花色苷类物质分离鉴定方法

《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 NO．4 花色苷类物质分离鉴定方法 姜平平 吕晓玲 朱惠丽 (天滓科技大学食品科学与生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院，天津 300222) 摘要：本文系统介绍了花色苷类物质的分离鉴定方法。 关键词 ：花色苷 ，分离 。鉴定 Review of Isolation and Ident}fjCatiOn Methods of Anthocyanins Jiang Pin印ing，Lv Xiaoling，Zhu Huili (Tianjin U niversity of Science and Technology， School of Food Science and Bioengineering，Tianjin 300222) Ah m吐：The isolation and identification methods，including PC，TLC，GC，HPLC，chemical degradation，nuclear mag- netic resonance(NMR)，mass spectrometry(MS)，were reviewed in this article． Key啊0Hb：Anthocyanins，Isolation，Identif~ation 花色苷类物质是 自然界分布最广泛的水溶性 植物色素之一，大部分的花和果实中都存在。在国 内以往都是以天然色素的形式加以开发利用的。 近年来又发现其具有独特的生理功能。已有文献 指出花色苷具有抗氧化性，抗血栓，预防糖尿病等 功效 ，一些含有花色苷的功能性食品，化妆品也出 现了。但国内在对花色苷进行研究时，对一种花色 苷色素具体成分的鉴定工作做的还不够，本文在此 对花色苷类色素的分析方法加以总结。 1 分离提纯 花色苷的粗提物往往有较多的杂质，难于对其 进行鉴定，只有将各组分进行分离提纯为单体花色 苷后，才能进行鉴定，确定其化学结构。分离纯化 的方法主要是层析法 ，包括纸层析(PC)，薄层层析 (TLC)，柱层析 (CC)，以及高效液相色谱法 (HPLC)等。 纸层析是分离天然色素的一种较为传统的方 法，但其具有快速，设备简便等优点。对于花色苷 的分离常用新华 No。3或 WhatmanNo。3层析纸， 108 以水系溶液为展开剂，如酸化正丁醇水溶液(BAW ：正丁醇 一醋酸 一水 =4：l：5 v／v／v)。展开后，可 剪下色斑 ，以酸化甲(乙)醇洗涤 ，浓缩，即可得到样 品。⋯ 苏红等人采用三次纸层析法得到甘蓝红色素 的主要花色苷：矢车菊素一3一双芥子酰槐二糖一5 一 葡萄糖苷，三次的展开剂分别为 BAW(正丁醇： 乙酸 ：水 =4：1：5 v／v／v)，BAW(正丁醇：乙酸：水 = 4：1：5 v／v／v)，BH(正丁醇 ：2mol／L盐酸 =1：1 v／ v)，15×30cm新华 N0．3层析纸，上行法。【2 J 薄层层析原理与纸层析法相同，也可采用与纸 层析法相同的展开剂。HarbortJ．B．以硅胶为层析 支持剂，以乙酸乙酯 一甲酸 一2moL／L盐酸(85：6：9 v／v／v)为展开剂分离花色苷，适用于锦葵苷和芍药 苷。还有报道采用微晶纤维素做支持剂，不同比例 的盐酸一乙酸水溶液做展开剂，分离花色苷原。l3j 柱层析也常被应用在花色苷类色素的分离提 纯中。早期主要填料为氧化铝，后来又采用吸附树 脂，凝胶等等。台湾的蔡正宗等人在分析红凤菜 (Gynura bicolor)中所含花色苷时采用了将花色苷 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2oo3 NO ． 4 混合物浓缩后通人 polyrcar ATC聚乙烯吡咯烷酮 (Pl0yvinylpyrr0lid0ne，PVP) 管 柱 (150 × 25mmI．D。)，以酸化 50％甲醇为解吸的方法，得到 两种主要的花色苷。l j陈叔凰等人也采用将色素 浓缩液通人 Bio GelP一2管柱(450×25mmI．D．)， 以水(pH=2．0)冲提，再以 AmberliteXDA一7树脂 柱浓缩，再过 BioGelP一2管柱纯化的方法获得黑 米花色苷的主要成分 ：芍药素 一3一葡萄糖苷和矢 车菊素一3一葡萄糖苷。【 ]武彦文等人以葡聚糖凝 胶 SephadexG一25做柱层析，酸化 甲醇水溶液冲 提，成功得到萝 卜红色素的主要花色苷成分。[6] 高效液相色谱法(HPLC)应用于花色苷物质 的分离具有分析时间短，分辨率高，无热分解的危 险，需样量少等优点。武彦文等人曾以 HP 1090 HPLC对萝 t-红色素花色苷进行分析 ，得到两种花 色苷单体，操作条件：EKOKromasil一100C18200× 4．6mm色谱柱，流动相为石油醚：甲醇：异丙醇(30 ：5：6)，柱温 25℃，柱压 12．2MPa，流速 lml／min。l_6J 台湾的樊谦腾等人以 HPLC法分离山竹果壳中的 花色苷 ，采用野村公司的 DevelosilODS一10柱(250 ×20mm)，流动相 ：乙酸 ：CH CN：水(4：5：11)的 3％磷酸水溶液。l7 J0hannaBakkereta1．采用的是 5／．tm Sphefisorb ODS一2柱 (100×8mm)，柱 温 40℃，流速 2mL／min，流动相 1％TFA和甲醇的线 性混合物(甲醇20％--~46％in46min)，分离红酒复 杂的花色苷。_8．8 当然，有时通过一种层析法难于适合浓度，体 积的单体花色苷，所以通常会是两种或两种以上方 法的联用，如上文的例子 中，即有以纸层析初分 ， HPLC或凝胶层析细分，吸附树脂柱层析浓缩三步 的方法获得理想的花色苷样品。 2 鉴定 2．1 纸层析法 纸层析法在20世纪 40年代就广泛采用，到目 前已经积累了很多的实验数据。在鉴定时，即使没 有 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品，通过同一样品在三到四种不同展开剂的 Rf值，对照标准 Rf值，也可以粗略估计出样品所 含花色苷的种类。常用的展开剂有 BAw(正丁醇： 乙酸：水 =4：1：5v／v／v)，BH(正丁醇：2mol／L盐酸 = 1：1v／v)，1％HCl(浓盐酸 ：水 =3：97v／v)，AHW (乙酸：浓盐酸：水 =15：3：82v／v)。叶兴乾就采用 该法推测荸荠种杨梅中所含主要花色苷的苷原分 别为矢车菊素，天竺葵素，飞燕草素，芍药素。[9]苏 金为应用该法分析出黑米色素的两种主要花色苷 为矢车菊素一3一葡萄糖苷和矢车菊素 一3一鼠李 糖苷。[10] 采用特殊薄层进行分析也是可以的。蔡正宗 在分析红凤菜花色苷时，就采用薄层层析(cellulose — TLC)，采用 BAW，AHW，1％HCI上行法推测花 色苷结构。l J 2．2 光谱分析法 2．2．1紫外 一可见光谱法(uV—VIS Spectrum) 早在 1958年 HarboneJ．B．就撰文讨论了紫外 一 可见光谱法在花色苷类物质结构鉴定中的应用， 目前也通常沿用该种方法。[11 J 该法的要点主要有以下几点： 1．可见光区的最大吸收波长(入一 一vi8)：一般 是指花色苷在 0．01％HCI一甲醇中的最大吸收波 长。 2．添加 A1C1 对可见光 区的最大 吸收波长 (入 一 ．填)的影响：一般是向色素的0．01％HCI一甲 醇溶液中滴加 3—5滴 AICI 的乙醇溶液。若出现 蓝移现象，则说明该花色苷 B环上含有两个相邻 的羟基。 3．添加甲醇钠(NaOMe)对可见光区的最大吸 收波长(入一一 )的影响：若出现红移现象，且吸光 度值不随时间下降，则此花色苷具有 4 位羟基，且 3位羟基上形成糖苷。l7 J 4．花色苷在 440nm下的吸光度值与 入一一vi8 下吸光度值(A44onm／A一 一vi8)：参考文献值可以判 断花色苷分子内酰基的个数。 5．该花色苷在 300nm一330nm间有无吸收峰 ：若花色苷在此区域内没有吸收峰，则可判断该花 色苷分子内没有酰基。 6．该花色苷在紫外光下是否有荧光：在紫外 光下有荧光表明该花色苷在5位有取代基。 7．通人二氧化硫后是否褪色：当黄烊阳离子 (flav~rhum cations)在 4位上有苯基或甲氧基时，通 入二氧化硫后不褪色。 杨正宪等人在分析桑葚中所含两种主要花色 苷时，根据下表即判断两种花色苷原都是矢车菊素 3位上有糖苷键。[ ] l09 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 N0．4 1 284．5 530．0 2 284．0 ‘29 0 *表示没有现象 23 * 22 * 37 * 41 * 2．2．2红外吸收光谱法- 早在 50年代，同外的科学家就开始应用红外 光谱研究花色苷，目前也积累了较多得数据。： 样 品作出(多为溴化钾压片)红外光谱与标准图及数 据对照，可以对花色苷的结构有进一步的了解。 花色苷的红外光谱主要有苯环，含氧杂环，糖 和羟基，甲氧基四部分。其中杂环的 C：0键的吸 收峰在 1630—1620cm～，苯环和杂环的 C—C键 有三个 吸收峰 ：I：1605—1580cm～，II：1577— 1565cm～．m：1518—1485cm～。苯环 C—H键的 吸收峰在 900—800cm～，4一H：905—885em～，6 一 H：839—848cm一 ，8一H：809—830em一 。B环 c—H键的吸收峰位置受取代基影响，不同的苷原 也不相 同。甲氧基 和羟基 的吸收峰在 l120一 lOlOem～。花色苷的乙酰化产物的 C=0键引起 的峰在 1684—1695em～。 2．3 花色苷的水解分析法 将花色苷在特定条件下水解，分离 出苷原和 糖，再分别测定，也是 HarboneJ．B．提出的一种分 析花色苷的方法。 常用的分离苷原和酰化剂的方法为：色素的甲 醇溶液在酸性条件下 (1：l加人 2m0l／，LHC1)水浴 回流，戊醇萃取苷原，挥发戊醇，可得纯化得苷原样 品，以N一甲基双辛胺的氯仿溶液除去酸，浓缩干 燥可得分析用酰化剂样品。除去苷原和酰化剂的 水解液以氯仿除去多余的胺。浓缩经过微孔过滤 器，可用于分析。 各样品的分析方法主要有微晶纤维素薄层层 析法 (CellucoseTLC)，纸层析，HPLC，分析糖类时 还有采用衍生化气相色谱法的报道。 苏金为在分析黑糯米花色苷时，参照细菌细胞 壁糖的分析方法，采用硅胶 H作为层析支持剂，标 准糖作为平行样，色素水解物点样，乙酸乙酯一甲 醇一乙酸 一水(12：3：3：2v／v／v／v)作展开剂，茴香 醛一硫酸作为显色剂的方法分析出糖为葡萄糖和 鼠李糖两种。【m J 糖本身是多元醇，分子量高，挥发性差，稳定性 l10 差，在气相色谱(GC)不能直接进样测定。钟丽玉 等人在分析黑米花色苷时就采用了衍生化气相色 谱法。在样品中加人盐酸羟胺和吡啶，(3：2)90℃ 下加入乙酸酐发生乙酰化反应，干燥后以氯仿溶解 进样测定，确定黑米的两种主要花色苷均为单糖 苷，且为阿拉伯糖和鼠李糖。【l3 J 2．4 花色苷分子量的测定 一FAB—MS 质谱是二十世纪初发展起来的物理分析方法。 在一定条件下能对复杂的有机物给出确定的，可以 重复的质谱图，由分子的断裂规律得到许多的结构 信息。FAB(Fast AtomBombardment)是八十年代 发展出的新离子源，多采用惰性气体，如氩，氙等中 性原子流轰击样 品使之离子化。FAB—MS具有 教高的灵敏度，适用于分析极性大分子量较大的化 合物。[1 ] Johanna Bakker，ColinF．Timberlake在分析红 酒花色苷时，将样品溶解于稀盐酸中，在铜探测器 上真空干燥，与甘油混匀后进样，5—7kV氙原子流 轰击。组分 A分子离子[M] 峰在 m／z561处，第 一 碎片峰在 m／z399处，质量差为 162，对比锦葵 素一3一葡萄糖苷分子离子峰[M] 在 m／z493，第 一 碎片峰在 m／z33l处。推断出 m／z399处为失 去葡萄糖的碎片离子峰，而且 m／z[A—M] 较 m／z [malvidin—M]高 68(对应于 c302)，则必有一酰 基，组分 A应为有一个酰基的单糖苷。【 J 樊谦腾，苏正德分析山竹果壳花色苷组分 l 时，由分子离子峰[M+1] 在 m／z612处，碎片离 子峰[M—sop．horose+H20+1] 在 m／z288，推断 其苷原为矢车菊素。-7 J 2．5 核磁共振波谱法(NMR) 核磁共振技术是有机结构鉴定的重要手段之 一 。 在分子生物学，药物化学，植物化学等诸多方 面有广泛的应用。应用于花色苷的分析从二十世 纪七十年代末已经开始了。常用的有 H—NMR 和13C—NMR谱法。 J 花色苷在不同pH值条件下，会发生结构的变 化，在酸性环境中呈烊盐离子态时较容易测定，所 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o3 NO．4 以常用以下溶剂：CD3一TFA—d(氘代甲醇 一三氟 醋酸)，DMSO—d6一TFA(六氘代二甲亚砜 一三氟 醋酸)，D2O—DCl(重水 一氘代氯化氢)，CD3OD— DC1。 各质子的信号范围：苷原 9—6ppm，糖中半缩 醛的质子 6—4．5ppm，H>C=H