甜菊糖的酶法改性

《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．1 甜菊糖的酶法改性 朱海霞 郑建仙 (华南理工大学食品与生物工程学院，广州 510640) 摘要：甜菊糖是一种天然的强力甜味剂，它的二种组分——甜菊苷和甜菊双糖 C苷有苦味和不愉快的后味， 会显著影响甜菊糖的味质。通过酶改性法在甜菊苷、甜菊双糖 c苷中引入一些糖基，可以改善甜质。目前酶改 性甜菊糖的方法主要有：环糊精葡糖基转移酶法、B一呋喃果糖苷酶法、半乳糖苷酶法和微生物糖基化法。本论 文对这几种酶改性方法作一详细介绍。 关键词：甜菊糖，环糊精葡糖基转移酶，B一呋喃果糖苷酶，半乳糖苷酶 Enzymatic Modification of Stevia Sugar (Institute of Food&Bio—engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640) Abammt：Stevia sugar is all intense sweetener，and its two constitutents，stevioside and rebaudioside C have s0me bitterness and unpleasant aftertastewhich greatly affectthe sweetn~ ．Enzymaticmodificationsintroduce$on'le new su lr groupstothem， and then improve the taste．To date，the methods includes enzymatic l'o．~actions with cyclodextrin ducm10虹j|Il _erase，p—fxucto— fumosidase，galactosidase，or by microorganism directly．Here the four methods ale introduced． Key words：Stevia sugar，Cyclodextrin ucan0缸aII rase，p—Fmctofurnosidase，Galactosidase 甜菊糖是从甜叶菊(Stev／a rebaudiana)的叶子 中提取的含8种成分的双萜糖苷的混合物，是一种 天然的强力甜味剂，各组分结构式如图1。各种成 分的含量、口感和甜度各不相同，其中甜菊苷、甜菊 双糖 A苷、甜菊双糖 c苷的含量较高，共占9o％以 上。甜菊双糖 A苷甜度高，甜味特性也与蔗糖相 接近，是理想的甜味成分，而甜菊苷和甜菊双糖 c 苷二者约占甜菊糖的 80％，均有一定的苦味和不 愉快的后味，严重影响了甜叶菊糖的味质。因此， 人们进行了大量的研究以改善甜菊糖的甜味特性。 利用酶法或发酵法在甜菊苷、甜菊双糖 c苷中引 入一些新的糖分子，得到的衍生物的甜味特性有较 大的改善，目前这类方法主要可分为环糊精葡糖基 转移酶法(CGTase法)、8一呋喃果糖苷酶法(FFase 法)、半乳糖苷酶法和微生物糖基化法等。 R广-- OOC 0 —— 19 l8 17 CH 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．1 注：*，不是甜菊糖组成，经甜菊苷部分酶水解得到； G=吡喃葡糖基；rham=吡喃鼠李糖基；H=氢原子 图 1 甜菊糖组成的化学结构 1．1 均匀反应体系 1 环糊精葡糖基转移酶法 CGTase能将淀粉或环糊精的葡糖基经转葡糖 苷作用转移给其它糖元，因此可用它催化淀粉或环 状糊精在甜菊苷的糖基上引入新糖元。以淀粉为底 物的转葡糖基反应分两步进行：先由淀粉合成环糊 精；然后从环糊精转移葡糖基至受体物质。该反应 可以选择可溶性淀粉和非水溶性淀粉作为反应底 物，分别对应为均匀反应体系和非均匀反应体系。 0H 将甜菊苷、可溶淀粉和 Baci／／m ma(~／'o2／$的 CGTase前后分别在 40℃、28℃乙酸盐缓冲液中保 持 8h和 10h，然后分离得到多种转葡糖基组分(结 构如图2)，经分析知：主要转葡糖基产物中 1一la 和 1一lb是单葡糖基转化产物；1—2a、1—2b和 1 — 2c是双葡糖基转化产物；1—3a、1—3b、1—3c和 1—3d是三葡糖基转化产物；四葡糖基转化物的得 率非常低。 图2 CGTase酶转化糖基化产物结构 各组分浓度为 0．025％(组分 2、1一la、1—2a 浓度为 0．02％)时的甜度与浓度为 4％的蔗糖的甜 度相近。对各组分的味质评定结果如 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1所示。 1一la(m：n=3：1)1—2a(m：n=4：1)分别是 13位上 的单葡糖基和双葡糖基化产物，甜度及口感都有明 显改善，是产物中甜味特性最好的组分。其它产物 的甜度比甜菊苷低，在 13一位的三葡糖基化产物 [1—3a(m：n=5：1)]的甜度明显下降，但 I：1感比甜 菊苷均有不同程度的改善，但比 1一la和 1—2a 差。1—3a比甜菊双糖 A苷的甜质好，但也有感官 鉴评人员认为有后味。 55 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．1 表 l CGTase酶转化糖基化产物口感特征 改善一 味质 一变差 参照物质 RA(×210；3：1) S(×16o；2：1) 糖基化产物 l一1a(x180，3：1；鲜味) 1—2a(×205；4：1；鲜味) 1—3a(×11715：1；后味) 1—3d(×121；2：4：fresh taste) 1—1b(×133；2：2；后苦味) 1—2b(×136；3：2；余涩味) 1—3c(×150；3：3；余涩味) 1—2e(×136；2：3；后味) 1—3b(×146；4：2；苦味) 注：( )，相对于蔗糖的甜度；m：n，在 13位(m)和 19位(n)葡糖基数之比；El 感特征 对甜叶悬钩子苷(Rubusoside)进行 1，4一a一葡 糖基化的研究发现，在 13一位引入 2个葡糖基后 甜味特性明显改善，而在 l9位上引入葡糖基则使 甜味特性变差。甜菊醇双苷经 CGTase催化在 13一 位引入葡糖基，其 19一位由半乳糖酯键保护，结果 发现增加 1或2个葡糖基会使甜度有明显增加，但 增加更多葡糖基，甜度和口感都变差。 有研究者用葡糖基转移酶 GT一1酶(此酶性 能与环糊精葡糖基酶基本相似)催化甜菊糖改性， 发现该酶不能转化葡萄糖、蔗糖，对麦芽糖有一定 程度的转化，这说明它只对a一1，4糖苷键起作用。 将该酶加至甜菊糖和可溶性淀粉的混合体系中，产 物为甜菊糖分子上以0t一1，4糖苷键连接上麦芽糖 或葡萄糖基。 用球形纤维素弱阴离子交换剂固定化 GT一1 对甜菊糖进行转化。研究发现，固定化酶催化 S苷 的转化效率与游离酶相差不明显，重复使用 8次后 活力下降较少，说明固定化效果较好。该固定化系 统的最优反应条件为：55℃，淀粉与甜菊糖比例为 1：1，振荡速率较大(200r／min)时可改善物质扩散， 从而增大产率。 1．2 非均匀反应体系 以可溶性淀粉或环糊精作为葡糖基供体的均 匀酶反应体系中，葡糖基供体、受体均在溶液中，因 此产物分离困难，并且反应生成大量非 目的还原 糖。若以不溶的原淀粉为葡糖基供体，利用残留淀 粉的不溶性可以简化产物分离纯化工序，但原淀粉 具有紧密的晶体结构，因此转葡糖基反应速率和得 率都很低。对原淀粉经挤压膨化处理后能以溶胀 状态悬浮在水中，对该非均匀酶反应体系和传统反 应体系进行比较，见图3。 由图可以看出，挤压膨胀淀粉和液化淀粉的初 始反应速率差别不大，但挤压膨胀淀粉的转葡糖基 56 反应上升更快，24h后得率达 0．78，比液化淀粉 (0．68)高。原淀粉的转葡糖基反应很慢，这说明 CGTase不能有效地进攻原淀粉的晶体结构。 图4所示为采用不同反应体系中，可经离心分 离的淀粉量及残留还原糖量。反应24h后，挤压膨 胀淀粉体系中积累的还原糖量只有 0．34．g／L，而液 化淀粉反应体系中该值为 7．84 L。这是因为 CG． Tase催化挤压膨胀淀粉表面的非还原性端，因此还 原糖代表的低聚麦芽糖的量较小。 褥 糊 嚣 ：I暮 黎 1．0 O．8 0．6 O．2 O．0 0 6 l2 l8 反应时间(h) 图 3 不同反应体系的甜菊苷转糖苷反应 (△)、(o)、(口)分别表示以挤压膨胀淀粉、 液化淀粉、原淀粉为葡糖基供体； 反应条件：50 L淀粉，20g／L甜菊苷，900U -彻s的环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)／g淀粉， pH6．0，50℃，200rpm，反应时间24h 3 、一 ， 蠖 嚣 反应时间(h) 图 4 不同体系的甜菊苷转糖苷反应过程中。 可经离心分离的淀粉■及残留还原糖■ (o)、(口)分别表示用挤压膨胀淀粉为糖基供体 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．1 时产生的可经离心分离的淀粉量及残留还原糖浓度； (●)、(●)分别表示用液化淀粉为糖基供体时的 相应结果；反应条件同图3 由于挤压膨胀淀粉以悬浮状态存在在反应混 合体 系 中，因此大 多数残 留淀粉 可通 过离 心 (3000g，lOmin)得到分离，而传统体系中残留液化 淀粉很难分离。因此，非均匀反应体系中转葡糖基 产物的分离纯化过程会明显简化。 2 P一呋喃果糖苷酶法 用J3一呋喃果糖苷酶在甜菊双糖 A苷(RA)的 19一位所连葡糖基上引入果糖基后，甜味特性的变 化见表2。如用细菌 Microbacterium sp．H一1的 — FFase在 pH6．5，40~C条件催化蔗糖和甜菊双糖 A 苷反应 2h，得到 RA—F，果糖基连接在 19一O— 一葡糖 基的 6一OH上。 表 2 FFase催化转糖基反应产物的昧质 注：a，为对蔗糖的相对甜度；b，商品样； 5，非常好；4，很好；3，好；2，一般；1，差。下同 该反应中，糖苷酶催化转糖基反应的得率，主 要由糖基受体、供体、酶浓度和反应时间决定。表 3和图 5分别表示 M／crobacter／um sp．H一1的 — FFase催化 RA转糖苷作用时，RA浓度和反应时间 对其转化结果的影响。受体RA浓度较低时，RA— F转化得率较高；RA浓度较大时，RA—F产量下 降。RA—F最大产量在反应开始不久得到，延长 反应时间，由于 RA—F发生酶水解使得率下降。 在 RA 0．025mol／L，反应 1h达到最大转化率 82％； 当 RA浓度 0．5mol／L，反应 21h，转化率为 19％。 表 3 RA浓度和反应时间对 RA—F转化得率的影响 图 5 RA的转化情况 用 Arthrobacter sp．K一1的 J3一FFase，在 4o℃， pH6．5，催化蔗糖和甜菊苷 (S)或甜叶悬钩子苷 (RU)的混合体系进行转糖苷反应 2h，对产物果糖 基甜菊苷(S—F)和果糖基甜叶悬钩子苷(RU—F) 分析发现，果糖基以 一2，6糖苷键连接至底物 19 一 羧基相连的葡糖基上。产物的味质变化见表 4， 可以发现s—F的味质与阿斯巴甜相当。 表 4 FFase催化转糖基反应产物的昧质 该转糖苷反应中，底物 S或 RU浓度及反应时 间对转化率的影响与 Microbacterium sp．H一1的 — FFase催化 RA转糖苷反应基本相似。如 RU浓 度较低时，RU—F合成速率较高，RU的转化率(RU — F／RU)在 反 应 初 期 达 到 最 大。RU 浓 度 0．025mol／L~，反应 1h，达到最大转化率 88％。RU 的转化率 随 RU浓度上升而下降，RU浓度 0．5mol／L~，反应 20h，转化率为 19％。S、RU的结 果类似。S浓度 0．025mol／L时，反应 0．5h后转化 率达到 80％。 2．2 反应动力学 FFase催化甜菊苷与蔗糖进行的转糖苷反应生 成 FSte和葡萄糖。该反应双底物、双产物，并且同 时有副反应发生，反应 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 相当复杂。Suzuki等认 为其反应机制为乒乓 BiBi机制(图6)，并对该反应 建立了动力学模型。该反应中，游离酶 E和蔗糖 57 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Fbod Additives 20o4 No．1 Sue反应形成第一个复合物 E·Suc。G然后从 E·Sue释放形成第二个复合物E·Fm，该复合物与 S 反应形成第三个复合物 E·FSte，随后 FSte释放。 在该系统除转果糖基作用外，还同时进行蔗糖水解 和 Fste水解反应。这些水解反应若把水看作第二 底物，则也符合乒乓 BiBi机制，如图6 b和c所示。 根据研究认为 FSte的合成不仅受到 G的抑制，还 受到 F的抑制，因此必须考虑 G和 F的竞争性抑 制作用。 fa) Ste FSte E E‘Suc E‘Fm (b) Suc Glu E E·FSte E·Fru E·Fm ·H 0 E 图 6 各反应的乒乓 BiBi机制示意图 (a)FSte合成反应；(b)蔗糖水解反应；(c)FSte水解反应 3 半乳糖苷酶法 甜叶悬钩子苷(Rubsoside，RU)不是甜菊糖的 组成成分，它是 Rubu,s类植物叶子的主要的甜味成 分，也可经甜菊苷部分酶水解得到，是甜菊苷转化 为甜菊双糖 A苷的中间物质。 对 CGTase催化得到的甜叶悬钩子苷的转糖基 衍生物的甜质和结构关系研究发现，在 13一OH相连 的葡糖基上进行转糖基化，甜度和甜质有明显改 善，而在 19一羧基相连的葡基上进行转糖苷反应， 则甜味和甜质变差，因此需对甜叶悬钩子苷进行选 择性修饰。在 CGTase催化转糖苷反应中，葡糖基 是很好的糖基受体，而半乳糖基则不是。因此用半 乳糖苷酶催化转糖苷反应，将半乳糖基连接至甜叶 悬钩子苷的 19一羧基相连的葡糖基上，再用该产物 58 作为 CGTase催化的底物，这样就可以选择性地在 13一OH相连的葡糖基上进行转糖苷反应。 8一半乳糖苷酶和 a一半乳糖苷酶都能催化转 半乳糖基反应，使半乳糖基占据甜叶悬钩子苷的 19-羧基相连的葡糖基的 CA—OH，从而在 CGTase催 化的转糖苷反应中，葡糖基不能连接到该基团上。 3．1 P一半乳糖苷酶法 环状芽孢杆菌(Bac／／／us circulans)的 B一半乳糖 苷酶催化乳糖、甜叶悬钩子苷的转半乳糖苷反应的 产物见表 5，其中 RGal一1中 RGal—la为主要组 分，RGal—lb只有少量。 表 5 环状芽孢杆菌的B一半乳糖苷酶催化甜叶悬钩子 苷转糖苷反应的产物结构 注 ：*：R所 指见 图 1；G表不葡萄糖基 ，Gal表不半乳糖基 ，下同。 反应中，随着底物浓度的增加，RC,al一1，RC,al一2， RGal一3的数量略有增加。RGal一1主要在反应起 始阶段(1．5h)形成，然后迅速下降，下降同时形成 RGal一2，反应结束时有少量RGal一3形成。 较短反应时间内RGal一1的变化情况见表 6。 RGal一1组分的得率为 15．8％(20min)、19．3％ (50min)、19．6％(70rain)和 17．1％(160min)。RC,al一1 的浓度在反应 70min时达到最大。测定反应 中 RGal一1的二种组分 RGal—la和 RGal—lb的含量 发现，在反应 20min、50min时，RGal—la占大部分， 随时间延长，RGal—lb含量增加。 表 6 环状芽孢杆菌的 B一半乳糖苷酶催化转糖苷反应 中的产物变化情况 注：反应条件：乳糖 0．28mol／L，甜叶悬钩子苷：0．14mol／L 不同来源的 8一半乳糖苷酶催化得到的转糖 苷产物不同(表7)。其中 K．／act／s的 8一半乳糖苷 酶不对 RU进行转半乳糖苷反应。环状芽孢杆菌 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．1 的 口一半乳糖苷酶在反应初始阶段优先将半乳糖 基转移至 RU的 19一羧基相连的葡糖基上，得到以 口一1，4糖苷键连接的 RGal—la，然后得到 RGal—lb， RGal—la是 CGTase转糖苷的 良好受体，因为其 19一羧基相连的葡糖基上的 C4一OH已用半乳糖 糖基转移至 19一羧基相连的葡糖基上，得到以口一1，6 糖苷键相连的 RGal一2，该产物不适于用作 CGTase 催化转糖苷反应的糖基受体，因糖基会优先与 13． OH相连的葡糖基连接。米曲霉和P．mu／t／co／or 的 口一半乳糖苷酶催化得到RGal一1、RGal-2、RGal-3和 基保护。而大肠杆菌的口一半乳糖苷酶主要将半乳 另一种未知结构的产物，但得率均很低。 表 7 不同来源的 p一半乳糖苷酶催化甜叶悬钩子苷的转糖苷反应产物 [注] 反应 l5h，乳糖和 R为反应底物 3．2 a一半乳糖苷酶法 M．vinacea的a一半乳糖苷酶可以催化棉子糖 或蜜二糖和甜叶悬钩子苷的混合体系进行转半乳 糖基反应，产物结构见表 8。 表 8 M．vinacea的 a一半乳糖苷酶催化甜叶悬钩子 苷转糖苷反应的产物结构 l 棉子糖浓度对产物的影响 由表9可知，M．vinacea的a一半乳糖苷酶在反 应起始阶段主要形成 RGal—la。RU为 0．1mol／L 时，随棉子糖浓度增加，RGal—la和 R 一2的量 随之增加。但转化率(R 一la和 RGal一2的量与 所加棉子糖的量之比)随棉子糖浓度增加而下降。 RU为 0．2mol／L时，0．4mol／L棉子糖转化得到的 RGal—la和 RGal一2的量大于 1．0mol／L棉子糖。 表 9 棉子糖浓度对 M．1~2ceo,的 a一半乳糖苷酶催化转糖苷反应产物的影响 RGal一1a RGal一2 RGal—la RGal一2 RGal一1a RGal一2 RGal一1a RGal一2 RGal一1a RGal一2 6．2 0．5 10．8 2．1 l1．3 3．O 7．1 1．0 7．O 1．4 产物情况见表 10。半乳糖苷转化物的量随反应时 2 不同来源的a一半羽拥 产物的影响 问增加而增加。大肠杆菌、咖啡豆和A．refl,~a的a 分别用 M．vinacea、A．枷 、大肠杆菌和咖啡 一半乳糖苷酶均产生 RGal—la、RGal一1b，但前二 豆的a一半乳糖苷酶催化棉子糖和R的混合体系， 者的转化量小。 59 " ∽ ¨ 8 5 l 3 6 6 4 4 1 6 4 O 8 l 8 1 6 l 5 O l l 4 l O 1 4 2 O 2 O O O O l O O O ● O 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China d A tives 20o4 No．1 表 lO 不同来源的 a一半乳糖苷酶催化甜叶悬钩子苷 的转糖苷反应产物 注 ：反应 15h 由于 RGal—la、R 一1b和 RGal一2的19一羧 基相连的葡糖基的 CA—OH为游离羟基，因此不适 合作 CGTase催化转糖苷反应的受体。M．v／nacea 的a一半乳糖苷酶催化可选择性地将半乳糖基连 至甜叶悬钩子苷的 13一O一葡糖基上。 4 微生物糖基化法 除上述三种酶催化糖基转化法外，利用微生物 的代谢也可使甜菊苷发生糖基转化。从土壤中分 离得到的放线菌(Actinomycete K一128)在 35~C摇瓶 培养基培养 148h后，过滤培养液，滤液中甜菊苷和 及其转化物的质量比为4：1。 放线菌 K一128培养液的滤液与甜菊苷和凝胶 多糖混合时，不会产生甜菊苷转化物。这说明它不 会分泌能催化甜菊苷转葡糖反应的胞外酶，由此推 断催化生产转化物的 J3一葡糖基转移酶位于菌体 细胞表面，且只催化产生一种转化物，具有高度的 专一性。 参考文献 1．Yuichim Fukunaga，Takeshi Miyata，et ，Enzymic transglucesy· lation product of stevioside：separation and sweemess-evahation，A· g ．Bio1．Chem．，1989，53(6)：1603—1607 2．Hireshi ishikawa，Sumio Kitahiata．d ，Production of stevioside and rubusoside derivative by transfructosylation of fmctahranosi· dase，A ．B／o1．踟 n．，1990，54(12)：3137—3143 3．张杨，陈天红等 ．甜叶菊糖的组分分离与味质改进研究进 展．化学通报，1998，6：11 4．Dong-Chon Park，Tae-Kwon Kim，Yong-Hyun Lee，Characteristics oftransglycesylation reaction of cyclodextrln glu． 【l0缸 [1绷8e het· ero~eneollS enzymel~lctioIl systemusil1g extrusion starch as a gluco- syl donor，Emyn~M／crob．Technd．，1998，22：217—222 5．Hiroshi I~ ~awa，SumioKitahata．d a／，Tmnsfmetesylation of re— baudioside a(a sweet glycoside of stel~ m )with朋 B曲 一 fiuctofuranesidase，踟 n．Phar．Bu／／．，1991，39(8)：2046 一 6．Isao Kusakabe，Satoru Watanabe，et ，Formation of a ti,allgfel- product from stevieside by the cultures of Actinomycete，Biesci． B／otech．Bk~tern．，1992，56(2)：233—237 7．Kentam Suzuki，TakuyaFukumtwa，d ，Kineticmodel of synthe． sis of fmctesyl·stevioside usillg suspended 13-fmctofuranosidase， B／ocbem&a／Eng／neer／ng Journd，20O2．10：207—215 8．史作清，朱伯儒，施荣富等．a一葡萄糖基 一甜菊糖的酶促合 成反应研究(I)．高等学校化学学报 ，1996，17(11)：1800一 l8O3 9．史作清，朱伯儒，施荣富等．a一葡萄糖基 一甜菊糖的酶促合 成反应研究(Ⅱ)．应用化学，1996，13(6)：24～27 10．Sumio Kitahata，Hiroshi Ishikawa，Take,hi Miya~a，d a／．，Pr(Kluc． tion ofRubusosideDerivatives byTransgalactesylationofVarious p — Galactesidase，A ．B／o／．踟 n．，l989，53(11)：2923～ 2928 11．SLimioKitahata，Hireshi Ishlkawa，Takedfi Miyata，d ．，Production of Rubuseside De rivatives by Tran~,alactesylation of Various口一 Galactosidase， ．Bio1． ．，1989，53(11)：2929～2934 12．Muchsin Darise，K朗ji Mizutani，Ryoji Kasai，d ．，Enzymic Transghcosylation of Rubuseside and the Strucatm-Sweetness Re— lationship of Steviol·Bisglycosides， ．B／o1．Chem．，1984，48 (1O)：2483～2488 (上接 62页) 3 结论 抗氧化剂v 可有效地防止红曲红色素中红色 素的光褪色。 参考文献 1．谢珍珍 ，李健英．红曲色素稳定性研究[J]．食品科学，1994， 175(7)：l5一l7． 2．周洁，谢晓琼，张金彪 ．不同溶解性红曲红色素的稳定性 比 较[J]．福建化工，1997，4：25—27． 3．赖建平，罗军，古卓鑫．红曲色素稳定性探讨[J]．广州大学学 报，1999，13(4)：56—60． 4．陈家文．水溶性红曲色素工业性实验研究[J]．食品与发酵工 业，1999，26(2)：20—24． 5．Fabre．C．E．，Santerre．．A．L．．Loret．M．O ere．Production and Food application of the red pigments of m0flascus tuber[J]．J． Food．sci．1993，58(5)：1099一l102． 6．Blanc．P．J．． Loret M．O．． Santerre A．L．etc． Pigments of Monescus[Jj．J．Food Sci，1994，59：862—865． 7．曹瑾编．光化学概论[M]．北京：高等教育版社，1985：4． 维普资讯 http://www.cqvip.com