析鉴定:GLPG和GLPW的IR,HNMR,CNMR光谱基本一致,说明两者具有相同的结构,,~。 讨论草栽灵芝多糖肽提取率是段木灵芝子实体的倍左右。经透析截留大分子部位多糖肽分别为GLPG和GLPW两者均占粗多糖的~,均由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、果糖(Fruct)、木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)组成,凝胶色谱和高效液相色谱证明均为一样的生物高分子化合物。从光谱数据可看出两者化学构型相似,均以Β型糖苷键为主外,尚有Α型糖苷键。草栽灵芝多糖得率受灵芝栽培季节和子实体收成期影响较大,其规范化栽培技术显得十分重要。由于灵芝多糖种类多而复杂,同时受到分离条件与分析方法的限制,草栽灵芝多糖肽的肽键与糖的连接方式尚未最终确定,以及该结构和其药理作用关系尚待进一步研究。致谢:光谱由中国科学院福建物质结构研究所测定,相对分子质量和多糖组成由福建师范大学实验中心和生物工程学院测定,氨基酸由国家医药管理局福建省微生物研究所测定。References: LinZXJuncaoTechonology(菌草学)MBeijing:ChineseAgriculturalTechnologyPress, LinSQMedicinalMushroomProductionandProductDevelopmentinChina(中国药用菌生产与产品开发)MBeijing:ChineseAgriculturalPress, LinZBModernResearchonGanoderma(灵芝的现代研究)MndedBeijing:BeijingMedicalUniversityPress, HeQY,LiRZ,CaiTW,etalChemicalresearchonglycopeptidesofGanodermaJChinTraditHerbDrugs(中草药),,(): ZhangJS,HanWWStudiesonchemicalstructureofpolysaccharidesfromCiolusversicolor(É)JEdibFungi(食用菌),,(): AndrewsPThegelfiltrationbehaviorofproteninsrelatedtotheirmolecularweightsoverawidereangeJBiochemistry,,: ZhangYSDeterminationofpolysaccharidesstructureJActaNortheastTeachersUnivNatSci(东北师范大学学报自然科学版),,(): FangJNStructuralanalysisofpolysaccharidesJMedRes,,: AgrawalPKNMRspectroscopyinthestructuralelucidationofoligosaccharidesandglycosidesJPhytochemistry,,(): FangJNApplicationofCNMRtostructuralanalysisofpolysaccharidesJAbroadMed,,():《中国中西医结合杂志》年征订启事  《中国中西医结合杂志》是由中国科协主管,中国中西医结合学会和中国中医研究院主办的,全国性中西医结合综合性学术期刊,年创刊,主要报道我国中西医结合在临床、科研、预防、教学等方面的经验和成果,探讨中西医结合思路和方法,介绍国内外有关本专业的进展。本刊设有:述评、专题笔谈、临床论著、实验研究、博士之窗、论著摘要、学术探讨、思路与方法学、基层园地等栏目。本刊为大开本,月刊,国内外公开发行年页码增加至页,全部用铜版纸印刷,国内定价为元ö期,全年定价元。国内邮发代号:,国外代号:M。本社还有英文版《CHINESEJOURNALOFINTEGRATIVEMEDICINE》,为季刊,大开,页,国内外公开发行,国内定价元ö期,全年定价元,国内邮发代号:,国外代号:(QR)。也可直接汇款至本社邮购。地址:北京西苑操场号中国中西医结合杂志社 邮编: 电话:() 传真:()中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第卷第期年月

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