酶联免疫吸附（ELISA）法在食品微生物检测中的应用

《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．4 酶联免疫吸附(ELISA)法在食品微生物检测中的应用 陈爱华 杨坚 (西南农业大学食品科学学院，重庆400716) 摘 要：介绍了酶联免疫吸附(ELT~A)分析的原理及方法，并就其在食品微生物检测中的应用作了较详细的 描述。 关键词：酶联免疫吸附分析法(ETJ．~A)，食品微生物，检测 The Technology of Enzyme—Linked Immunosorbent Assay(ELISA) hl峨， Ji锄 (Food Science College，Southwest Agriculture University，Chongqing 400716) ，sl期d：h this pier，the technology of Enzyme-Linked lmmunosorbent Ass8y(Ⅱ工sA)wa8 introduced，including the prlnc~ple and methods．The application ofⅡJsA in analysis offood mic唧 ni鲫 s was commentedindetails． Key w0—s：El1,qA，Food microorganisms，Determination 酶联免疫吸附测定法(Enzyme—Linked lm． munosorbent Assay；简称 EusA)是从酶标记抗体技 术发展起来的。1966年，Nakane和 Avrameas首先 用酶标记抗体在普通光学显微镜下定位抗原。 1971年。Engvan和 Perlman以及 Weeman和 Sehuurs 仿照放射免疫测定法(RIA)的竞争性测定原理，使 酶标抗原与待测标本中的未标记的抗原，竞争结合 一 定量的抗体，然后分离游离的和结合的标记抗 原，测定酶活性，即可得到待测抗原量。次年，Eng- vail等改用酶标记免疫球蛋白，提高了标记效率， 避免了半抗原标记困难的问题，也简化了操作手 续-1 J。酶联免疫吸附测定法结合了免疫荧光法和 放射免疫测定法两种技术的优点，具有可定量、反 应灵敏准确、标记物稳定、适用范围宽、检测速度快 以及费用低等特点。 1 酶联免疫吸附的原理与方法 1．1 原理 酶联免疫吸附测定的基本原理是把抗原或抗 体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种 固相载体表面；测定时，将受检样品(含待测抗体或 抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相 载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合 物；反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结 合量(免疫复合物)即与标本中待检抗体或抗原的 量成一定比例；经洗涤去除反应液中其他物质，加 入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变 为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量 即可确定样品中待测物质含量 2。 1．2 方法 ELISA常用的测定方法主要有直接法和间接 法两种：直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相 抗原直接作用，加入底物后，显色(其颜色深浅与样 本中抗原量成正比)；间接法是使已知抗原吸附在 固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，再加入 酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白(抗抗体)，使 与特异抗原抗体复合物中的抗体作用，加入酶底 物，显色(颜色深浅与样本中抗体量成正比)-1 J。 ELISA有许多改良方法，如双抗体法 (sandwich EUsA)、双抗体 夹心法 (double-antibody sandwich technique)、竞争法、酶 一抗酶法和均质法(homoge． n~LI8 EusA)、生物素 一亲和素放大系统(biotina． 109 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．4 vidin system，BAS)ELISA及斑点．ELISA(dot．ELISA) 等，大致可分为三类：(a)测定抗体的间接法；(b) 测定抗原的双抗体夹心法：(c)测定抗原的竞争 法 3。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗 原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗 原的方法，因而尤其适用于食品分析。 竞争酶联免疫吸附分析法又可分为直接竞争 法和间接竞争法。直接竞争法主要有三步：抗体吸 附于固相载体，温育后清洗一加入含有抗原的待测 液及酶标记的抗原，温育后清洗一加入酶底物温育 后显色，判断结果。间接竞争法主要有四步：抗原 吸附于固体载体，温育后清洗一加入含有抗原的待 测液和抗体，温育后清洗一加入酶标记抗体，温育 后清洗一加入酶底物温育后显色，判断结果[ 。 1．3 操作要点 影响ELISA测定结果的因素主要包括以下几 点： (1)抗原包被的质量。将抗原固定于聚苯乙烯 微量反应板中称之为包被，其效果好坏是影响抗原 一 抗体反应的重要因素； (2)非特异性反应干扰的排除。除了设置稀释 液空白、阳性和阴性参比血清等对照外，可采用包 埋、封闭等预处理，如在包被液中加入牛血清白蛋 白、明胶或吐温一20等，以减少非特异性反应的发 生。高选择性的单克隆抗体代替多克隆抗体也是 提高ELISA特异性的另一有效途径 3。此外，选择 表面积较大的固相载体，也有利于提高ELISA的敏 感性； (3)酶和交联剂的选择。用于 ELISA标记的 酶，主要有辣根过氧化氢酶(HRP)、碱性磷酸酯酶 (AKP)、葡萄糖氧化酶(GO)和半乳糖苷酶等，而以 HRP用得较多。酶和抗体交联可用免疫法(酶一 抗酶抗体)或化学法，常用化学法。一般来说，HRP 与抗体的交联现多采用改良Wilson’S法(高碘酸钠 氧化法)，AKP与抗体交联通常有戊二醛法和偶氮 法[3]； (4)酶底物。它本身要求无色，反应后能稳定 呈色。一般HRP常采用邻苯二胺(产物桔黄色，可 稳定呈色数小时)或邻联甲苯胺作酶底物；AKP常 用对硝基苯磷酸盐作酶底物。 110 2 酶联免疫吸附在食品微生物检测中的应 用 2．1 细菌的检测 沙门氏菌是引起细菌性食物中毒的最主要致 病菌之一。文其乙等 5(1996年)实验应用直接 ELISA方法对 500份蛋品检测，表明方法可靠，且 阳性率比国标方法高，经用生化实验进一步验证， 确认国标方法存在一定的漏检。目前，多采用制备 单克隆抗体的ELISA方法进行检测。有报道称其 最低检测量可达 500cfu／g，仅需 22h，并实现了以 ELISA技术为基础的全自动检测_6_6。 有报道称采用夹层 ELISA技术对金黄色葡萄 球菌的检测，可在 18h内完成lcfu／g的检测[ 。 uIl H．H．和R．M．ust 8J(1986年)采用El,ISA方 法检测了番茄酱中3种霉菌 (A／ternar／a a／ternar／a， Geotr／c~ ，Rh~rus stdonifer)，结果表明该方 法可检测番茄酱中lug／g干霉菌样品，比化学法灵敏。 C巧r锄等【93(1990年)在研究大肠埃希氏杆菌( ． c^e co／i．)内毒素时，将E1]SA法与DNA探针技术 等进行比较，发现ElJSA技术更灵敏、快速。 姚永忠等【10J(1993年)采用 BA—D ⅡJcsA 检测食品中的单核白细胞增多症李氏杆菌。用该 法可检出在蛋白胨增菌液中接种的单核白细胞增 多症李氏杆菌。其敏感性可达lO4个／ml，比Dot— ELISA约高 10—100倍。不与沙门氏菌、小肠结肠 耶氏菌、蜡样芽孢杆菌和副溶血弧菌发生交叉反 应。在24h内可 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 结果，比常规法快4—5d。 裴标，刘玉娥等 (2001年)采用ELISA等方 法对嗜碱耐盐性奇异变形杆菌的生物学特征及致 病力进行病原学鉴定及毒力试验。 此外，鱼虾等水产品中哈氏弧菌和乳制品中霉 菌的ELISA检测也有报道[12]。 2．2 真菌毒素的检测 刘滨磊等H j(1990年)继李秀芳等(1987年)建 立反向直接竞争 ELISA法测定黄曲霉毒素 B (AFB1)之后，又建立了直接竞争 ELISA、间接竞争 ELISA及生物素一亲合素 EusA(BA一Ⅱ A)三种 检测食品中黄曲霉毒素B，的方法。并将此四种方 法进行了比较。另外，将ELISA方法与其它AFB， 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．4 检测方法(薄层层析法TLC、放射免疫分析法RIA、高 效液相色谱法Ⅲ ：)进行了对比研究。结果表明直 接竞争ELISA及间接竞争KIJ~qA具有灵敏、特异、简 便、快速、安全、价廉等特点，适合在我国基层推广应 用。路戈等n j(1996年)利用抗AFBl的单克隆抗体 建立了检测食品(玉米、花生、小麦、大米、植物油)中 AFB 的EIJSA间接竞争法。该方法最低检出浓度 为0。ohc／g，敏感范围为0．2—50ng／g，平均回收率为 83．0—110．3％，精密度为2．0 24．3％。用该法测定 了分布于淮河以北地区的1455份样品，并对25份植 物油样品用TIC和 ElJSA两种方法进行了对比测 定。结果表明，在方法灵敏度下(5ng／g)TLC均无 AFBl检出，而ELLSA法AFBl检出率为96％，ELISA 法的检测灵敏度远高于 TIE法。黄薇等[15J(20o=2 年)运用ELISA并使用专用试剂盒对292份样品进 行了黄曲霉素B，的检验，并与薄层法进行了比较 结果表明：回收率为 72％ 一95％，变异系数为 2．76％，与薄层法相比，该法快速、简便、灵敏、安 全。 用酶联免疫吸附法检测食品中赭曲霉毒素A 的方法，也有综述性介绍【16J。 2．3 食品介导的病毒的检测 EIJSA方法一直被用于食品从业人员的甲肝、 乙肝病毒感染情况进行调查[1．17-20]。 黄汉菊，黄振武等【2lj(2001年)采用间接酶联 免疫吸附法对四川省克山病病区3O例潜、慢型克 山病患者血清中 CoxBl—6．-I 和 c 卜 一I 进行检测，了解柯萨奇 B组病毒(CoxB)感染与克 山病的相关关系。表明病区潜、慢型克山病患者有 CoxB感染存在。 应用 EIJSA方法，可将无明显临床症状的海绵 状病毒(BSE)感染动物可被检出，经对朊蛋白 Westem印迹法检测牛及羊朊病毒蛋白的分析，证 明该方法是有效的。我国已完成了禽流感流行株 的分离和鉴定、合流感重组核蛋白诊断抗原的研制 及应用，建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术，已 形成试剂盒生产能力 6。 ELISA法除了在上述食品微生物检测中发挥 重要作用外，已有用于有益微生物的检测的报道， 如采用间接 ELISA法进行双歧杆菌制剂产品的品 质监测【7l。 3 结语 自从上世纪60、70年代 ELISA技术建立以来， 无论是该方法本身的改进方面，还是其应用领域的 拓展方面都有了很大的进步，包括试剂的灵敏性、 稳定性和通用性的增强，自动检测仪器的开发，以 及与其它技术的联用等。在食品微生物检测要求 简捷、灵敏和微量化的情况下，EusA技术较之其 它方法显示了极大的优势。但同时它也不可避免 地存在着一些缺陷，如存在交叉反应，对试剂的选 择性高，难于同时分析多种成分等。随着有关研究 和探索的不断深入，可以相信EusA技术在食品微 生物检测中将会发挥更为重要的作用。 参考文献 1．程知义，周佳敏编著．微生物快速诊检新技术[M]．上海：上 海科学技术文献出版社．1984 2．王兰兰主编．临床免疫学和免疫检验[M]．北京：人民卫生出 版社．2OO3 3．朱慧莉，黎锡流等．酶联免疫吸附法及其在食品分析中的应 用[J]．食品工业科技．2001，22(2)：80—82 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105页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2似 No．4 的黄曲雷毒素 B】致畸性极大降低。该酶据认为是 通过打开双呋喃环破坏黄曲霉毒素，这同碱法脱毒 的原理是不一样[22]。宋艳萍等对固定化真菌解毒 酶对花生油中AFB 的去除作用进行研究，证明酶 法解毒是一种安全、高效的解毒方法，对食品无污 染、有高度的选择性，且不影响食品的营养物 质[引。 小结 酶制剂产业是当今中国最具发展潜力的新兴 产业之一，随着基因工程、细胞固定化技术等的发 展，酶工程技术在食品中将有着更广阔的应用前 景。今后重点加强对已经获得小试和中试成果的 酶工程技术工业实用化研究。加速推广酶法生产 技术，完善酶反应器结构，提高企业生产能力，创造 更多的效益。 参考文献 1．张红印，郑晓冬，席琦芳等．酶技术及其在食品工业中的应 用[J]．粮油加工与食品机械，2002(6)：31—33． 2．何社强．固定化酶法生产蔗果低聚糖糖浆技术的探讨[J]．食 品科学，2003，24(2)：82—85． 3．王运吉，张苓花，张传明．固定化胞内脂肪酶选择性水解鱼 油[J]．食品工业科技，2003，24(1)：30—33． 4．刘学文，王文贤，冉旭等．嫩化性牛肉干的研究开发[J]．食品 科学，2002，23(3)106—108 5．梅丛笑，方元超，赵晋府．提高绿茶饮料风味的途径[J]．饮料 工业，20O0，(3)4—8． 6．刘志强，王珍辉．酶法脱除大豆乳腥味因子研究[J]．食品工 业科技，2003，24(5)：17 18． 7．陆晓滨，耿建华，李敬龙等．中性蛋白酶对抑制韧性饼干自 然断裂的影响[J]．食品工业科技，2003，24(3)：19 21． 8．张龙，刘景顺，刘艳．食品添加剂在专用粉中应用[J]．粮食与 油脂，2002，(4)：43—44． 9．杨文鸽，黄晓春，庄荣玉等．三角帆蚌(Hgriopsis aⅡningin)肉 酶解工艺的研究[J]．食品与发酵工业，2O03，29(1)：90—92． 10．黄志勇，赖海涛，许伟雄等．酶法提取烤鳗下脚料中水解动 物蛋白的研究[J]．食品科学，2002，23(10)：76—78． 11．封雯瑞，封雯娟．酶制剂的应用与肉类加工副产品附加值 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