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番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡观察.pdf

番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡观察

luvie2011 2012-07-25 评分 0 浏览量 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡观察pdf》,可适用于人文社科领域,主题内容包含畜牧兽医学报,():ActaVeterinariaetZootechnicaSinica番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡观察祁保民,陈晓燕,吴宝成,姚金符等。

畜牧兽医学报,():ActaVeterinariaetZootechnicaSinica番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡观察祁保民,陈晓燕,吴宝成,姚金水,张红雷(福建农林大学动物科学学院,福州泉州出入境检验检疫局,泉州)摘要:以番鸭呼肠孤病毒人工感染日龄健康番鸭,运用原位末端标记技术及免疫组织化学方法,对番鸭呼肠孤病毒感染后番鸭多种组织的细胞凋亡进行检测,对死亡因子FasL的表达进行研究。原位末端标记检测显示,多种组织器官中出现大量阳性细胞,表明番鸭呼肠孤感染可引起肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胸腺、盲肠和法氏囊发生不同程度的细胞凋亡。免疫组织化学研究结果表明,感染番鸭呼肠孤病毒后,肝脏、肾脏、肺脏、胸腺、盲肠和法氏囊等多种组织中可观察到FasL表达,且各种组织FasL表达的强弱与原位末端标记检测的细胞凋亡指数高低相一致。结果表明番鸭呼肠孤病毒诱导细胞凋亡的机制与FasL的表达密切相关。关键词:呼肠孤病毒细胞凋亡鸭中图分类号:S文献标识码:A文章编号:()收稿日期:基金项目:福建省自然科学基金(B)作者简介:祁保民(),男,河南虞城人,教授,硕士,主要从事动物病理学研究,Tel:,Email:qbmcomTheObservationoftheApoptosisInducedbyMuscovyDuckReovirusQIBaomin,CHENXiaoyan,WUBaocheng,YAOJinshui,ZHANGHonglei(CollegeofAnimalScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,ChinaQuanzhouEntryexitInspectionandQuarantineBureau,Quanzhou,China)Abstract:dayoldMuscovyduckswereinfectedwithMuscovyDuckReovirusApoptosisweredetectedandtheexpressionofFasLwerestudiedinmanyinfectedtissuespostinfection,usinginsituendlabelingtechniqueandimmunohistochemistrymethodTheresultofinsituendlabelingrevealedthatalargenumberofpositivecellswerefoundinmanytissues,whichshowedthatMuscovyduckreoviruscouldinducevaryingdegreedapoptosisintheliver,spleen,kidney,lung,thymus,cecumandbursaoffabriciusTheresultofimmunohistochemicalstudyshowedthattheexpressionofFasLwereobservedinliver,kidney,lung,thymus,cecumandbursaoffabricius,andthechangesofFasLexpressionwerehighlycorrelatedwiththelevelofapoptoticindexTheresultsshowedthatthemechanismofapoptosisinducedbyMuscovyduckreovirusiscloselyrelatedwiththeexpressionofFasLKeywords:reovirusapoptosisduck细胞凋亡在维持机体内环境稳定方面起着十分重要的作用。病原微生物感染后,可诱导机体细胞凋亡或抑制细胞凋亡,凋亡是病原微生物对机体造成的损伤之一,同时也是一些疾病的重要发病机制。年以来,我国广东、福建、浙江等省的雏番鸭发生一种以肝、脾坏死为主要特征的传染病,被称为番鸭白点病、番鸭花肝病,给水禽生产造成了极大的损失。系统地探讨番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡以及细胞凋亡发生的机制,将有助于阐明病毒感染细胞后病毒的致病机理,为临床诊断、预防及治疗提供可靠的依据。从鸡、火鸡、鸭、鹦鹉等发病个体中均分离到禽呼肠孤病毒病毒。年Malkinson等报道了番鸭呼肠孤病毒感染,主要病变为肝脏、脾脏、肾脏上形成坏死灶。Shih等研究表明禽呼肠孤病毒S株的RC蛋白可诱导培养细胞BHK和畜牧兽医学报卷Vero细胞发生凋亡。我国发生的番鸭花肝病的病原是番鸭呼肠孤病毒,该病的病理组织学病变特征为肝脏、脾脏内出现大量凝固性坏死灶。除急性坏死外,还可见组织器官中的单核)巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞发生凋亡。番鸭呼肠孤病毒可诱导番鸭胸腺、脾脏、法氏囊的细胞发生凋亡。对感染鸭脾脏、胸腺和法氏囊进行超微结构观察,发现这些组织中的淋巴细胞、浆细胞发生坏死和不同程度的凋亡。许多病原体感染后对宿主细胞的凋亡具有调节作用,这种调节作用是疾病发病机制的一部分。如HIV感染导致CDT淋巴细胞凋亡。番鸭呼肠孤病毒感染后,肝脏、脾脏、法氏囊、胸腺、肾脏等多种组织器官均出现不同程度的损伤,除免疫器官内的细胞发生凋亡外,其他器官中是否有细胞凋亡发生未见有报道。目前,对于番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡的发生机制尚不清楚。FasFasL途径是细胞凋亡信号转导途径之一。FasL是Fas(CD)的配体,属死亡因子。Fas属死亡受体,是肿瘤坏死因子受体家族的成员,具有介导细胞凋亡的作用。FasL是否参与番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡未见报道。本试验用番鸭呼肠孤病毒感染雏番鸭,对肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、盲肠、法氏囊、肺脏、大脑等多种组织器官进行系统的凋亡研究,并对这些组织器官中FasL的表达情况进行检测,阐明番鸭呼肠孤病毒感染后发生细胞凋亡的组织和细胞,以及细胞凋亡发生过程中FasL的表达情况。材料与方法材料病毒禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株,由福建农林大学动物科学学院传染病实验室提供。试验动物日龄番鸭只,出壳后未接种任何疫苗。经周适应性饲养后,随机分为试验组只和对照组只,隔离饲养,饲喂鸭全价饲料,自由采食和饮水。经ELISA检测血清,抗番鸭呼肠孤病毒抗体为阴性。主要试剂兔抗人FasL多克隆抗体(美国NEOMARKERS公司,C),酶标抗兔聚合物(丹麦Dako公司,)原位末端标记检测试剂盒(碱性磷酸酶标记)(瑞士Roche公司,),溴氯吲哚基磷酸二钠盐(碱性磷酸酶的底物),蛋白酶K(德国Merck公司,),DAB浓缩显色液,核快红,苏木素染色液、多聚L赖氨酸(Sigma公司,K)。方法番鸭的番鸭呼肠孤病毒人工感染及样品采集只番鸭,随机分为组,试验组只和对照组只。试验组肌肉注射番鸭呼肠孤病毒YB分离株(TCID)病毒液,接种剂量为稀释倍后的病毒液mL#只。对照组同部位注射等量灭菌生理盐水。接种后第、、、、、、、、、h和、d共个时间点随机取试验组只及对照组只剖杀,每只番鸭均取肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、法氏囊、大脑、小脑、盲肠等材料,(VV)福尔马林溶液固定。FasL检测采用免疫组织化学染色法。染色结果观察与判定:FasL免疫反应阳性物质呈棕黄色或棕褐色颗粒,分布于细胞浆。细胞核呈浅蓝色。原位末端标记检测操作方法参照文献。染色结果观察与判定:光镜观察,阳性细胞的胞核被染成深蓝色或蓝黑色,阴性细胞细胞核染成红色。数据统计与处理凋亡指数AI()=一定范围内的阳性细胞数同一范围内细胞总数。每张切片在显微镜下随机选取个视野(),计算细胞凋亡指数,取其平均值,进行组间差异检验,结果以平均数和标准差(Šxs)表示。结果原位末端标记法检测结果试验组番鸭:肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊和盲肠中均检测到大量阳性细胞。阳性细胞的核染色后呈深蓝色,阴性细胞的核呈红色。肝脏中的阳性细胞是肝细胞和枯否氏细胞(图A),同时可见肝脏中变性、坏死的肝细胞。脾脏中的阳性细胞是淋巴细胞(图B),肾脏中的阳性细胞是肾小管上皮细胞(图C),胸腺中的阳性细胞是淋巴细胞(图D),法氏囊中的阳性细胞是淋巴细胞(图E),盲肠中的阳性细胞是固有层内的淋巴细胞。肺脏中只能检测到少量阳性细胞,是肺脏间质中的巨噬细胞及淋巴细胞,未见肺泡上皮呈阳性。心脏、脑组织中未见阳性细胞。对照组番鸭:组织经染色后,在胸腺和法氏囊中检测到少量的阳性细胞,其他组织中未见阳性细胞。期祁保民等:番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡观察A肝脏中的阳性细胞({,感染后h)B脾脏中的阳性细胞({,感染后h)C肾脏中的阳性细胞({,感染后h)D胸腺中的阳性细胞({,感染后h)E法氏囊中的阳性细胞({,感染后h)F肝细胞({)表达FasL(感染后h)G脾脏内淋巴细胞({)表达FasL(感染后h)H胸腺内淋巴细胞({)表达FasL(感染后h)I法氏囊内淋巴细胞({)表达FasL(感染后h)(AETUNEL,FI免疫组化染色,)APositivecells({)intheliver(hpostinfection)BPositivecells({)inthespleen(hpostinfection)CPositivecells({)inthekidney(hpostinfection)DPositivecells({)inthethymus(hpostinfection)EPositivecells({)inthebursaofFabricius(hpostinfection)FExpressionofFasLinthehepatocytes({)(hpostinfection)GExpressionofFasLintheLymphocytes({)ofspleen(hpostinfection)HExpressionofFasLintheLymphocytes({)ofthymus(hpostinfection)IExpressionofFasLintheLymphocytes({)ofbursaofFabricius(hpostinfection)(AETUNEL,FIimmunohistochemicalstaining,)图原位末端标记法检测及FasL的表达FigDetectionwithTUNELandtheexpressionofFasL试验组番鸭与对照组番鸭各组织细胞凋亡指数统计结果见表。表试验组与对照组组织中细胞凋亡指数统计TableStatisticsofapoptoticindex(AI)inthetissuesofexperimentalgroupsandcontrolgroup组织Tissue肝脏Liver脾脏Spleen肾脏Kidney肺脏Lung盲肠Cecum法氏囊BursaofFabricius胸腺Thymus大脑Cerebrum小脑Cerebellum心脏Heart试验组Experimentalgroup对照组Controlgroup结果ResultP<P<P<P<P<P<P<P<表示对照组与试验组差异极显著P<representsthedifferencebetweencontrolgroupandexperimentalgroupswasextremelysignificant畜牧兽医学报卷表显示,对照组番鸭肝脏、胸腺和法氏囊中也有凋亡发生,其凋亡率较低感染组番鸭的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、盲肠、法氏囊和肺脏都发生了明显的凋亡,凋亡率显著高于正常对照组。FasL检测结果接种后h,感染番鸭的脾脏、胸腺和法氏囊组织中开始出现FasL表达阳性细胞。接种后h,感染番鸭的肝脏和盲肠组织开始出现FasL表达阳性细胞。肾脏组织在接种后h出现FasL阳性细胞,肺脏则在接种后h才可检测出FasL表达阳性细胞。接种后h肝(图F)、脾(图G)、肺和盲肠组织FasL表达阳性细胞数量达到最多,而肾脏、胸腺(图H)和法氏囊(图I)组织则在接种后hFasL表达阳性细胞的数量达到最高。感染番鸭的心脏和脑组织中未检测到FasL表达阳性细胞。对照组:肝脏、脾脏、肾脏、盲肠中未见FasL表达阳性细胞,番鸭胸腺、法氏囊中可见少量FasL表达阳性细胞。讨论呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡原位末端标记(insituendlabeling,ISEL)或称末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TdTmediateddUTPnickendlabelling,TUNEL),将标记核苷酸原位掺入并结合到DNA断裂点上,标记的细胞是发生凋亡的细胞,即阳性细胞为凋亡细胞。具有反应快速、特异性、敏感性较高的特点,是检测细胞凋亡的可靠方法之一。本试验用原位末端标记法检测细胞凋亡,在感染鸭的肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胸腺、盲肠和法氏囊中均检测到阳性细胞。表明番鸭呼肠孤病毒除能够诱导淋巴细胞、浆细胞、单核巨噬细胞发生凋亡外,肝脏、肾脏、肺脏等器官也发生明显的细胞凋亡,其中肝脏的肝细胞、肾脏的肾小管上皮细胞发生凋亡未见报道。本研究结果还显示,呼肠孤病毒感染番鸭的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、和法氏囊等器官既有细胞坏死,又有细胞凋亡。病毒在细胞内大量复制,造成细胞坏死,细胞破裂,细胞内容物的外泄,有利于病毒的扩散。另一方面机体通过细胞凋亡的形式清除体内病毒感染的细胞,阻止病毒的复制。因此,坏死和凋亡的同时存在也反映了病毒与宿主之间损伤与抗损伤的斗争过程。FasL表达与宿主细胞凋亡Fas是一种死亡受体,FasL(Fasligand,FasL)是Fas的配体。Fas系统是细胞毒T细胞杀伤病原体感染的靶细胞的机制之一,病原的刺激使细胞毒T细胞表达FasL,FasL通过与Fas结合,杀伤携带Fas的细胞。Fas与FasL的相互作用可以发生在同一细胞,也可发生于两个细胞之间。观察表明呼肠孤病毒感染番鸭后,FasL可在体内多种组织高表达,提示呼肠孤病毒在体内诱导的细胞凋亡可能与FasL表达密切相关,FasFasL途径可能是病毒诱导细胞凋亡的机制之一。番鸭感染呼肠孤病毒后,病毒诱导宿主细胞分泌死亡因子FasL,FasL可能以自分泌和旁分泌两种方式分泌:感染病毒的细胞自分泌FasL,与自身的Fas结合诱导自身细胞凋亡以旁分泌形式分泌FasL时,FasL与邻近细胞上的Fas结合,诱导其凋亡。呼肠孤病毒感染与免疫抑制试验结果显示,呼肠孤病毒感染番鸭后,脾脏、胸腺、法氏囊等淋巴器官的淋巴细胞数量明显减少。其原因一是由于淋巴细胞坏死,二是病毒诱导的淋巴细胞凋亡。中枢免疫器官胸腺、法氏囊中淋巴细胞的减少,必然会影响到机体的免疫机能,造成机体免疫机能降低,因此呼肠孤病毒感染能导致番鸭的免疫抑制。临床上发病鸭表现为病程长且发病后期常继发其他疾病(如鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌等),与病毒引起的免疫抑制密切相关。本试验观察到对照组胸腺、法氏囊淋巴细胞出现凋亡。正常胸腺组织中淋巴细胞发育过程中存在阳性选择和阴性选择,阴性选择即细胞凋亡。人类B细胞在骨髓内发育过程中,具有潜在自身反应性的未成熟B细胞被清除的机制之一就是克隆排除,即发生细胞凋亡。法氏囊是禽类B细胞分化、发育的场所,对照组鸭法氏囊内淋巴细胞出现凋亡,我们认为这是禽类清除自身反应性B淋巴细胞的机制之一。结论呼肠孤病毒感染番鸭后,胸腺、脾脏和法氏囊的淋巴细胞、肝脏的肝细胞、肾脏的肾小管上皮细胞均发生凋亡。心肌细胞、神经细胞、肺泡上皮不发生细胞凋亡。发生细胞凋亡的组织中均有FasL表达,未发生细胞凋亡的组织中未见FasL表达。FasL参与了期祁保民等:番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡观察呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡,FasFasL途径可能是细胞凋亡发生的机制之一。参考文献:王丙云,谭玉琴,计慧琴,等感染白点病番鸭抗氧化功能的变化J中国兽医科技,,():黄爱芳,刘思伽番鸭花肝病流行病学诊断与防制J动物医学进展,,():MALKINSONM,PERKP,WEISMANYReovirusinfectionofyoungMuscovyducks(Cairinamoschata)JAvianPathology,,:SHIHWL,HSUHW,LIAOMH,etalAvianreovirusRCproteininducesapoptosisinculturedcellsJVirology,,():吴宝成,陈家祥,姚金水,等番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定J福建农业大学学报,,():祁保民,黄瑜,李文杨,等鸭白点病的病理观察J中国兽医杂志,,():姚金水,吴宝成,陈文列,等禽(番鸭)呼肠孤病毒诱导脾脏单核巨噬细胞和淋巴细胞凋亡的超微观察J福建农林大学学报(自然科学版),,():陈志胜,马春全,卢玉葵,等番鸭呼肠孤病毒诱导雏番鸭免疫器官细胞凋亡的研究J中国预防兽医学报,,():陈少莺,胡奇林,程晓霞,等番鸭呼肠孤病毒病雏番鸭实质器官的超微结构J中国兽医学报,,():THOMPSONCBApoptosisinthepathogenesisandtreatmentofdiseaseJScience,,:GOUGEONML,MONTAGNIERLApoptosisinAIDSJScience,,:张平凋亡的双向调节机制J中华病理学杂志,,():ZENGJY,FOURNIERP,SCHIRRMACHERVInductionofinterferonAandtumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligandinhumanbloodmononuclearcellsbyhemagglutininneuraminidasebutnotFproteinofNewcastlediseasevirusJVirology,,():NAGATAS,GOLSTEINPTheFasdeathfactorJScience,,:GALLEPR,HOFMANNWJ,WALCZAKH,etalInvolvementoftheCD(APOFas)receptorandligandinliverdamageJTheJournalofExperimentalMedicine,,:龚非力医学免疫学M北京:科学出版社,

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